李同林 秦克 宮帥

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是進展性的呼吸系統(tǒng)疾病，吡非尼酮可治療IPF，但發(fā)病率正在上升[1-3]，控制IPF進展的機制仍不清楚。microRNAs是一個長度為22nt的非編碼RNA，可結合mRNA的3'UTR調節(jié)基因表達[4-5]，識別特異性miRNA可以進一步了解發(fā)病機制。研究表明miRNAs在肺纖維化在內的疾病中發(fā)揮作用[6-8]。例如miR-21介導肺成纖維細胞的纖維化激活。研究發(fā)現(xiàn)miR-7-5p參與了疾病的發(fā)展，如miR-7-5p過表達調控TK6細胞的增殖[9]。上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮作用，在此期間，E-cadherin表達丟失，Vimentin和N-cadherin表達增強，細胞獲得侵襲能力[10]。TGF-β在細胞發(fā)育或腫瘤發(fā)展條件下會誘導EMT發(fā)生，單純的TGF-β刺激可誘導細胞EMT[11]。因此，本研究主要是探討miR-7-5p在TGF-β1誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞間質轉化中的意義及作用機制。

資料與方法

一、主要材料

Ⅱ型肺泡上皮細胞A549細胞由中國科學院上海細胞庫提供；DMEM(Dulbecco's-modified Eagle's medium)培養(yǎng)基、2.5g/L胰酶和Turbofect購于Thermo Fisher Scientific； Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser來自日本Takara公司；Transwell小室購自Conring公司；結晶紫由Sigama公司提供；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體來自英國Abcam；miR-7-5p mimics、miR-7-5p inhibitor來自GenePharma公司；RelA siRNA質粒來自上海生工生物工程有限公司。

二、實驗方法

1 細胞培養(yǎng) 取狀態(tài)良好的A549細胞，培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于37℃、5% CO2，95%濕度的培養(yǎng)箱，細胞匯合度為95%左右時傳代培養(yǎng)。

2 細胞轉染 將A549細胞培養(yǎng)至細胞密度達75%時，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，用空DMEM培養(yǎng)基覆蓋單層，取Turbofect、重組質粒、Opti-MEM混勻于新的EP管，靜置20 min，緩慢滴加于細胞中，晃勻后置于培養(yǎng)箱，2h后棄上清，添加10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，轉染48h后收集RNA樣和蛋白樣。

3 雙熒光素酶報告基因活性檢測 根據(jù)TargetScan軟件的預測結果，PCR擴增目的片段，構建RelA wt載體。序列比對正確后再通過點突變試劑盒構建RelA mut載體。將A549細胞培養(yǎng)至細胞密度達75%時，用空DMEM培養(yǎng)基覆蓋單層，將RelA wt、RelA mut分別與miR-7-5p mimics、mimics NC質粒共轉染至A549細胞，48 h后使用雙熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性強度。

4 細胞侵襲實驗 取4 ℃融化的matrigel，用DMEM稀釋至其濃度為1mg/mL，每孔鋪100μL matrigel添于每個小室中，干燥使其成膠狀。將狀態(tài)良好的A549細胞添加到Transwell小室，下室添加完全DMEM培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)48h，拭去matrigel膠，用多聚甲醛固定20 min， 0.1%結晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察細胞侵襲情況，拍照并記數(shù)。

5 細胞劃痕愈合實驗 將各組稀釋后的單細胞懸液按3×105個/孔的密度鋪在6孔板，觀察細胞鋪滿板底后，取200 μL槍頭，制造細胞線性劃痕，PBS清洗2次，加入空培養(yǎng)基，48 h后觀察細胞遷移距離。拍照并使用ImageJ軟件分析結果。

6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 取出保存RNA樣品，提取細胞總RNA，按cDNA合成試劑盒說明書分別將RNA反轉錄為cDNA。按照熒光定量PCR試劑盒配置反應體系，用(表1)引物進行實時熒光定量PCR，程序：預變性95℃，10 min，變性95℃，10 s，退火60℃，20 s，延伸72℃，30 s，40個循環(huán)，所有反應均設有3個復孔，用2-△△Ct法分析結果。

表1 引物序列

7 Western blot 轉染48h后細胞蛋白樣，提取總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，配置蛋白膠，取50μg蛋白點樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉移蛋白到PVDF膜，PVDF膜浸泡于5%脫脂奶粉配置的封閉液，3 h后將PVDF膜置于特異性一抗，4℃搖床孵育，TBST清洗，PVDF膜置于二抗中，室溫搖床孵育1 h，TBST洗脫PVDF膜，用增強型化學發(fā)光液進行蛋白曝光。

三、統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，當P>0.05時，表示差異不顯著；當P<0.05時，表示差異顯著或極顯著。

結 果

一、miR-7-5p在TGF-β1誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞A549細胞中表達下調

由(圖1A) Western blot和(圖1B)結果表明，10 ng/mL TGF-β1處理A549細胞12 h、24 h 和48h后，EMT 相關蛋白 E-cadherin 表達明顯下調(P<0.05)，N-cadherin 表達明顯上調(P<0.05)，Vimentin 表達明顯上調(P<0.05)，表明TGF-β1 作用A549 細胞后明顯誘導細胞發(fā)生了EMT。由(圖1C) RT-qPCR結果可知，和Control組相比，10 ng/mL 的TGF-β1處理 A549細胞12 h、24 h 和48h后細胞內miR-7-5p表達量明顯降低(P<0.01)。以上結果表明miR-7-5p在TGF-β1誘導的A549細胞中表達下調。

圖1 miR-7-5p在TGF-β1誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞A549細胞中表達下調

二、過表達miR-7-5p抑制A549細胞侵襲、遷移和EMT

由(圖2A)可知，和Control或mimics NC組相比，miR-7-5p mimics組的miR-7-5p表達量明顯升高(P<0.01)。由(圖2B-2C)細胞侵襲實驗結果可知，和mimics NC組相比，miR-7-5p mimics組的細胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)。由(圖2D-2E)細胞劃痕愈合實驗結果可知，和mimics NC組相比，miR-7-5p mimics組細胞劃痕愈合率明顯降低(P<0.01)。由(圖2F-2G) Western blot結果可知，和mimics NC組相比，miR-7-5p mimics組細胞N-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)，Vimentin 表達明顯下降(P<0.01)，E-cadherin 表達明顯上升(P<0.01)。以上結果表明過表達miR-7-5p抑制A549細胞侵襲、遷移和EMT。

圖2 過表達miR-7-5p抑制A549細胞侵襲、遷移和EMT

三、下調miR-7-5p促進A549細胞增殖、侵襲和EMT

由(圖3A)可知，和Control或inhibitor NC組相比，miR-7-5p inhibitor組的miR-7-5p表達量明顯降低(P<0.01)。由(圖3B-3C)細胞侵襲實驗結果可知，和inhibitor NC組相比，miR-7-5p inhibitor組的細胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)。由(圖3D-3E)細胞遷移實驗結果可知，和inhibitor NC組相比，miR-7-5p inhibitor組細胞劃痕愈合率明顯升高(P<0.01)。由(圖3F-3G) Western blot結果可知，和inhibitor NC組相比，miR-7-5p inhibitor組細胞N-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，Vimentin蛋白表達明顯上升(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達明顯降低(P<0.01)。以上結果表明下調miR-7-5p促進A549細胞侵襲、遷移和EMT。

圖3 下調miR-7-5p促進A549細胞侵襲、遷移和EMT

四、miR-7-5p對NF-κB信號通路的影響

由(圖4A-4B)結果可知，和mimics NC組相比，miR-7-5p mimics組細胞內TAK1和p65磷酸化水平明顯降低，p-TAK1/TAK1和NF-κB p-p65/NF-κB p65比值明顯降低(P<0.01)；和inhibitor NC組相比，miR-7-5p inhibitor組細胞內TAK1和p65磷酸化水平明顯升高，p-TAK1/TAK1和NF-κB p-p6/NF-κB p65比值明顯增加(P<0.01)；。以上結果表明，下調miR-7-5p能夠激活細胞內NF-κB信號通路。

圖4 miR-7-5p對NF-κB信號通路的影響

五、miR-7-5p與NF-κB/RelA的靶向和負調控關系

生物學信息軟件TargetScan預測miR-7-5p和RelA之間的結合位點見(圖5A)。由(圖5B)結果可知，和RelA wt+mimics NC組相比，RelA wt+miR-7-5p mimics組細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，和HRelA mut+mimics NC組相比，RelA mut+miR-7-5p mimics組細胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。由(圖5C)結果可知，和mimics NC組相比，miR-7-5p mimics組RelA基因表達量明顯降低(P<0.01)；和inhibitor NC組相比，miR-7-5p inhibitor組RelA基因表達量明顯升高(P<0.01)。以上結果表明，miR-7-5p與HOXA5之間具有靶向和負調控關系。

圖5 miR-7-5p與NF-κB/RelA的靶向和負調控關系

六、下調RelA抑制A549細胞侵襲、遷移和EMT

由(圖6A) RT-qPCR結果可知，和Control組相比，10 ng/mL 的TGF-β1處理 A549細胞12 h、24 h 和48h后細胞內RelA表達量明顯升高(P<0.01)。由(圖6B)可知，和Control或siRNA NC組相比，RelA siRNA組的RelA表達量明顯降低(P<0.01)。由(圖6C-6D)細胞侵襲實驗結果可知，和siRNA NC組相比，RelA siRNA組的細胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)。由(圖6E-6F)細胞劃痕愈合實驗結果可知，和siRNA NC組相比，RelA siRNA組細胞劃痕愈合率明顯降低(P<0.01)。由(圖6G-6H) Western blot結果可知，和siRNA NC組相比，RelA siRNA組細胞N-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)，Vimentin 表達明顯下降(P<0.01)，E-cadherin 表達明顯上升(P<0.01)。以上結果表明下調RelA抑制A549細胞侵襲、遷移和EMT。

討 論

特發(fā)性肺纖維化( IPF)是一種嚴重的肺部疾病，其特征是不可逆的、進行性的肺功能喪失，迅速導致呼吸衰竭和死亡率增加[12]，診斷時的生存率與肺惡性腫瘤是相似的。對IPF發(fā)病機制的最新研究表明，異常的傷口愈合、有缺陷的再上皮化、成纖維細胞向肌成纖維細胞轉變、以及在成纖維細胞灶處增生性肺炎細胞和細胞外基質成分的過量積累，導致肺結構破壞[13]。近些年研究表明直接參與纖維化、肌成纖維細胞增殖和細胞外基質過度沉積的microRNAs包括miR-21、miR-29和let-7家族成員[14]。IPF成纖維細胞和上皮細胞中miR-21表達增強，這在惡性疾病也可見。miR-29家族是在肺、心臟和肝臟纖維化疾病中發(fā)現(xiàn)的首批下調的microRNAs之一。miR-29通過抑制ECM(包括膠原蛋白)以及調節(jié)膠原蛋白合成，交聯(lián)和降解的酶發(fā)揮作用[15]。根據(jù)之前的報道，在IPF發(fā)病機制中對miR-210、miR-185、miR-302c-3p、miR-376c和miR423-5p在慢速和快速IPF進展中差異表達。以上研究表明，microRNAs與IPF的發(fā)展具有一定的聯(lián)系。而在本實驗中我們選擇了miR-7-5p進行探討，結果發(fā)現(xiàn)miR-7-5p在TGF-β1 誘導的肺泡上皮細胞 EMT 模型中表達下調，結果提示我們miR-7-5p的異常表達參與了肺纖維化的發(fā)展，可能通過影響肺泡上皮細胞 EMT進程進而發(fā)揮作用。

圖6 下調RelA抑制A549細胞侵襲、遷移和EMT

研究表明EMT 在癌癥轉移和多種纖維化疾病包括肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用，是一個可逆過程。EMT在癌癥轉移和侵襲過程中會使上皮細胞演變成不規(guī)則的間充質細胞。在此過程中，細胞間粘附減少，繼而使細胞遷移和侵襲能力增加。細胞發(fā)生EMT過程時，上皮標志物如 E-cadherin 蛋白表達明顯下調，而間質標志物如 Vimentin、N-cadherin和α-SMA蛋白出現(xiàn)上調[16-17]。受此啟發(fā)，我們在后續(xù)實驗過程中評估了miR-7a-5p在A549細胞侵襲、遷移和 EMT過程中的作用。結果表明在A549細胞，上調miR-7a-5p表達后，E-cadherin蛋白表達上調、而N-cadherin、Vimentin表達下調，且A549細胞的侵襲和遷移能力明顯受到抑制。另外下調miR-7a-5p表達后，明顯促進了A549細胞的侵襲、遷移和EMT。我們猜想，miR-7a-5p可能通過調影響A549細胞的EMT而參與肺纖維化進程。近些年有很多文獻報道了NF-κB/RelA與各種癌癥以及肺纖維化疾病之間的關系。如磷酸化的RB通過抑制NF-κB活化和PD-L1表達來提高癌癥免疫力[18]。抑制NF-κB通路可通過下調胰腺癌中的Bcl-2來增強卡巴他賽的抗腫瘤作用[19]。另外還發(fā)現(xiàn)HMGB1通過NF-κB激活TGF-β1誘導的特發(fā)性肺纖維化疾病。林箐等人發(fā)現(xiàn)肺組織中PPARγ的表達減弱，NF-κB的表達增強在肺纖維化的發(fā)病過程中起作用[20]。TAKl是絲裂原激活蛋白激酶家族的重要組成部分，結合TAB1蛋白的C端后被激活，磷酸化TAKl修飾活化環(huán)上的Ser192、 Thr168、 Thr187 殘基，激活了下游信號通路，另外活化后的TAK1會激活NIK最終活化NF-κB通路。而在本研究中我們發(fā)現(xiàn)下調miR-7-5p使p-TAK1/TAK1和NF-κB p-p65/NF-κB p65比值明顯升高，激活了細胞內NF-κB通路，另外用TargetScan預測還發(fā)現(xiàn)miR-7-5p和RelA具有靶向作用，雙熒光素酶實驗和RT-qPCR驗證了二者的相互作用和負調控關系。且RelA在TGF-β1 誘導的肺泡上皮細胞 EMT 模型中表達上調，siRNA下調RelA表達后明顯抑制了A549細胞的侵襲、遷移和 EMT。表明miR-7-5p對A549細胞間質轉化的調控作用可能是通過RelA實現(xiàn)的。然而在細胞發(fā)育過程和腫瘤發(fā)生發(fā)展等病理過程中，胞內很多信號通路如PI3K-AKT、Wnt/β-catenin、JAK-STAT和ERK/MAPK等都會參與其中，而在本研究中我們只討論了NF-κB通路和RelA一個作用靶點，這也是本文的不足之處，miR-7-5p可能會通過其它靶點或者是其它通路來發(fā)揮其功能，因此miR-7-5p調控A549細胞發(fā)展的具體作用機制還需要進一步深入研究。

綜上所述，本研究表明miR-7-5p調控NF-κB/RelA信號通路促進A549細胞的上皮間質轉化，為深入探討肺纖維化的發(fā)病機制提供了新的理論依據(jù)。