薛高峰，王琳源，關(guān)寧，高秀秋

（錦州醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第二醫(yī)院牙周黏膜科；2.附屬第一醫(yī)院腦與脊髓損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121000）

巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要成員之一，在組織修復(fù)和抑制炎癥方面發(fā)揮重要作用。根據(jù)巨噬細(xì)胞在不同細(xì)胞因子作用下的極化特點(diǎn)，可分化為Ml（經(jīng)典活化）型和M2（替代活化）型。巨噬細(xì)胞在干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ），脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）的刺激下極化為Ml型巨噬細(xì)胞［1-3］，可分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6），白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），白細(xì)胞介素-23（interleukin-23，IL-23），白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等炎性細(xì)胞因子［4-5］，參與慢性根尖周炎、慢性牙周炎、炎癥性腸病等炎性疾病的發(fā)病過程［6-8］。抑制M1型巨噬細(xì)胞的極化可減輕組織炎癥程度，促進(jìn)炎癥轉(zhuǎn)歸，維持組織穩(wěn)態(tài)。

全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）又稱視黃酸、維甲酸等，是維生素A類衍生物，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，在免疫細(xì)胞分化、活化和維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定過程中發(fā)揮多種功能，用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種免疫性疾?。?-12］。然而，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于ATRA對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用研究較少。本研究通過體外建立M1型巨噬細(xì)胞極化模型，探討ATRA對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)采用8周齡、質(zhì)量約20 g的SPF級(jí) C57BL/6雌性小鼠，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。本研究通過錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），實(shí)體顯微鏡（日本Olympus公司），RT-PCR儀和高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司），渦旋混合儀（中國(guó)其林貝爾儀器制造廠），電子天平（中國(guó)賽多利斯天平有限公司），迷你離心機(jī)（中國(guó)昊諾斯生物公司），微量加樣器（法國(guó)吉爾森公司），ATRA（中國(guó)Target MOL公司），RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Invitrogen公司），F(xiàn)4/80抗體、iNOS抗體（美國(guó)Cell Signaling公司），Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國(guó)Vazyme公司），TRIzol（中國(guó)Ambion公司），iNOS、β-actin、TNF-α、IL-1β引物合成（中國(guó)鼎昌國(guó)盛有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腹腔巨噬細(xì)胞的收集純化：取8周齡的C57BL/6小鼠頸部斷髓致死，無菌條件下用2%FBSPBS灌洗腹腔，收集腹腔液，離心并重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞＞95%，用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，以一定細(xì)胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中，孵箱培養(yǎng)2 h后，吸上清液，去除未貼壁的細(xì)胞從而得到純化后的巨噬細(xì)胞。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及條件：將細(xì)胞分為M組、M1組、DMSO組和ATRA組。見表1。IFN-γ（20 ng/mL）聯(lián)合LPS（100 ng/mL）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化后，加入ATRA（30 μg/mL）進(jìn)行干預(yù)，孵箱孵育24 h。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及條件Tab.1 Experimental grouping and conditions

1.3.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用倒置顯微鏡（×100）觀察各組細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行拍照。

1.3.4 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：依照試劑盒說明書將各組細(xì)胞樣本制成濃度為1×106/mL細(xì)胞懸液，吸取100 μL的重懸液到流式管中，加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD Staining Solution，混勻，避光室溫孵育10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)分析：將各組細(xì)胞懸液分別以細(xì)胞數(shù)1×106/管加入流式管并根據(jù)組別進(jìn)行編號(hào)。用FITC標(biāo)記的F4/80抗體以及相應(yīng)的同型對(duì)照抗體進(jìn)行胞外因子染色，用PE標(biāo)記的iNOS抗體以及相應(yīng)的同型對(duì)照抗體進(jìn)行胞內(nèi)因子染色，350 μL Staining Buffer洗滌重懸，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。以前向散射角和側(cè)向散射角確定巨噬細(xì)胞群，應(yīng)用FlowJo 7.6.1軟件分析F4/80+iNOS+M1型巨噬細(xì)胞。

1.3.6 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)：收集各組細(xì)胞后用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。通過紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度及純度。操作完成后將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行操作，配置20 μL反應(yīng)體系，每孔內(nèi)依次加入2 μL cDNA，10 μL 2×mix，上、下游引物各0.4 μL，無菌水7.2 μL，進(jìn)行擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)：iNOS上游引物序列為5’-GGG TCACAACTTTACAGGGAGT-3’，下游引物序列為5’-G AGTGAACAAGACCCAAGCG-3’；TNF-α上游引物序列為5’-GATCGGTCCCCAAAGGGATG-3’，下游引物序列為 5’-TTGCTACGACGTGGGCTACA -3’；IL-1β上游引物序列為5’-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3’，下游引物序列為 5’-TGTGCTGCGAGATTTGA-3’；以β-actin為內(nèi)參照物，β-actin上游引物序列為5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，下游引物序列為 5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。引物均由北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃、30 s；循環(huán)反應(yīng)95℃、5 s；60℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線 95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，2組間均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡（×100）下觀察4組細(xì)胞在體外培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。M組細(xì)胞主要呈圓形或橢圓形；M1組和DMSO組細(xì)胞主要表現(xiàn)為腎形，長(zhǎng)梭形，細(xì)胞表面可見偽足；ATRA組與M1組相比，梭形細(xì)胞數(shù)量減少，圓形細(xì)胞數(shù)量增加且伸出偽足減少。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 ×100Fig.1 Cell morphology observation of each group ×100

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況

Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，與M組相比較，M1組、DMSO組、ATRA組中細(xì)胞凋亡率無明顯差異（P＞ 0.05）；與M1組相比，ATRA組中細(xì)胞凋亡率無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；M1組與DMSO組比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖2。

圖2 巨噬細(xì)胞凋亡率的表達(dá)Fig.2 Expression of macrophage apoptosis rates

2.3 M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)情況

LPS及IFN-γ共同處理后，與M組相比，M1組和DMSO組中F4/80+iNOS+M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；與M1組比較，ATRA組中F4/80+iNOS+M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。DMSO組與M1組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖3。

圖3 M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)Fig.3 Expression of M1 type macrophages

2.4 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)IL-1β、iNOS、TNF-α mRNA表達(dá)情況

通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表達(dá)情況：與M組相比，M1組和DMSO組細(xì)胞中IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；與M1組相比，ATRA組細(xì)胞中IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；DMSO組和M1組M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

3 討論

巨噬細(xì)胞是體內(nèi)重要的吞噬和抗原提呈細(xì)胞，一方面通過非特異性識(shí)別抗原物質(zhì)，對(duì)病原體進(jìn)行吞噬，另一方面通過免疫應(yīng)激，產(chǎn)生抗原提呈，啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答［13］。巨噬細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，經(jīng)LPS刺激可誘導(dǎo)為M1型巨噬細(xì)胞，高表達(dá)ROS、iNOS、IL-6、1L-1β等，具有強(qiáng)大的抗微生物和抗腫瘤活性作用［14-15］。同時(shí)，iNOS和NO是NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的2種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，過量的致病性NO通過環(huán)氧合酶2可產(chǎn)生iNOS，介導(dǎo)組織損傷，引發(fā)炎癥反應(yīng)發(fā)生，與過敏性哮喘、糖尿病、肥胖等多種疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

圖4 M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子IL-1β、iNOS、TNF-α mRNA的表達(dá)Fig.4 Expression of IL-1β，iNOS，and TNF-α mRNA in M1-type macrophages

ATRA是維生素A的重要活性代謝物，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡，臨床中廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療［16-17］。近年來，有研究表明ATRA可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞相關(guān)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生。HUNG等［18］研究發(fā)現(xiàn)ATRA可通過抑制JNK-AP-1信號(hào)通路表達(dá)減少iNOS、NO和COX-2等巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而保護(hù)LPS所致的機(jī)體損傷，發(fā)揮其抗炎作用。ZHANG等［19］發(fā)現(xiàn)ATRA也可通過直接激活蛋白激酶抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞促炎因子IL-1β、TNF-α和iNOS等的生成。這些研究結(jié)果說明，ATRA可通過多條信號(hào)通路來發(fā)揮其對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用。但是，ATRA能否對(duì)M1型巨噬細(xì)胞的極化產(chǎn)生作用還不完全清楚，本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞經(jīng)過ATRA（30 μg/mL）處理后，M1型巨噬細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β、iNOS、TNF-αmRNA表達(dá)降低；并且通過細(xì)胞凋亡率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ATRA在濃度為30 μg/mL時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞無細(xì)胞毒性作用，表明ATRA（30 μg/mL）可有效抑制巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化。

ATRA可通過多種途徑調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化。LI等［20］發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可通過Toll樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）激活I(lǐng)κB激酶（IκB kinase，IKK）復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的M1型極化。而ATRA可通過抑制核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）激活，阻斷TLR4/NF-κβ信號(hào)通路的表達(dá)［21］；馬志新等［22］發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞通過CD14和CR3激活磷脂酶C，產(chǎn)生蛋白激酶C和磷脂酰肌醇3-激酶，從而活化PI3K/Akt通路，調(diào)節(jié)M1型巨噬細(xì)胞極化。而ATRA可通過抑制PI3K激活阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)［23］，從而影響M1型巨噬細(xì)胞極化。因此，推測(cè)ATRA可能通過阻斷多條信號(hào)通路的表達(dá)抑制M1型巨噬細(xì)胞的極化，這些機(jī)制可能是ATRA抑制M1型巨噬細(xì)胞極化的原因。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ATRA（30 μg/mL）對(duì)巨噬細(xì)胞無細(xì)胞毒作用且在體外可抑制M1型巨噬細(xì)胞極化，提示ATRA有可能成為一種用于治療M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)疾病的有效藥物。值得注意的是，ATRA作為體內(nèi)維生素A的代謝中間產(chǎn)物，可能通過多種機(jī)制來影響M1型巨噬細(xì)胞極化，其有關(guān)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。