陰文奇，張傳明，何平元，王子建，周遠(yuǎn)成，李盛辟

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；2.畜科生物工程有限公司，四川 成都 610299；3.畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610299）

豬偽狂犬病（PR）是由偽狂犬病毒（PRV）所引起的多種家畜和野生動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀的一種高度接觸性傳染病。豬是該病的天然宿主和主要儲(chǔ)存宿主，各個(gè)年齡段的豬群均可感染［1-3］。該病在世界上分布廣泛，并有不斷蔓延擴(kuò)大的趨勢(shì)。疫苗免疫是防控豬偽狂犬病最經(jīng)濟(jì)、有效的方法。目前市場(chǎng)上流通的偽狂犬病疫苗有滅活疫苗和活疫苗。隨著PRV 的基因變異，以Batha-K61 株為首的疫苗毒株對(duì)我國(guó)豬偽狂犬病的預(yù)防能力降低。郭萬(wàn)柱等［4］根據(jù)我國(guó)豬偽狂犬病疫情的流行情況，以野毒Fa 株為親本毒株構(gòu)建了三基因（TK、gE、gI）缺失疫苗SA215 株，該疫苗株具有良好的穩(wěn)定性和安全性［5-6］。該活疫苗的有效期為2～8 ℃保存12 個(gè)月。為研究保存期延長(zhǎng)對(duì)疫苗的影響，本試驗(yàn)將保存期延長(zhǎng)至21 個(gè)月后按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，為臨床使用和后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料 6 批豬偽狂犬病活疫苗樣 品（批 號(hào)：試201906021、試201906022、試201906023、試 201906024、試 201906025、試201906026）由畜科生物工程有限公司生產(chǎn)，每批取樣150 瓶置-15 ℃保存，取150 瓶置2～8 ℃保存。Vero細(xì)胞，由畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定、保管和供應(yīng)。DMEM 購(gòu)自Gibco 公司。新生牛血清購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司。21～28 日齡斷奶健康易感仔豬購(gòu)自成都周邊散養(yǎng)戶。

1.2 不同保存期疫苗病毒含量的測(cè)定 在保存試驗(yàn)前以及-15 ℃和2～8 ℃保存6、12、18、21 個(gè)月時(shí)分別取保存樣品用維持液將疫苗成品稀釋至1 頭份/mL，再作10 倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種6孔板內(nèi)培養(yǎng)形成的致密Vero 細(xì)胞單層1 孔，每孔0.1 mL，37 ℃吸附1 h。再于每孔加入DMEM 液（含甲基纖維素0.5%）2～3 mL，置二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)3～4 日，吸去上清液，用1%結(jié)晶紫、福爾馬林染液染色20 min，棄染色液，計(jì)算蝕斑數(shù)，應(yīng)≥105.0PFU/頭份。

1.3 常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定 分別取-15 ℃和2～8 ℃保存12、18、21 個(gè)月的疫苗，按照《中國(guó)獸藥典》（2015年版）附錄19進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、附錄22進(jìn)行支原體檢驗(yàn)、附錄16 第2 法進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)、附錄11 進(jìn)行剩余水分測(cè)定、附錄7 進(jìn)行真空度檢驗(yàn)。

1.4 鑒別檢驗(yàn) 將疫苗稀釋成104.0PFU/mL，與PRV特異性血清（中和指數(shù)為700～1 000）等量混合，37 ℃中和1 h，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照，分別接種Vero細(xì)胞單層。置二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)3～5日，觀察細(xì)胞病變（CPE）。病毒對(duì)照組應(yīng)出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、融合形成空斑等細(xì)胞病變，中和組不能出現(xiàn)CPE。

1.5 安全性檢驗(yàn) 分別取-15 ℃和2～8 ℃保存12、18、21個(gè)月的疫苗，給2頭20～22日齡健康易感仔豬（PRV 中和抗體效價(jià)≤1∶4）各肌肉注射2頭份，觀察7日并記錄。

1.6 效力檢驗(yàn) 分別取-15 ℃和2～8 ℃保存12、18、21 個(gè)月的疫苗，給4 頭20～22 日齡健康易感仔豬（PRV 中和抗體效價(jià)≤1∶4）各肌肉注射1 頭份。28 日后，連同條件相同的4 頭對(duì)照豬，分別采血，分離血清，測(cè)定血清中和抗體滴度。

2 結(jié)果

2.1 6 批豬偽狂犬病活疫苗（SA215 株）不同保存期的病毒含量檢測(cè)結(jié)果 將6 批成品苗在-15 ℃下保存6、12、18、21 個(gè)月后分別檢測(cè)各批樣品的病毒含量，結(jié)果顯示：18 個(gè)月時(shí)病毒含量下降幅度在0.5～0.7 個(gè)滴度之間，21 個(gè)月時(shí)下降幅度在0.6～0.8 個(gè)滴度之間，但所有批次的病毒含量均遠(yuǎn)高于105.0PFU/頭份的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。詳見表1。

表1 6批成品苗在-15 ℃條件下放置不同時(shí)間后的病毒含量檢測(cè)

將6 批成品苗在2～8 ℃下保存6、12、18、21個(gè)月后分別檢測(cè)各批樣品的病毒含量，結(jié)果顯示：18 個(gè)月時(shí)病毒含量下降幅度在0.5～0.8 個(gè)滴度之間，21 個(gè)月時(shí)下降幅度在0.6～0.9 個(gè)滴度之間，但所有批次的病毒含量均遠(yuǎn)高于105.0PFU/頭份的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。詳見表2。

2.2 6 批成品苗在-15 ℃及2～8 ℃保存12 個(gè)月時(shí)的檢測(cè)結(jié)果 將6 批成品苗分別置-15 ℃和2～8 ℃保存12 個(gè)月，然后進(jìn)行性狀觀測(cè)、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)以及安全、效力、真空度和剩余水分的測(cè)定。結(jié)果顯示所有指標(biāo)均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。詳見表3和表4。

表3 6批成品苗于-15 ℃保存12個(gè)月時(shí)的檢測(cè)結(jié)果

表4 6批成品苗于2～8 ℃保存12個(gè)月時(shí)的檢測(cè)結(jié)果

2.3 6 批成品苗于-15 ℃及2～8 ℃保存18 個(gè)月時(shí)的檢測(cè)結(jié)果 將6 批成品苗分別置-15 ℃和2～8 ℃保存18 個(gè)月，然后進(jìn)行性狀觀測(cè)、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)以及安全、效力、真空度和剩余水分的測(cè)定。結(jié)果顯示：病毒含量均在105.7PFU/頭份以上，免疫抗體均在1∶30 以上，所有指標(biāo)均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。詳見表5和表6。

表5 6批成品苗于-15 ℃保存18個(gè)月時(shí)的檢測(cè)結(jié)果

表6 6批成品苗于2～8 ℃保存18個(gè)月時(shí)的檢測(cè)結(jié)果

2.4 6 批成品苗于-15 ℃及2～8 ℃保存21 個(gè)月時(shí)的檢測(cè)結(jié)果 將6 批成品苗分別置-15 ℃和2～8 ℃保存21 個(gè)月，然后進(jìn)行性狀觀測(cè)、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)以及安全、效力、真空度和剩余水分的測(cè)定。結(jié)果顯示：病毒含量均在105.6PFU/頭份以上，免疫抗體均在1∶30 以上，所有指標(biāo)均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。詳見表7和表8。

表7 6批成品苗于-15 ℃保存21個(gè)月時(shí)的檢測(cè)結(jié)果

表8 6批成品苗于2～8 ℃保存21個(gè)月時(shí)的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

臨床上使用的動(dòng)物活疫苗均以凍干形式生產(chǎn)、保存，近年來(lái)隨著真空冷凍干燥技術(shù)的發(fā)展出現(xiàn)了耐熱保護(hù)劑活疫苗。常規(guī)疫苗通常在-15 ℃保存，而耐熱保護(hù)劑活疫苗則在2～8 ℃保存。本試驗(yàn)使用的疫苗在取得新獸藥證書時(shí)確定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為2～8 ℃保存12 個(gè)月，為研究該疫苗在不同溫度條件下保存的穩(wěn)定性和有效期，本試驗(yàn)以12 個(gè)月有效期為基礎(chǔ)，分別選擇三個(gè)批次的疫苗在-15 ℃和2～8 ℃保存，將保存期延長(zhǎng)至21個(gè)月，并在保存后不同時(shí)間段取樣進(jìn)行疫苗質(zhì)量測(cè)定。試驗(yàn)得出：6 批豬偽狂犬病活疫苗（SA215株）試制產(chǎn)品在-15 ℃和2～8 ℃下保存21 個(gè)月，病毒含量只有輕微下降（0.6～0.8 和0.6～0.9），每頭份病毒含量均在105.6PFU以上，遠(yuǎn)高于國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（105.0PFU/頭份）；免疫抗體水平均高于1∶30；性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)、安全性、效力、剩余水分、真空度等指標(biāo)均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，表明該疫苗在-15 ℃及2～8 ℃兩種溫度條件下保存21 個(gè)月仍然合格。本試驗(yàn)結(jié)果為疫苗的臨床推廣以及后續(xù)新產(chǎn)品的開發(fā)提供了新的依據(jù)。■