趙磊，楊笑薇，左韜，姜艷華，周慧敏

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110034；3.沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110031）

干眼是由淚液的質(zhì)、量及動(dòng)力學(xué)異常導(dǎo)致的淚膜不穩(wěn)定或眼表微環(huán)境失衡的慢性眼表疾病，可伴有眼表炎癥反應(yīng)、組織及神經(jīng)異常，造成眼部不適癥狀和（或）視功能障礙［1］。淚膜不穩(wěn)定與眼表上皮細(xì)胞損傷互為因果，可形成惡性循環(huán)加重病情［2］。干眼的研究一直是眼科專業(yè)領(lǐng)域的焦點(diǎn)，中醫(yī)藥在干眼治療方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［3］。左韜等［4］的研究顯示，杞參方能有效改善干眼患者的眼部癥狀、淚液分泌量和淚膜破裂時(shí)間，但其機(jī)制尚未明確。本研究基于細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 1（extracellular regulated protein kinase 1，ERK1）/p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated proein kinase，p38MAPK）通路研究杞參方對(duì)500 mOsm/L滲透壓誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞（human corneal epithelial cells，HCECs）干眼模型的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人12-SV40角膜上皮細(xì)胞株（CRL-11135 HCECs）購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。杞參方（熟地黃 20 g、山藥 9 g、山茱萸 9 g、牡丹皮 9 g、澤瀉 6 g、茯苓 6 g、枸杞子 6 g、菊花 6 g、人參 3 g、麥冬 9 g、五味子 6 g、通草 6 g、黃精 9 g、葛根 9 g）由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。CCK-8試劑盒購(gòu)自北京Solarbio 公司，白細(xì)胞介素-1β（interlukin-1β，IL-1β）檢測(cè)試劑盒（SEA563Mu）購(gòu)自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司；IL-8酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（F10850）購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司；Anti-caspase-3抗體、Anti-ERK1（phospho Y204）抗體（ab131438）、Anti-p38抗體（ab170099）、Anti-p38（phospho T180）抗體（ab178867），購(gòu)自英國(guó)Abcam公 司；ERK1抗 體（G-8）sc-271269購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 血清制備：取SPF級(jí)成年雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量220～240 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK遼2020-0001，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室［許可證編號(hào)：SYYK（遼）2019-0004］。適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠2 d、禁食12 h后，空白血清組大鼠（10只）予蒸餾水灌胃，杞參方高、中、低含藥血清組大鼠（每組10只）分別予高、中、低劑量杞參方顆粒蒸餾水沖服灌胃，2次/d，連續(xù)3 d。參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》折算，大鼠劑量按照成人日劑量的6.36倍分沖備用，成人用量為1.88 g·kg-1·d-1，折算后大鼠最終等效劑量為11.98 g·kg-1·d-1，則杞參方高、中、低劑量分別為23.96、11.98、5.99 g·kg-1·d-1。末次灌胃1 h后采血。室溫靜置離心以分離血清，56 ℃水浴滅活40 min，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩１狙芯客ㄟ^(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審核并認(rèn)真執(zhí)行（倫理批號(hào) 210000420200010）。

1.2.2 高滲透壓干眼HCECs造模：在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中加入無(wú)菌500 mOsm/L滲透壓的飽和氯化鈉溶液，培養(yǎng)基pH（7.2±0.2），培養(yǎng)HCECs。

1.2.3 細(xì)胞分組與給藥：（1）BC組，正常條件培養(yǎng)的HCECs；（2）HO組，干眼模型細(xì)胞加入15%空白血清15 μL；（3）HO+SH組，干眼模型細(xì)胞加入0.3%玻璃酸鈉滴眼液15 μL；（4）HO+HD組，干眼模型細(xì)胞加入15%杞參方高劑量含藥血清15 μL；（5）HO+MD組，干眼模型細(xì)胞加入15%杞參方中劑量含藥血清15 μL；（6）HO+LD組，干眼模型細(xì)胞加入15%杞參方低劑量含藥血清15 μL。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)各組HCECs存活率：將HCECs接種于96孔板（1×104/mL，100 μL/孔），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄培養(yǎng)基，分別加入100 μL 滲透壓為500 mOsm/L的含空白血清、玻璃酸鈉、不同濃度杞參方含藥血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄舊培養(yǎng)基，加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，檢測(cè)450 nm吸光度值（A）。計(jì)算細(xì)胞存活率=（A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔）/（A對(duì)照孔-A空白孔）×100%。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-8的表達(dá)：按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.6 免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry，ICC）法檢測(cè)凋亡因子caspase-3的表達(dá)：制作細(xì)胞片后進(jìn)行染色。PBS清洗3次，H2O2室溫孵育10 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清室溫封閉10～15 min，caspase-3抗體4℃孵育過(guò)夜，PBS清洗，滴加生物素標(biāo)記的抗鼠/兔IgG室溫反應(yīng)20 min，PBS清洗，滴加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素室溫反應(yīng)20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。鏡下觀察并采集照片，測(cè)定5個(gè)隨機(jī)視野的平均A值，作為該樣本中目的蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 Western blotting檢 測(cè)ERK1、p-ERK1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表達(dá)：將HCECs以3×105/孔的密度接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)18～24 h至鋪滿培養(yǎng)板85%左右，棄去舊培養(yǎng)基，分別給予正常等滲培養(yǎng)基和滲透壓為500 mOsm/L的含空白血清、0.3%玻璃酸鈉滴眼液、不同濃度杞參方顆粒含藥血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后，收集細(xì)胞備用。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。提取各組細(xì)胞總蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。蛋白配平變性后行SDS-PAGE電泳，300 mA恒流模式電流轉(zhuǎn)膜1 h。室溫封閉2 h。加入一抗稀釋液（1∶500稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜。加入山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000稀釋）中，搖床室溫孵育2 h。TBST洗膜，ECL發(fā)光，Imaging System化學(xué)發(fā)光成像分析儀成像。通過(guò)Quantity-one分析軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行OD定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示。多組間比較采用One-way ANOVA，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HCECs存活率比較

各組HCECs存活率[BC組（1.083±0.069 5）%，HO組（0.379±0.044 6）%，HO+SH組（0.601±0.046 8）%，HO+HD組（0.968±0.133 1）%，HO+MD組（0.676±0.098 7）%，HO+LD組（0.642±0.084 3）%]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=91.221，P＜ 0.01）。與BC組相比，各組HCECs存活率均顯著減少（P＜ 0.01）；與HO組相比，各用藥組HCECs存活率均顯著增加（P＜ 0.01）；與HO+SH組相比，HO+HD組HCECs存活率顯著增加（P＜ 0.01）。

2.2 各組細(xì)胞外液IL-1β、IL-8表達(dá)水平比較

ELISA結(jié)果顯示，與BC組相比，各組細(xì)胞外液炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-8表達(dá)水平均顯著增高（P＜ 0.01）；與HO組相比，各用藥組的IL-1β、IL-8表達(dá)水平均減少（P＜ 0.05、0.01）；與HO+SH組相比，HO+HD、HO+MD組IL-1β與HO+HD、HO+LD組IL-8表達(dá)水平均顯著減少（P＜ 0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞外液IL-1β和IL-8表達(dá)水平比較（ng/L）Tab.1 Comparison of the expression levels of inflammatory factors IL-1β and IL-8 in extracellular fluid（ng/L）

2.3 各組細(xì)胞凋亡因子caspase-3表達(dá)水平比較

ICC結(jié)果顯示，各組HCECs凋亡因子caspase-3表達(dá)水平［HO組0.256±0.029，HO+SH組0.222±0.034，HO+HD組0.188±0.027，HO+MD組0.192±0.019，HO+LD組0.227±0.027］比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.588，P＜ 0.01）。與BC組相比，各組HCECs中caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著增高（P＜ 0.01）；與HO組相比，HO+SH、HO+HD、HO+MD組caspase-3表達(dá)水平均減少（P＜ 0.05、0.01）；與HO+SH組相比，HO+HD組caspase-3蛋白表達(dá)水平減少（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組HCECs中凋亡因子caspase-3表達(dá) HE×200Fig.1 Comparison of expression of apoptosis factor caspase-3 in HCECs HE ×200

2.4 各 組HCECs中ERK1、p-ERK1、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平比較

Western blotting結(jié)果顯示，各組HCECs中ERK1、p38MAPK蛋白表達(dá)水平組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。而各組HCECs的p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與BC組相比，各組HCECs中的p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達(dá)均顯著增高（P＜ 0.01）；與HO組相比，HO+SH、HO+HD、HO+MD組的p-ERK1與HO+HD、HO+MD組的p-p38MAPK蛋白表達(dá)均減少（P＜ 0.05、＜0.01）；與HO+SH組相比，HO+HD、HO+MD組p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平減少（P＜ 0.05，0.01）。見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組HCECs的ERK1、p38MAPK、p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of ERK1，p38MAPK，p-ERK1，and p-p38MAPK proteins in HCECs of each groups

表2 各組HCECs中ERK1、p-ERK1、p38MAPK、p-p38MAPK表達(dá)結(jié)果比較Tab.2 Comparison of expression levels of ERK1，p-ERK1，p38MAPK and p-p38MAPK in HCECs of each group

3 討論

杞參方由杞菊地黃丸合生脈飲再加通草、黃精、葛根組合而成。杞菊地黃丸滋補(bǔ)肝腎之陰，為滋陰潤(rùn)目名方。相關(guān)meta分析顯示，杞菊地黃丸聯(lián)合西藥治療干眼的療效優(yōu)于單純應(yīng)用西藥組［5-6］。杞菊地黃丸還可降低淚液中IL-1β、IL-8、MMP-9的表達(dá)水平［7］。生脈飲具有補(bǔ)益肺腎之氣、養(yǎng)陰生津之效，具有抑制炎癥反應(yīng)的作用［8］。加葛根、黃精、通草以補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾益腎，通利三焦。前期研究［9］證實(shí)，杞參方可降低炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平，減少大鼠干眼模型角膜上皮損傷及淚腺細(xì)胞凋亡。

淚膜和眼表協(xié)會(huì)國(guó)際干眼工作小組第2次報(bào)告（Tear Film and Ocular Surface Society Dry Eye Workshop，TFOSDEWS Ⅱ）得出結(jié)論：干眼的核心機(jī)制是蒸發(fā)誘導(dǎo)的淚液高滲直接損害眼表，引起炎癥反應(yīng)，最常見(jiàn)為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated proein kinase，MAPK）與核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）介導(dǎo)［10］。MAPK主要負(fù)責(zé)從細(xì)胞表面到核內(nèi)部的信號(hào)傳遞，調(diào)控炎癥、細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞侵襲等生理活動(dòng)［11］。ERK1、p38MAPK為MAPK的亞族。研究［12-14］證實(shí)，炎性細(xì)胞因子在干眼發(fā)病過(guò)程中表達(dá)明顯增強(qiáng)，而其表達(dá)及釋放與ERK1、p38MAPK通路的激活密切相關(guān)，通過(guò)干預(yù)ERK1、p38MAPK表達(dá)可抑制干眼的炎癥信號(hào)向細(xì)胞凋亡通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，各組HECEs中ERK1、p38MAPK蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在未受刺激的細(xì)胞內(nèi)，MAPK在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，MAPK被激活而發(fā)生逐級(jí)磷酸化，磷酸化后的MAPK蛋白則會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，故而出現(xiàn)各組HCECs中ERK1、p38MAPK蛋白表達(dá)水平組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而各組p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這與郭宣妮等［15］的研究結(jié)果基本一致。郭宣妮等［15］發(fā)現(xiàn)干眼組患者淚液中p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達(dá)與淚膜破裂時(shí)間和基礎(chǔ)淚液分泌試驗(yàn)均呈顯著負(fù)相關(guān)，與角膜熒光素染色評(píng)分呈顯著正相關(guān)，與本研究的HO組p-ERK1、p-p38MAPK蛋白表達(dá)增高的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，杞參方高、中劑量組可減少干眼模型HCECs內(nèi)p-ERK1、p-p38MAPK蛋白的表達(dá)，提示高、中劑量杞參方可能對(duì)干眼模型HCECs具有抗炎及抗細(xì)胞凋亡的作用。ERK1、p38MAPK通路可促進(jìn)干眼模型角結(jié)膜上皮IL-1、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的釋放及細(xì)胞凋亡［16-17］。本研究中，加入空白血清的HO組干眼模型細(xì)胞 IL-1β、IL-8、caspase-3表達(dá)均增高，而高、中劑量杞參方血清組細(xì)胞IL-1β、IL-8與caspase-3則明顯低于HO組。提示杞參方可能通過(guò)降低ERK1、p38MAPK的磷酸化來(lái)減少IL-1β、IL-8與caspase-3的表達(dá)治療干眼。

綜上，杞參方可降低高滲誘導(dǎo)HCECs的ERK1、p38MAPK的磷酸化蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞外液炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-8和細(xì)胞凋亡因子caspase-3的表達(dá)，最終有效抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。