胡雪純，許海燕

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005)

女性生殖系統(tǒng)(female reproductive system, FRS)包括卵巢、輸卵管、子宮、陰道和外生殖器。FRS相關(guān)疾病主要包括生殖系統(tǒng)感染、多囊卵巢綜合征、卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)、 子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse, POP)、以及癌癥等，這些疾病對(duì)女性的健康和生活質(zhì)量有重要影響。根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，近年來FRS相關(guān)疾病的發(fā)病比例正在不斷擴(kuò)大，并呈現(xiàn)出年輕化的發(fā)展趨勢(shì)。在這些疾病的治療過程中，可能需要切除部分或全部生殖系統(tǒng)器官，與此同時(shí)，術(shù)后黏連造成的二次傷害也會(huì)導(dǎo)致FRS功能喪失。盡管激素治療、組織冷凍和體外受精技術(shù)的發(fā)展使很多FRS疾病的相關(guān)癥狀得以控制，這些技術(shù)并不能使異常組織的結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)正常。由于FRS具有復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)和生理功能，會(huì)隨生理周期和年齡增長(zhǎng)而發(fā)生較大的變化，因此實(shí)現(xiàn)對(duì)FRS功能的恢復(fù)及器官置換面臨很大的挑戰(zhàn)。近年來，基于納米技術(shù)的組織工程支架材料在FRS相關(guān)疾病的治療和引導(dǎo)器官再生方面獲得了廣泛的關(guān)注。

1 組織工程支架的構(gòu)建方法

組織工程是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理與技術(shù)，研究和研發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后修復(fù)的功能和形態(tài)生物替代物的多學(xué)科融合與交叉的學(xué)科，其構(gòu)成要素主要包括種子細(xì)胞、生物材料支架、動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件或體內(nèi)生理環(huán)境。選擇合適的種子細(xì)胞是構(gòu)建組織工程復(fù)合物最先考慮的問題，目前已有多種干細(xì)胞、原代體細(xì)胞和細(xì)胞系被應(yīng)用于FRS再生中(表1)。干細(xì)胞因其多向分化潛能而成為種子細(xì)胞的上游。雖然胚胎干細(xì)胞具有發(fā)育全能性，但因具有免疫原性和倫理相關(guān)問題，而被更多地應(yīng)用于建立體外模型，研究組織間相互作用。成體干細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cell, ADSC)和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，因具有多向分化潛能也被廣泛用于組織工程中。在絕經(jīng)后女性子宮內(nèi)膜中仍可獲取具有再生能力的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(endometrial mesenchymal stem cell, eMSC)，來源廣泛且具有免疫調(diào)節(jié)能力，為FRS組織再生提供了新的選擇[1]。用作種子細(xì)胞的體細(xì)胞通常是目標(biāo)器官的構(gòu)成細(xì)胞，與再生器官的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。例如，卵泡顆粒細(xì)胞(granulosa cell, GC)和卵泡膜細(xì)胞(theca cell, TC)不僅能維持卵泡結(jié)構(gòu)正常，還直接構(gòu)成卵母細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境，調(diào)控卵泡發(fā)育[2]。使用體細(xì)胞可以避免干細(xì)胞植入后分化形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，但是體細(xì)胞的再生能力較弱，限制了其使用范圍。此外，從功能異常器官中分離得到的體細(xì)胞是否仍具有正常生理功能也需要考慮。有研究通過對(duì)POP患者癥狀分級(jí)，并結(jié)合是否絕經(jīng)、激素水平等客觀指標(biāo)對(duì)人陰道成纖維細(xì)胞(human vaginal fibroblast, HVF)的功能進(jìn)行評(píng)估，判斷其是否適用于自體移植[3]。針對(duì)這一問題，異位功能正常的細(xì)胞也常被用作種子細(xì)胞，如使用口腔黏膜成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分別代替陰道成纖維細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞[4-5]。

用于FRS再生的材料主要包括脫細(xì)胞支架材料以及多種天然材料和合成材料，例如膠原蛋白、透明質(zhì)酸、聚氨酯、聚乙二醇及其衍生物等。選擇合適的生物材料是成功進(jìn)行FRS再生的先決條件[26]。理想的生物材料應(yīng)具有良好的生物相容性、仿生微結(jié)構(gòu)和與靶組織匹配的機(jī)械性能[27]。植入材料的微觀結(jié)構(gòu)通過影響再生部位的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)而引導(dǎo)組織再生。脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)(decellularized extracellular matrix, dECM, 簡(jiǎn)稱脫細(xì)胞基質(zhì))來源于細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，具有良好的生物相容性和三維結(jié)構(gòu)。不同的制備方法會(huì)影響dECM的構(gòu)成，從而影響細(xì)胞對(duì)材料的響應(yīng)過程和材料植入后引導(dǎo)組織再生的速度[28]。Miki等將具有完整子宮內(nèi)膜-肌層-外膜結(jié)構(gòu)的dECM材料，按照與天然組織結(jié)構(gòu)同向(即dECM內(nèi)膜面朝內(nèi))或反向(即內(nèi)膜面朝外)植入子宮缺損部位，結(jié)果表明，反向植入dECM的再生組織中出現(xiàn)腺體異位、平滑肌層異常的現(xiàn)象顯著高于同向植入組[29]。Mukherjee等利用靜電紡絲技術(shù)制備與陰道微結(jié)構(gòu)類似的微孔支架，可以對(duì)陰道結(jié)締組織進(jìn)行有效重塑[30]。合適的機(jī)械性能也是理想的生物材料所應(yīng)具備的條件之一。植入與組織機(jī)械性能不匹配的材料，會(huì)導(dǎo)致植入部位組織糜爛、局部感染等不良反應(yīng)。聚苯胺(polypropylene, PPL)材料早期被用于陰道薄弱組織的重建，但由于機(jī)械性能遠(yuǎn)強(qiáng)于周圍組織，植入后常導(dǎo)致陰道感染和慢性鈍痛，同時(shí)在PPL支架周圍常形成瘢痕組織[31]。機(jī)械性能較差的生物材料則需通過改變材料交聯(lián)方式，或與多種材料進(jìn)行混合等方法進(jìn)行優(yōu)化[32]。

表1 用于女性生殖系統(tǒng)再生的種子細(xì)胞Table 1 Seed cells for female reproductive system regeneration

2 組織工程技術(shù)在女性生殖系統(tǒng)組織再生中的應(yīng)用研究

2.1 卵巢早衰

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是一種常見的內(nèi)分泌疾病，可導(dǎo)致不孕不育以及潮熱、骨質(zhì)疏松等并發(fā)癥。POF的治療方法主要為激素替代療法(hormone replacement therapy, HRT)，使用雌激素單獨(dú)或與黃體酮聯(lián)合進(jìn)行治療。HRT雖然可以緩解POF的一些癥狀，但它只是體外補(bǔ)充卵巢分泌的激素，并不能使卵巢組織自身分泌激素的功能恢復(fù)正常，還可能增加患乳腺癌和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

有研究組使用生物材料來封裝細(xì)胞，并構(gòu)建成組織工程支架，以模擬卵巢組織，再利用細(xì)胞分泌的分子混合物對(duì)POF進(jìn)行治療。例如，Sittadjody等使用多聚鳥氨酸制備多室細(xì)胞微球以模仿卵泡的組織結(jié)構(gòu)。先將卵泡顆粒細(xì)胞(GC)包裹在芯層，再將卵泡膜細(xì)胞(TC)包裹在殼層，細(xì)胞微球產(chǎn)生的雌性激素可以調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸，但其分泌的雌激素含量遠(yuǎn)低于正常水平且難以持續(xù)[15]。芳香化酶是體內(nèi)合成雌激素的限速酶，通過向上述細(xì)胞微球中引入分泌芳香化酶的BMSC，可以提高細(xì)胞微球分泌雌激素的能力[6]。Yoon等利用擬胚體形成培養(yǎng)板和基質(zhì)膠制備了由內(nèi)向外依次為GC-基質(zhì)膠-TC的細(xì)胞微球，并用明膠和聚(N-異丙基丙烯酰胺)納米纖維制備血管化水凝膠，用以搭載細(xì)胞微球，并將其植入到卵巢切除大鼠的缺血后肢中。結(jié)果表明，從水凝膠釋放的雌性激素可以幫助大鼠的內(nèi)分泌功能恢復(fù)正常，同時(shí)該方法未出現(xiàn)HRT治療的不良反應(yīng)[33]。此外，也有研究人員利用生物材料的黏附作用，使用生物材料搭載干細(xì)胞原位注射在卵巢組織中，通過引導(dǎo)卵巢組織再生治療POF[7]。

2.2 卵泡體外培養(yǎng)

卵子冷凍技術(shù)的發(fā)展為保存女性生育能力提供了可能，但這一技術(shù)并不適用于有排卵障礙、需接受抗腫瘤治療和不能接受激素刺激的女性。卵泡由卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞(GC)和膜細(xì)胞(TC)構(gòu)成，是卵巢的基本功能單位。由于卵泡結(jié)構(gòu)是卵母細(xì)胞成熟的必需結(jié)構(gòu)，同時(shí)卵巢內(nèi)含有大量的初級(jí)卵泡，因此，發(fā)展卵泡體外成熟方法對(duì)于生育能力的保存十分重要。卵泡的生長(zhǎng)和成熟是一個(gè)復(fù)雜的過程，在早期需要卵巢微環(huán)境、旁分泌和自分泌的交叉調(diào)控，后期還需要受下丘腦-垂體-卵巢軸分泌的促性腺激素的調(diào)控。在卵泡成熟過程中，卵泡體積會(huì)增大600倍左右，同時(shí)卵泡周圍組織空間結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化。因此制造可以促進(jìn)卵泡成熟的人工環(huán)境仍具有較大挑戰(zhàn)。

使用生物材料包封卵泡可以對(duì)卵泡進(jìn)行體外培養(yǎng)，同時(shí)提高經(jīng)冷凍、解凍和再移植后存活卵泡的數(shù)量與活力[34-35]。Shikanov等設(shè)計(jì)制備了具有分子內(nèi)自交聯(lián)、膜敏感多肽交聯(lián)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)敏感多肽交聯(lián)鍵的多臂聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)水凝膠，用于卵泡的體外培養(yǎng)。在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，卵泡通過降解水凝膠中的多肽交聯(lián)位點(diǎn)導(dǎo)致水凝膠發(fā)生局部降解，既為卵泡的成熟提供空間，還可以避免水凝膠的整體塌陷[36]。冷凍干燥的海藻酸鈉水凝膠具有直徑為80～100 μm且貫通性良好的微孔結(jié)構(gòu)，被廣泛用于卵泡的體外培養(yǎng)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(bone morphogenetic protein-4, BMP-4)能促進(jìn)原始卵泡向初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)變，并促進(jìn)初級(jí)卵泡的生長(zhǎng)。Felder等模擬BMP-4與硫酸乙酰肝素的自然結(jié)合，制備了可以與BMP-4結(jié)合的海藻酸鈉硫酸酯水凝膠，使用該水凝膠包載卵巢基質(zhì)細(xì)胞和卵泡[37]。在體外共培養(yǎng)21天后，將卵泡水凝膠復(fù)合物移植進(jìn)卵巢切除小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，卵泡功能正常且小鼠血清和陰道中雌激素水平顯著升高。Healy等使用柔軟的明膠包裹GC作為內(nèi)層，以較硬的海藻酸鈉包裹TC作為外層，結(jié)合微流控技術(shù)構(gòu)建了人工卵泡結(jié)構(gòu)。該人工卵泡具有相對(duì)完整的內(nèi)分泌功能，可以培養(yǎng)從初級(jí)卵泡中分離出的卵母細(xì)胞，并維持卵母細(xì)胞的大小和細(xì)胞間隔[38]。

2.3 子宮宮腔黏連

宮腔黏連(intrauterine adhesions, IUA)是由于破壞性刮宮或反復(fù)的子宮內(nèi)膜炎導(dǎo)致子宮內(nèi)膜被破壞的疾病。IUA是繼發(fā)性不孕的主要因素之一，目前主要治療方法是通過物理方法對(duì)黏連部位進(jìn)行分離和阻隔防止再次黏連，但是難以進(jìn)一步促進(jìn)損傷子宮內(nèi)膜進(jìn)行修復(fù)。Cai等制備了載有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的液滴微流控多孔支架治療IUA[39]。該支架具有良好的可壓縮性，可通過宮頸遞送進(jìn)子宮內(nèi)，具有良好的抗粘附作用。通過微流控技術(shù)制備的支架具有更高的載藥量，支架搭載的bFGF可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜損傷部位的組織修復(fù)。利用搭載干細(xì)胞的組織工程復(fù)合物對(duì)子宮內(nèi)膜進(jìn)行修復(fù)，正在發(fā)展成為IUA治療的新策略。聚葵二酸甘油酯(poly(glycerol sebacate), PGS)具有與子宮組織相似的機(jī)械性能。PGS搭載BMSC不僅可以延長(zhǎng)BMSC在子宮損傷部位的滯留時(shí)間，還可以為BMSC向子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cell, ESC)方向分化提供適宜的微環(huán)境[40]。干細(xì)胞組織工程復(fù)合物雖然可以有效治療IUA，但面臨著植入率低、腫瘤形成、儲(chǔ)存和運(yùn)輸不便的限制。干細(xì)胞的分泌物包括多種細(xì)胞因子和趨化因子，在組織再生中有重要的作用。與注射活細(xì)胞相比，使用干細(xì)胞的分泌物安全性更高。在體外實(shí)驗(yàn)中，干細(xì)胞分泌物具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。Liu等使用改性透明質(zhì)酸水凝膠包載干細(xì)胞分泌物，并將水凝膠經(jīng)宮頸遞送進(jìn)子宮，可顯著提高子宮內(nèi)膜厚度、子宮腺數(shù)量和小鼠懷孕率[41]。

2.4 子宮缺損修復(fù)

子宮壁由內(nèi)向外可分為子宮內(nèi)膜、肌層和子宮外膜，子宮壁結(jié)構(gòu)缺損會(huì)嚴(yán)重影響女性的生育能力，而子宮移植技術(shù)需要考慮供體器官短缺和免疫排異反應(yīng)等問題。組織工程在子宮缺損修復(fù)方面顯示出了應(yīng)用潛力。例如，Li等在膠原蛋白上分別連接血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和bFGF，制備具有改善子宮內(nèi)膜和平滑肌再生能力、促進(jìn)血管重建的支架材料修復(fù)缺損子宮[42-43]。Cai等則用絲素蛋白-細(xì)菌纖維素多孔材料包載外源性基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell derived factor-1α, SDF-1α，也稱為CXCL12)，通過激活CXCR4/CXCL12信號(hào)通路招募內(nèi)源性細(xì)胞向損傷部位遷移，尤其是干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)子宮缺損的修復(fù)[44]。但是以上研究均在面積較小的缺陷上進(jìn)行，遠(yuǎn)未達(dá)到臨床子宮缺損和子宮移植所需的面積。在嚙齒類動(dòng)物模型中，使用無細(xì)胞的生物材料支架可以較好地誘導(dǎo)0.5 cm以內(nèi)的缺損組織再生。若缺損尺度超過該范圍，成纖維細(xì)胞的遷移會(huì)占主導(dǎo)，導(dǎo)致材料上膠原過度沉積并形成瘢痕組織[45]。Magalhaes等使用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)涂覆的聚乙醇酸(polyglycolic acid, PGA)微孔支架搭載原代子宮組織細(xì)胞，對(duì)接近全缺損的兔子子宮進(jìn)行修復(fù)，研究結(jié)果表明，負(fù)載細(xì)胞的組織工程復(fù)合物形成了包括子宮內(nèi)膜上皮腺、上皮腔和基質(zhì)層的兩層血管化內(nèi)膜組織，與子宮組織結(jié)構(gòu)相似[46]。

2.5 盆腔器官脫垂

盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse, POP)是由于女性盆腔器官下降導(dǎo)致陰道或子宮突出而引起的器官功能異常疾病。雖然POP引起的致死率極低，但常造成排便異常、壓力性尿失禁、盆腔慢性鈍痛、性生活障礙等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響女性的日?；顒?dòng)和生活質(zhì)量。盡管POP致病因素個(gè)體化差異較大，但共性特征是患者盆底結(jié)締組織的機(jī)械強(qiáng)度顯著降低。POP患者HVF膠原蛋白合成減少，細(xì)胞外MMP-2、MMP-9表達(dá)增強(qiáng)，加速膠原降解，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增強(qiáng)，導(dǎo)致盆底結(jié)締組織結(jié)構(gòu)松弛。

異物反應(yīng)較低且與天然細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)結(jié)構(gòu)相近的組織工程復(fù)合物有望促進(jìn)組織整合與再生。Qin等在甲基丙烯酰明膠(methacrylate gelatin, GelMA)中添加具有抗炎活性和抑制MMP-2、MMP-9活性的天然產(chǎn)物葛根素來引導(dǎo)盆底結(jié)締組織再生[25]。含葛根素的GelMA材料不僅可以減緩結(jié)締組織中ECM的降解速度，還可以降低材料中光敏劑的細(xì)胞毒性。海藻酸鈉是生物3D打印中最常用的材料之一，Paul等通過混合蘆薈水凝膠降低海藻酸鈉的用量，并包載eMSC進(jìn)行生物3D打印制備納米支架。利用蘆薈膠的抗菌和抗氧化活性以及eMSC的免疫調(diào)節(jié)功能，減少材料周圍炎性細(xì)胞的滲透并降低促炎型巨噬細(xì)胞比例，減輕材料植入后的異物反應(yīng)[47]。Mori da Cunha等構(gòu)建了聚碳酸酯超分子聚合物，并使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽(arginine-glycine-aspartic acid, RGD)對(duì)超分子進(jìn)行修飾，用該材料制備的納米纖維支架對(duì)巨噬細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)功能，還可以促進(jìn)新生血管和結(jié)締組織向支架內(nèi)生長(zhǎng)[48]。雌二醇作為一種MMP抑制劑不僅可以促進(jìn)盆底結(jié)締組織中ECM的增加，還可以通過雌激素受體刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管，有研究團(tuán)隊(duì)使用混有雌二醇的聚氨酯靜電紡絲薄膜搭載ADSC治療POP，含有雌二醇的紡絲薄膜抗張強(qiáng)度增強(qiáng)，與盆底結(jié)締組織更吻合[49]。

3 問題與展望

基于納米材料的組織工程技術(shù)為FRS相關(guān)疾病的治療提供了一種新的策略。近年來關(guān)于組織工程在FRS方面的應(yīng)用研究日益增多，但距離臨床應(yīng)用仍有較遠(yuǎn)的路程。受FRS功能特殊性影響，用于FRS再生的材料以dECM和天然材料為主。這類材料雖然具有較好的生物安全性，但其制備過程中的標(biāo)準(zhǔn)化和可重復(fù)性較低，而且異種來源的dECM材料還面臨著免疫排異的風(fēng)險(xiǎn)。此外，已有的研究主要使用嚙齒類動(dòng)物對(duì)所構(gòu)建的組織工程復(fù)合物功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，但是嚙齒類動(dòng)物的FRS在結(jié)構(gòu)和尺寸上與人類相差較遠(yuǎn)。另一個(gè)方面，種子細(xì)胞獲取途徑和倫理問題也給開展研究帶來一定的局限性。當(dāng)前也有大量研究使用人類來源的細(xì)胞，通過構(gòu)建組織工程復(fù)合物，對(duì)FRS進(jìn)行體外建模和分析，研究FRS的動(dòng)態(tài)生理環(huán)境、生殖相關(guān)生理過程、子宮內(nèi)膜異位癥等疾病的發(fā)病機(jī)制，但體外模型與真實(shí)組織器官的差距需要進(jìn)一步縮小。開發(fā)安全的仿生生物材料以代替天然組織結(jié)構(gòu)，同時(shí)選擇可平衡再生能力、功能化和安全性的種子細(xì)胞及適宜的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件是實(shí)現(xiàn)FRS相關(guān)器官再生和重構(gòu)的關(guān)鍵要素，在此方面取得的突破將為女性生殖能力恢復(fù)與保存提供新方法。