王爽，汪彩霞，李瀟，劉鷗萱，胡悅欣，勾睿，聶鑫，郭騫，朱連成，林蓓

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.遼寧省母胎醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省婦產(chǎn)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110004；3.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，成都 610041）

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，早期缺乏特異的診斷方法，大部分患者被確診時已處于腫瘤晚期，并且在世界范圍內(nèi)，卵巢癌發(fā)病率仍呈上升趨勢［1-2］。上皮性漿液性腫瘤是卵巢惡性腫瘤中最常見的類型之一。鋅指蛋白703（zinc finger protein，ZNF703）屬于NET/Nlz家族成員，是一種具有“指狀”結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子［3］。在生理情況下，ZNF703調(diào)控胚胎發(fā)育過程，如脊椎動物后腦分化為菱腦節(jié)及非洲爪蟾神經(jīng)嵴等［4-5］。目前的研究證實(shí)，ZNF703在乳腺癌［6］、肺癌［7］、胃癌［8］中的表達(dá)異常升高，有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

卵巢組織樣本共81例，包括其中卵巢上皮性漿液性腫瘤45例（漿液性癌組），卵巢上皮性漿液性交界腫瘤12例（交界組），卵巢上皮性漿液性良性腫瘤13例（良性組）和正常卵巢組織11例（正常組）。樣本取自中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦科2008年至2014年間住院患者手術(shù)標(biāo)本存檔蠟塊，所有病例術(shù)前均未經(jīng)過化療、放療或激素治療，且具有完整的臨床信息。正常的卵巢組織來自非育齡患者，因?qū)m頸部病變而接受了全子宮切除術(shù)。結(jié)果由2位不知情的高年資病理醫(yī)師獨(dú)立判斷，如有異議由第3位病理醫(yī)師判定。各組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理批號：2019PS450K。

1.2 主要試劑

鼠抗人ZNF703抗體（sc-271896購自美國SantaCruz公司），鼠兔通用型免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物公司，蘇木素購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 檢測方法

石蠟切片為5 μm厚度連續(xù)切片。其中，以ZNF703陽性表達(dá)的腎上腺組織切片為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作陰性對照片，ZNF703單克隆抗體作用濃度為1∶50。脫蠟后，采用免疫染色通透液（Triton X-100，P0096，Beyotime）通透，染色方法按鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

結(jié)果以細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒著為陽性。按著色強(qiáng)度分為不著色、淺黃色、棕黃色及棕褐色，并分別記分為0、1、2及3分；著色細(xì)胞所占視野的百分比為＜5%，5%～＜25%，25%～＜50%，50%～75%及＞75%分別記為0、1、2、3及4分。2項(xiàng)相乘得到最終評分，0～2分為（-），3～4分為（+），5～8分為（++），9～12分為（+++）。由2位觀察者分別閱片控制誤差。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及 Fisher確切概率法，計量資料采用單因素方差分析。2組之間的統(tǒng)計差異通過t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，2組以上比較采用單因素方差分析。Kaplan-Meier曲線用于生存分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZNF703在各組卵巢組織中的表達(dá)

為了評估卵巢漿液性腫瘤患者中ZNF703的表達(dá)，本研究對臨床標(biāo)本的石蠟切片進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，ZNF703主要表達(dá)于卵巢組織的細(xì)胞核中，在細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)（圖1）。卵巢漿液性癌組陽性表達(dá)率和高表達(dá)率分別為86.7%（39/45）和62.2%（28/45），高于交界組［66.7%（8/12）和33.3%（4/12），P均＞0.05］，顯著高于良性組［46.2%（6/13）和7.7%（1/13），均P＜ 0.05］和正常［27.3%（3/11）和0%（0/11），P均＜0.001］組。在卵巢交界性漿液性腫瘤組中，ZNF703陽性表達(dá)率為66.7%（8/12），高表達(dá)率為33.3%（4/12），高于良性組［46.2%（6/13）和7.7%（1/13）］和正常組［27.3%（3/11）和0%（0/11）］（P均＞0.05），見表1。

表1 ZNF703在各組卵巢組織中的表達(dá)Tab.1 ZNF703 expression in various ovarian tissue types

圖1 ZNF703在各組卵巢組織中的表達(dá)情況Fig.1 ZNF703 expression in ovarian tissues samples

2.2 ZNF703表達(dá)與卵巢漿液性惡性腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

將45例卵巢漿液性癌分為ZNF703高表達(dá)組（++/+++）和ZNF703低表達(dá)組（-/+），ZNF703的表達(dá)與臨床病理病理參數(shù)的關(guān)系如表2所示，ZNF703的表達(dá)與臨床病理分期相關(guān)（P＜ 0.05）。但ZNF703表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度均無明顯相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

表2 ZNF703表達(dá)與卵巢漿液性惡性腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 Relationship between ZNF703 expression and clinicopathological parameters of ovarian serous malignant tumors

2.3 ZNF703的表達(dá)與卵巢漿液性惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系

對45例卵巢惡性腫瘤患者進(jìn)行隨訪，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，高表達(dá)ZNF703的卵巢漿液性癌患者總生存期較ZNF703低表達(dá)的患者短（P=0.011）（圖2A）。免疫組化評分如圖2B所示。同時，查閱Oncomine數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)ZNF703在多種腫瘤中均為高表達(dá)，在卵巢癌中尚無研究（圖2C）。進(jìn)一步采用Cox回歸分析探討不同臨床病理參數(shù)及指標(biāo)與預(yù)后的關(guān)系，單因素分析結(jié)果顯示，ZNF703的高表達(dá)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響卵巢癌患者預(yù)后的危險因素，ZNF703的表達(dá)越高，其預(yù)后越差（P＜ 0.05），將三者納入多因素分析后發(fā)現(xiàn)臨床FIGO分期是患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。這些結(jié)果表明ZNF703表達(dá)水平在卵巢癌組織中表達(dá)上調(diào)且與不良預(yù)后相關(guān)。見表3。

表3 卵巢漿液性癌不同臨床病理參數(shù)的單因素和多因素Cox分析Tab.3 Univariate and multivariate Cox analyses of different clinicopathological parameters in ovarian serous cancer

圖2 ZNF703免疫組化統(tǒng)計及數(shù)據(jù)庫結(jié)果Fig.2 Immunohistochemistry statistical analyses and database results for ZNF703

3 討論

卵巢癌是惡性程度最高的婦科腫瘤，發(fā)現(xiàn)時往往處于晚期，患者生存時間短、預(yù)后差。轉(zhuǎn)錄因子在基因表達(dá)調(diào)控中起到核心作用，主要表現(xiàn)在通過影響轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成及活性來控制染色質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄和空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)節(jié)如細(xì)胞分化、發(fā)育、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡與自噬、血管生成及干性維持等許多生物學(xué)過程，在基因表達(dá)調(diào)控中起著核心作用，其發(fā)揮作用的主要機(jī)制是通過鋅指結(jié)構(gòu)與基因中啟動子或增強(qiáng)子的特異性結(jié)合域序列進(jìn)行結(jié)合，并形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物激活或抑制轉(zhuǎn)錄［9］。

ZNF703是一種轉(zhuǎn)錄因子，屬于NET/NlZ家族成員，定位于8p11.23，主要分布于細(xì)胞核。ZNF703及其同系物有6個進(jìn)化保守域，這些特定結(jié)構(gòu)域?qū)τ?NET/NlZ蛋白正確的亞細(xì)胞分布和轉(zhuǎn)錄抑制作用是必需的。ZNF703在早期中胚層與神經(jīng)嵴和基板發(fā)育中具有不同且可分離的功能。其作為轉(zhuǎn)錄因子Pax3和Zic1的靶標(biāo)，促進(jìn)非洲爪蟾神經(jīng)嵴的形成。SIRCOLOMB等［10］發(fā)現(xiàn)ZNF703抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β受體的活性及E鈣黏蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖及遷移，減少細(xì)胞間黏附。在結(jié)直腸癌中，體外細(xì)胞研究［11］表明ZNF703促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲。ZNF703在胃癌浸潤組織中高表達(dá)并與浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在甲狀腺癌中的研究也得到了相同的結(jié)論。

ZNF703對腫瘤的惡性進(jìn)展發(fā)揮著重要且機(jī)制多樣化的作用。1項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究［12］揭示了上游分子lncRNA SPRY4-IT1通過調(diào)節(jié)ZNF703促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。不僅如此，同樣的機(jī)制也在食管鱗狀細(xì)胞癌中得到驗(yàn)證。另一方面，在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)了ZNF703的上游調(diào)節(jié)通路。同樣的，在胃癌中，miR-491-5p調(diào)節(jié)ZNF703，LBX2-AS1被認(rèn)為上游調(diào)節(jié)分子。在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，ZNF703過度表達(dá)可能與PI3K/AKT通路的激活或者拷貝數(shù)變異有關(guān)［13-14］。同樣的，在甲狀腺髓樣癌中ZNF703通過AKT/mTOR通路促進(jìn)癌細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖［15］。ZNF703可以通過激活A(yù)KT-mTOR通路參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程［7］。

也有體內(nèi)外研究［16］發(fā)現(xiàn)ZNF703可以通過PI3K/AKT/GSK-3信號通路促進(jìn)口腔鱗狀癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。已有研究［17］證明卵巢癌組織中ZNF703mRNA高表達(dá)，但是研究樣本僅限于正常卵巢組織及卵巢癌組織，且沒有蛋白水平的驗(yàn)證。本研究應(yīng)用臨床標(biāo)本發(fā)現(xiàn)ZNF703蛋白在卵巢漿液性癌組織中過表達(dá)，表達(dá)水平明顯高于交界組、良性組及正常組，并且ZNF703高表達(dá)的患者生存時間明顯縮短。

本研究結(jié)果顯示，ZNF703是卵巢癌的預(yù)后因素，但并非獨(dú)立，可能受到很多其他臨床因素共同影響，說明ZNF703可以作為臨床標(biāo)志物，與其他標(biāo)志物一起用于卵巢癌的診斷、治療及監(jiān)測。