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        豬偽狂犬病活疫苗(SA215株)保存條件的研究

        2022-01-20 05:44:02陰文奇張傳明何平元王子建周遠成李盛辟
        四川畜牧獸醫(yī) 2022年1期
        關鍵詞:頭份質量標準狂犬病

        陰文奇,張傳明,何平元,王子建,周遠成,李盛辟

        (1.四川省畜牧科學研究院,四川 成都 610066;2.畜科生物工程有限公司,四川 成都 610299;3.畜禽生物制品四川省重點實驗室,四川 成都 610299)

        豬偽狂犬?。≒R)是由偽狂犬病毒(PRV)所引起的多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的一種高度接觸性傳染病。豬是該病的天然宿主和主要儲存宿主,各個年齡段的豬群均可感染[1-3]。該病在世界上分布廣泛,并有不斷蔓延擴大的趨勢。疫苗免疫是防控豬偽狂犬病最經濟、有效的方法。目前市場上流通的偽狂犬病疫苗有滅活疫苗和活疫苗。隨著PRV 的基因變異,以Batha-K61 株為首的疫苗毒株對我國豬偽狂犬病的預防能力降低。郭萬柱等[4]根據(jù)我國豬偽狂犬病疫情的流行情況,以野毒Fa 株為親本毒株構建了三基因(TK、gE、gI)缺失疫苗SA215 株,該疫苗株具有良好的穩(wěn)定性和安全性[5-6]。該活疫苗的有效期為2~8 ℃保存12 個月。為研究保存期延長對疫苗的影響,本試驗將保存期延長至21 個月后按照質量標準進行檢測,為臨床使用和后續(xù)產品開發(fā)提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 主要試驗材料 6 批豬偽狂犬病活疫苗樣 品(批 號:試201906021、試201906022、試201906023、試 201906024、試 201906025、試201906026)由畜科生物工程有限公司生產,每批取樣150 瓶置-15 ℃保存,取150 瓶置2~8 ℃保存。Vero細胞,由畜禽生物制品四川省重點實驗室鑒定、保管和供應。DMEM 購自Gibco 公司。新生牛血清購自內蒙古金源康生物工程有限公司。21~28 日齡斷奶健康易感仔豬購自成都周邊散養(yǎng)戶。

        1.2 不同保存期疫苗病毒含量的測定 在保存試驗前以及-15 ℃和2~8 ℃保存6、12、18、21 個月時分別取保存樣品用維持液將疫苗成品稀釋至1 頭份/mL,再作10 倍系列稀釋,取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75個稀釋度,每個稀釋度分別接種6孔板內培養(yǎng)形成的致密Vero 細胞單層1 孔,每孔0.1 mL,37 ℃吸附1 h。再于每孔加入DMEM 液(含甲基纖維素0.5%)2~3 mL,置二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)3~4 日,吸去上清液,用1%結晶紫、福爾馬林染液染色20 min,棄染色液,計算蝕斑數(shù),應≥105.0PFU/頭份。

        1.3 常規(guī)檢測指標的測定 分別取-15 ℃和2~8 ℃保存12、18、21 個月的疫苗,按照《中國獸藥典》(2015年版)附錄19進行無菌檢驗、附錄22進行支原體檢驗、附錄16 第2 法進行外源病毒檢驗、附錄11 進行剩余水分測定、附錄7 進行真空度檢驗。

        1.4 鑒別檢驗 將疫苗稀釋成104.0PFU/mL,與PRV特異性血清(中和指數(shù)為700~1 000)等量混合,37 ℃中和1 h,同時設病毒對照,分別接種Vero細胞單層。置二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)3~5日,觀察細胞病變(CPE)。病毒對照組應出現(xiàn)細胞圓縮、融合形成空斑等細胞病變,中和組不能出現(xiàn)CPE。

        1.5 安全性檢驗 分別取-15 ℃和2~8 ℃保存12、18、21個月的疫苗,給2頭20~22日齡健康易感仔豬(PRV 中和抗體效價≤1∶4)各肌肉注射2頭份,觀察7日并記錄。

        1.6 效力檢驗 分別取-15 ℃和2~8 ℃保存12、18、21 個月的疫苗,給4 頭20~22 日齡健康易感仔豬(PRV 中和抗體效價≤1∶4)各肌肉注射1 頭份。28 日后,連同條件相同的4 頭對照豬,分別采血,分離血清,測定血清中和抗體滴度。

        2 結果

        2.1 6 批豬偽狂犬病活疫苗(SA215 株)不同保存期的病毒含量檢測結果 將6 批成品苗在-15 ℃下保存6、12、18、21 個月后分別檢測各批樣品的病毒含量,結果顯示:18 個月時病毒含量下降幅度在0.5~0.7 個滴度之間,21 個月時下降幅度在0.6~0.8 個滴度之間,但所有批次的病毒含量均遠高于105.0PFU/頭份的國家標準。詳見表1。

        表1 6批成品苗在-15 ℃條件下放置不同時間后的病毒含量檢測

        將6 批成品苗在2~8 ℃下保存6、12、18、21個月后分別檢測各批樣品的病毒含量,結果顯示:18 個月時病毒含量下降幅度在0.5~0.8 個滴度之間,21 個月時下降幅度在0.6~0.9 個滴度之間,但所有批次的病毒含量均遠高于105.0PFU/頭份的國家標準。詳見表2。

        2.2 6 批成品苗在-15 ℃及2~8 ℃保存12 個月時的檢測結果 將6 批成品苗分別置-15 ℃和2~8 ℃保存12 個月,然后進行性狀觀測、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗以及安全、效力、真空度和剩余水分的測定。結果顯示所有指標均符合質量標準要求。詳見表3和表4。

        表3 6批成品苗于-15 ℃保存12個月時的檢測結果

        表4 6批成品苗于2~8 ℃保存12個月時的檢測結果

        2.3 6 批成品苗于-15 ℃及2~8 ℃保存18 個月時的檢測結果 將6 批成品苗分別置-15 ℃和2~8 ℃保存18 個月,然后進行性狀觀測、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗以及安全、效力、真空度和剩余水分的測定。結果顯示:病毒含量均在105.7PFU/頭份以上,免疫抗體均在1∶30 以上,所有指標均符合質量標準。詳見表5和表6。

        表5 6批成品苗于-15 ℃保存18個月時的檢測結果

        表6 6批成品苗于2~8 ℃保存18個月時的檢測結果

        2.4 6 批成品苗于-15 ℃及2~8 ℃保存21 個月時的檢測結果 將6 批成品苗分別置-15 ℃和2~8 ℃保存21 個月,然后進行性狀觀測、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗以及安全、效力、真空度和剩余水分的測定。結果顯示:病毒含量均在105.6PFU/頭份以上,免疫抗體均在1∶30 以上,所有指標均符合質量標準。詳見表7和表8。

        表7 6批成品苗于-15 ℃保存21個月時的檢測結果

        表8 6批成品苗于2~8 ℃保存21個月時的檢測結果

        3 結論

        臨床上使用的動物活疫苗均以凍干形式生產、保存,近年來隨著真空冷凍干燥技術的發(fā)展出現(xiàn)了耐熱保護劑活疫苗。常規(guī)疫苗通常在-15 ℃保存,而耐熱保護劑活疫苗則在2~8 ℃保存。本試驗使用的疫苗在取得新獸藥證書時確定的質量標準為2~8 ℃保存12 個月,為研究該疫苗在不同溫度條件下保存的穩(wěn)定性和有效期,本試驗以12 個月有效期為基礎,分別選擇三個批次的疫苗在-15 ℃和2~8 ℃保存,將保存期延長至21個月,并在保存后不同時間段取樣進行疫苗質量測定。試驗得出:6 批豬偽狂犬病活疫苗(SA215株)試制產品在-15 ℃和2~8 ℃下保存21 個月,病毒含量只有輕微下降(0.6~0.8 和0.6~0.9),每頭份病毒含量均在105.6PFU以上,遠高于國家質量標準(105.0PFU/頭份);免疫抗體水平均高于1∶30;性狀、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗、安全性、效力、剩余水分、真空度等指標均符合質量標準,表明該疫苗在-15 ℃及2~8 ℃兩種溫度條件下保存21 個月仍然合格。本試驗結果為疫苗的臨床推廣以及后續(xù)新產品的開發(fā)提供了新的依據(jù)。■

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