王朝欽，宋昊玥，楊 熙，王艷瓊，龔 元

1.電子科技大學(xué)信息與通信工程學(xué)院，四川成都611731

2.電子科技大學(xué)光纖傳感與通信教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611731

流激光集成液體增益材料和光學(xué)微腔，常用作傳感器或片上光源。區(qū)別于傳統(tǒng)的固體激光器，微流激光集成了微流體系并采用流體狀的增益介質(zhì)，具有激光閾值低、集成度高、波長(zhǎng)可調(diào)、功能多樣等特點(diǎn)。相較于無(wú)源微腔和其他光流控檢測(cè)技術(shù)，激光微流控充分利用了增益介質(zhì)的放大作用，增強(qiáng)了光和物質(zhì)的相互作用，結(jié)合微腔實(shí)現(xiàn)激光出射。以激光信號(hào)作為輸出，具有以下優(yōu)勢(shì)：1）利用光學(xué)微腔和激光的放大作用，增強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用，實(shí)現(xiàn)較高的靈敏度；2）激光具有方向性，相較于無(wú)方向性的熒光信號(hào)，其強(qiáng)度更強(qiáng)，具有較高的信噪比；3）激光線寬更窄，可實(shí)現(xiàn)更高的波長(zhǎng)復(fù)用度，有利于實(shí)現(xiàn)高通量的生化傳感。

微流激光作為生化傳感領(lǐng)域的熱門(mén)技術(shù)，是微流技術(shù)與光學(xué)相結(jié)合的熱點(diǎn)方向和學(xué)科前沿[1-2]。在微腔結(jié)構(gòu)方面，2003年，Helbo 等[3]利用兩塊平面反射鏡構(gòu)成法布里-珀羅腔，實(shí)現(xiàn)了第一個(gè)片上微流激光器；Bhaktha 等[4]利用微流芯片通道壁上的隨機(jī)結(jié)構(gòu)提供隨機(jī)反饋，實(shí)現(xiàn)了隨機(jī)微流激光。結(jié)合選擇性填充技術(shù)，Yu 等[5]基于反諧振光纖的微環(huán)諧振腔實(shí)現(xiàn)了激光輸出。Zhou 等[6]在硅基底上生長(zhǎng)量子點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了單縱模激光，利用光子晶體激光對(duì)環(huán)境溫度及表面電荷變化的敏感性，可實(shí)現(xiàn)折射率傳感。

在增益介質(zhì)方面，基于有機(jī)染料，Moon 等[7]將裸光纖深入填充裝有羅丹明溶液的毛細(xì)管中，在泵浦脈沖的作用下觀察到了激光輸出；Kazes 等[8]將量子棒作為增益介質(zhì)，以通信光纖作為諧振腔，利用光纖微腔的高Q 值克服了非輻射損耗，實(shí)現(xiàn)了微流激光輸出；Schafer 等[9]利用CdSe/ZnS 量子點(diǎn)形成10～40 μm 的液滴微腔，實(shí)現(xiàn)了單模和多模的激光發(fā)射；Gather 等[10]利用大腸桿菌內(nèi)基因編碼的綠色熒光蛋白作為增益介質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了激光發(fā)射；Lee 等[11]將維生素B2 的水溶液作為增益介質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了生物相容的光微流激光。將激光粒子（laser particles, LPs）注入到細(xì)胞中并以泵浦激發(fā)，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞激光器[12-14]，通過(guò)收集其發(fā)射出的激光信號(hào)可以完成對(duì)LPs 的定位；Nicola 等[15]基于此原理完成了對(duì)腫瘤中數(shù)千個(gè)細(xì)胞的軌跡追蹤。

本文圍繞微流激光生化傳感技術(shù)的基本原理，分別介紹了基于增益介質(zhì)調(diào)節(jié)、基于微腔調(diào)節(jié)和基于損耗調(diào)節(jié)的生化傳感。其中，基于增益介質(zhì)調(diào)節(jié)的生化傳感是目前主流的微流激光生化傳感原理，應(yīng)用范圍最廣，也是本文重點(diǎn)討論的內(nèi)容。例如，當(dāng)待測(cè)物直接或間接影響增益分子的數(shù)量或狀態(tài)，將會(huì)導(dǎo)致激光輸出特性變化。通過(guò)標(biāo)定激光輸出特性與待測(cè)物濃度之間的關(guān)系，則可對(duì)待測(cè)物含量進(jìn)行傳感測(cè)量。基于微腔變化的生化傳感也是本文討論內(nèi)容之一，待測(cè)物引起微腔尺寸或形狀的變化，從而引起激光輸出特性的變化，如激光波長(zhǎng)。最后，闡述了基于損耗調(diào)節(jié)的生化傳感。待測(cè)物調(diào)節(jié)腔內(nèi)的吸收損耗或散射損耗，使得激光輸出強(qiáng)度發(fā)生變化。

1 基于增益介質(zhì)調(diào)節(jié)的微流激光生化傳感技術(shù)

微流激光器由諧振腔、增益介質(zhì)和泵浦構(gòu)成。泵浦為系統(tǒng)提供能量、激活增益介質(zhì)、實(shí)現(xiàn)粒子數(shù)反轉(zhuǎn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)光放大。諧振腔可以增強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用，因此基于微流激光的傳感器能靈敏地反映激光腔內(nèi)待測(cè)物分子的數(shù)量和狀態(tài)的變化。通過(guò)生化反應(yīng)，使待測(cè)物分子的數(shù)量能夠直接或間接影地響增益介質(zhì)的數(shù)量或狀態(tài)，是微流激光傳感領(lǐng)域中最常用的一種方式。

1.1 基于增益分子數(shù)量變化實(shí)現(xiàn)生化傳感

在生化傳感應(yīng)用中，常利用生物化學(xué)的方法使增益分子與待測(cè)物之間建立直接或間接的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。待測(cè)物的數(shù)量可以決定在光學(xué)微腔中總的增益分子的數(shù)量。增益分子的數(shù)量又決定了激光輸出特性，則通過(guò)對(duì)微流激光器的輸出可實(shí)現(xiàn)待測(cè)物濃度的傳感。

免疫檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）是將一定濃度的抗原或抗體固定于固相載體表面，加入待檢樣本后通過(guò)酶標(biāo)物顯色的深淺間接反映被檢抗原或抗體的存在與否或量的多少，如圖1(a) 所示。Wu 等[16]提出了微流激光ELISA，通過(guò)將傳統(tǒng)的雙抗體夾心ELISA 方法與光學(xué)微腔結(jié)合，先將捕獲抗體交聯(lián)于方形毛細(xì)管內(nèi)表面，再把待測(cè)物通入毛細(xì)管孵育，使其與固定在方形毛細(xì)管上的捕獲抗體相交聯(lián)，如圖1(b) 所示。用清洗液除去未結(jié)合的分子，再讓特異性識(shí)別待測(cè)物的檢測(cè)抗體通入毛細(xì)管內(nèi)孵育，使固定在捕獲抗體上的待測(cè)物分子與檢測(cè)抗體特異性結(jié)合。用清洗液清洗后，讓鏈霉親和素標(biāo)記的過(guò)氧化氫酶（SAv-HRP）溶液流過(guò)方形毛細(xì)管并孵育，使SAv-HRP 分子與檢測(cè)抗體相交聯(lián)。由于抗體與抗原交聯(lián)的特異性，只有成功捕獲到待測(cè)物的抗體位點(diǎn)才能存在檢測(cè)抗體，并與SAv-HRP 分子特異性結(jié)合。與待測(cè)物分子結(jié)合的抗體位點(diǎn)越多，捕獲到的SAv-HRP 分子數(shù)量也就越多。完成了對(duì)方形毛細(xì)管的處理后，將無(wú)色透明的底物溶液通入毛細(xì)管內(nèi)并用泵浦激發(fā)。待測(cè)分子數(shù)量的多少?zèng)Q定了固定在光學(xué)微腔表面的HRP 數(shù)量，HRP酶的數(shù)量又決定了催化底物產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的效率，具體表現(xiàn)為激光出射時(shí)間的長(zhǎng)短，如圖1(c)所示。因此，通過(guò)測(cè)量激光出射時(shí)間，就能夠完成對(duì)待測(cè)物的傳感。

圖1 微流激光ELISAFigure 1 Optpfluidic laser-based ELISA

基于同樣的表面固定原理，Mao 等[17]探索了表面位點(diǎn)對(duì)檢測(cè)性能的影響，實(shí)現(xiàn)了基于光纖微流激光的HRP 檢測(cè)。以一次性空心光纖（hollow optical fiber, HOF）作為光學(xué)微腔，研究了納米粒子對(duì)傳感靈敏度的提升作用。將HOFs 生物素化處理后分為3 組，包括對(duì)照組、Au 納米棒和SiO2納米顆粒組，如圖2(a)所示。其中，Au 納米棒和SiO2納米顆粒組的表面更豐富，可提供更多的SAv-HRP 結(jié)合位點(diǎn)，這也導(dǎo)致了HOFs 的表面體積比發(fā)生變化。再用緩沖液稀釋成不同濃度的HRP 通入3 組具有不同表面體積比的HOFs 內(nèi)孵育，SAv-HPR分子與表面位點(diǎn)特異性結(jié)合形成亞單分子層覆蓋在HOFs 的內(nèi)表面。向處理好的HOFs 內(nèi)通入無(wú)色底物溶液，HPR 酶會(huì)與無(wú)色底物溶液發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生增益介質(zhì)。在相同催化時(shí)間下，增益介質(zhì)的濃度取決于光纖表面固定的SAv-HPR 分子數(shù)量，因此在一定的實(shí)驗(yàn)裝置以及光學(xué)微腔下，孵育固定的SAv-HRP 分子數(shù)目決定激光的輸出。研究表明，SAv-HRP 分子的濃度與30 min 時(shí)激光的積分強(qiáng)度之間有較好的線性關(guān)系。如圖2(b) 所示，納米粒子對(duì)傳感靈敏度的提升作用顯著。當(dāng)Au 納米棒存在時(shí)，傳感靈敏度提升了23.3%；在SiO2納米棒存在時(shí)，傳感靈敏度提升了57.4%。為排除通過(guò)非特異性吸附到光纖內(nèi)壁的SAv-HRP 分子對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，該工作設(shè)置了空白組，無(wú)激光激發(fā)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明通過(guò)非特異性吸附到光學(xué)微腔內(nèi)表面的分子數(shù)量是可以忽略的。

圖2 基于空心光纖的HRP 檢測(cè)Figure 2 HRP detection based on hollow fiber

待測(cè)物除了結(jié)合在光學(xué)微腔表面外，還可以在體溶液中進(jìn)行檢測(cè)。例如，Gong 等[18]提出酶催化微流激光，實(shí)現(xiàn)了高性能的離子傳感。酶催化微流激光的實(shí)驗(yàn)裝置如圖3(a) 所示，用兩塊高反鏡平行放置構(gòu)成法珀腔，位于兩塊高反鏡之間的方形石英毛細(xì)管作為微流通道實(shí)現(xiàn)液體流入和流出。在酶催化微流激光傳感器中，采用HRP 催化無(wú)熒光透明底物生成的熒光產(chǎn)物作為微流激光器的增益介質(zhì)。硫離子會(huì)抑制HRP 的活性，從而間接地影響激光發(fā)射進(jìn)程，反應(yīng)體系中硫離子的濃度越高，則酶的活性越低，熒光產(chǎn)物濃度增加速率放緩，使激光出射時(shí)間延長(zhǎng)，如圖3(b) 和3(c) 所示，激光出射時(shí)間與反應(yīng)體系中硫離子的濃度相關(guān)，則通過(guò)測(cè)量激光出射時(shí)間，可實(shí)現(xiàn)硫離子的濃度傳感。最終實(shí)現(xiàn)了探測(cè)下限為10 nM，動(dòng)態(tài)范圍為3個(gè)量級(jí)的硫離子濃度傳感，如圖3(d) 所示。

圖3 酶催化微流激光用于硫離子傳感。(a) 微流激光離子傳感器裝置示意圖；(b) 酶催化微流激光傳感原理示意圖；(c) 激光輸出強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系曲線；(d) 硫離子標(biāo)定曲線Figure 3 Enzyme catalyzed optofluidic laser for sulfur ion sensing.(a) Schematic diagram of optofluidic laser ion sensor device;(b)schematic diagram of enzyme catalyzed optofluidic laser sensing principle; (c) relation curve between laser output intensity and time; (d)calibration curve of sulfur ion

1.2 基于增益分子狀態(tài)變化實(shí)現(xiàn)生化傳感

在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）傳感原理中，當(dāng)一個(gè)熒光分子（又稱(chēng)為供體分子）的發(fā)射峰與另一個(gè)熒光分子（又稱(chēng)為受體分子）的吸收峰重疊時(shí)，供體分子可將能量轉(zhuǎn)移給受體分子使供體分子光強(qiáng)減弱，受體分子發(fā)光。傳統(tǒng)的FRET轉(zhuǎn)換效率受分子間距離調(diào)控，工作距離僅在10 nm 以?xún)?nèi)。在微流激光中，將供體-受體對(duì)置于光學(xué)微腔內(nèi)，并以此實(shí)現(xiàn)激光發(fā)射。將供體和受體分別交聯(lián)于蛋白質(zhì)等大分子的兩端。當(dāng)生物大分子發(fā)生形態(tài)變化時(shí)，供體和受體之間的距離會(huì)發(fā)生變化，能量轉(zhuǎn)移效率改變，影響輸出光的波長(zhǎng)成分。通過(guò)分析輸出光的光譜，便可通過(guò)供受體之間的波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換效率來(lái)反映蛋白質(zhì)的形態(tài)變化。Fan 團(tuán)隊(duì)[19]在Holliday 結(jié)構(gòu)DNA 的4 個(gè)臂上分別交聯(lián)青色素染料Cy3 和Cy5分子作為供體/受體對(duì)，當(dāng)鎂離子濃度增加時(shí)，Holliday 結(jié)構(gòu)DNA 逐漸折疊，轉(zhuǎn)化為堆疊的X 型結(jié)構(gòu)，如圖4(a) 所示。Cy3 和Cy5 分子間的距離減小，能量轉(zhuǎn)換效率變大。波長(zhǎng)逐漸從Cy3 發(fā)射峰轉(zhuǎn)移至Cy5 發(fā)射峰。通過(guò)檢測(cè)Cy3 和Cy5 的輸出波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換比例，可精確地反映樣本中鎂離子的濃度，如圖4(b) 所示。此外，利用波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換的特性，該團(tuán)隊(duì)還制作出可完全由生物方法調(diào)節(jié)輸出波長(zhǎng)的激光器，通過(guò)調(diào)節(jié)鎂/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液的比例，使得激光器的輸出在兩種波長(zhǎng)之間切換，且輸出波長(zhǎng)切換是可逆并可重復(fù)進(jìn)行的。

圖4 Holliday 結(jié)構(gòu)DNA 用于鎂離子檢測(cè)Figure 4 Holliday structure DNA for magnesium ion detection

通過(guò)控制增益分子的激發(fā)/淬滅狀態(tài)，也可以實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的傳感。Wu 等[20]利用該原理，基于具有donor-acceptor-donor 結(jié)構(gòu)的富電子染料實(shí)現(xiàn)了用于爆炸物檢測(cè)的微流激光傳感器，完成了對(duì)二硝基甲苯（DNT）的傳感。DNT 在化學(xué)上是缺電子炸藥，與富電子熒光染料相互作用時(shí)會(huì)產(chǎn)生熒光淬滅效應(yīng)。將方形毛細(xì)管夾在2 個(gè)反射率分別為91.5%（上）和99.5%（下）的反射鏡之間，高反鏡提供光反饋，毛細(xì)管作為微流通道，如圖5(a) 所示。將富電子熒光染料與DNT 溶液混合后注入光學(xué)微腔，由于DNT 對(duì)熒光染料的淬滅作用，能正常參與激光發(fā)射的熒光染料分子數(shù)與DNT 的濃度呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)而根據(jù)其激光積分強(qiáng)度來(lái)確定DNT 的濃度。如圖5(b) 所示，該工作實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)下限10 nM，動(dòng)態(tài)范圍超3 個(gè)量級(jí)的高性能傳感。

圖5 基于激光淬滅的爆炸物傳感Figure 5 Explosive sensing based on laser quenching

類(lèi)似地，微流激光也可以與DNA 熔解曲線分析技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)控制染料分子與DNA雙鏈結(jié)合與釋放這兩種狀態(tài)，可以完成對(duì)DNA 堿基失配數(shù)量的判斷。如圖6(a) 所示，當(dāng)染料分子與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合時(shí)具有較強(qiáng)的熒光。隨著溫度的升高，雙鏈DNA 解離成單鏈DNA（ssDNA）。染料從雙鏈DNA 鏈中釋放出來(lái)，其熒光減弱。在DNA 熔解曲線分析中通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度作為溫度的函數(shù)，得到DNA 熔解曲線，該曲線取決于兩條結(jié)合DNA 鏈之間的親和力，親和力又取決于DNA 的長(zhǎng)度和序列，以及堿基錯(cuò)配的數(shù)量。通過(guò)對(duì)比熔解曲線，就可以判斷出堿基失配的數(shù)量。Lee 等[21]利用激光腔提供的光反饋來(lái)放大熱動(dòng)力學(xué)差異，將DNA 樣本和飽和染料放置在微流激光器微腔中進(jìn)行腔內(nèi)檢測(cè)，如圖6(b) 所示。用激光代替熒光作為傳感信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了單堿基失配DNA 的區(qū)分，如圖6(c) 和6(d) 所示。

圖6 基于微流激光的DNA 熔解曲線分析技術(shù)。(a) DNA熔解曲線分析原理圖；(b) 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖；(c) 溫度與激光閾值的關(guān)系；(d) 溫度與輸出激光強(qiáng)度的關(guān)系Figure 6 DNA melting curve analysis technology based on optofluidic laser.(a)DNA melting curve analysis schematic diagram; (b) schematic diagram of experimental device; (c) relationship between temperature and laser threshold; (d)relationship between temperature and output laser intensity

2 基于微腔調(diào)節(jié)的微流激光生化傳感技術(shù)

在微流激光生化傳感中，可以通過(guò)對(duì)微腔進(jìn)行調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)傳感。目前基于微腔調(diào)節(jié)的微流激光生化傳感技術(shù)主要分為兩種：一種是調(diào)節(jié)諧振腔的尺寸，另一種是調(diào)節(jié)諧振腔的結(jié)構(gòu)。諧振腔的改變會(huì)引起諧振頻率或波長(zhǎng)改變，標(biāo)定其與被測(cè)物濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可實(shí)現(xiàn)對(duì)被測(cè)物濃度的定量檢測(cè)。

2.1 基于諧振腔尺寸變化實(shí)現(xiàn)傳感

在基于諧振腔尺寸變化實(shí)現(xiàn)生化傳感中，可以通過(guò)機(jī)械手段對(duì)諧振腔進(jìn)行拉伸，改變諧振腔的大小，實(shí)現(xiàn)激光波長(zhǎng)的調(diào)節(jié)，構(gòu)建可調(diào)諧微流激光器。Tang 等[22]利用高Q 值的微泡腔，成功構(gòu)建了閾值為7.8 μJ/cm2、線寬約為0.1 nm 的微流激光器，如圖7(a) 所示。用共軛聚合物（CN-PPV）作為增益材料，通過(guò)橫向拉伸諧振腔，實(shí)現(xiàn)對(duì)諧振頻率的微調(diào)，構(gòu)建可調(diào)諧微流激光器。

圖7 通過(guò)諧振腔尺寸變化實(shí)現(xiàn)傳感Figure 7 Sensing by changing the size of the resonator

微流激光器具有利用機(jī)械拉伸實(shí)現(xiàn)激光頻率調(diào)諧的潛力。機(jī)械拉伸可改變空心氣泡諧振腔的尺寸，通過(guò)對(duì)回音壁模式（WGM）微腔的幾何邊界條件改變與應(yīng)變誘導(dǎo)折射率改變，實(shí)現(xiàn)對(duì)諧振波長(zhǎng)的微調(diào)。將諧振腔的一端用UV 膠固定，另一端用儀器對(duì)其進(jìn)行拉伸。研究發(fā)現(xiàn)，微流激光器的波長(zhǎng)隨著毛細(xì)管的拉伸發(fā)生漂移，如圖7(b) 所示。當(dāng)拉伸長(zhǎng)度超過(guò)54 μm時(shí)，激光波長(zhǎng)可超出自由光譜范圍。盡管拉伸長(zhǎng)度較長(zhǎng)，但輸出的激光強(qiáng)度穩(wěn)定且持久。共軛聚合物因其優(yōu)異的光穩(wěn)定性、較大的消光系數(shù)和較低的細(xì)胞毒性，在生物分析與成像方面引起了廣泛關(guān)注。與典型的染料激光器相比，微泡腔中共軛聚合物填充的微流激光器具有更好的光穩(wěn)定性，可增加生化分析的可靠性與靈敏度，為微流激光器在生物傳感和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展提供了可能。

2.2 基于諧振腔結(jié)構(gòu)變化實(shí)現(xiàn)生化傳感

在基于諧振腔結(jié)構(gòu)變化實(shí)現(xiàn)生化傳感中，可以通過(guò)改變分子取向?qū)崿F(xiàn)生化傳感[23]。Li等[24]提出了一種基于WGM 的新型液晶微光纖生物傳感器，通過(guò)改變液晶分子取向，引起微腔結(jié)構(gòu)變化，激光波長(zhǎng)發(fā)生漂移。通過(guò)波長(zhǎng)的漂移量可以表征脂肪酶濃度。

液晶光纖的基底材料為聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），表面為一層4-氰基-4′-戊基聯(lián)苯（5CB）分子。微光纖表面的甘油三油酸酯在脂肪酶的催化下生成油酸。一般情況下，因?yàn)楦视腿退狨サ氖杷圆荒茉谝壕П砻孀园l(fā)形成一層單分子層，使液晶分子處于平面排列狀態(tài)，如圖8(a) 與8(b) 所示。當(dāng)脂肪酶存在于溶液中時(shí)，生成油酸，使得液晶分子取向由平面排列變?yōu)榇怪迸帕?，如圖8(c) 所示。由于液晶分子的各向異性，當(dāng)液晶分子取向改變時(shí)，介電常數(shù)會(huì)發(fā)生改變，使諧振波長(zhǎng)發(fā)生漂移。因此，通過(guò)波長(zhǎng)的漂移量可表征脂肪酶濃度，檢測(cè)下限為0.01 μg/mL，如圖10(d) 所示?；赪GM 的液晶微光纖微流激光可以靈敏地響應(yīng)微腔結(jié)構(gòu)的變化，將波長(zhǎng)漂移量作為傳感參量，實(shí)現(xiàn)對(duì)脂肪酶濃度的檢測(cè)。

圖8 脂肪酶與甘油三油酸酯發(fā)生酶促反應(yīng)前后液晶光纖中5CB 分子取向示意圖。(a)～(b) 平面取向；(c) 垂直取向；(d) 波長(zhǎng)漂移量與脂肪酶濃度變化的關(guān)系Figure 8 Orientation of 5CB molecule in liquid crystal optical fiber before and after the enzymatic reaction between lipase and triglyceride.(a)～(b) Plane orientation; (c) vertical orientation; (d) relationship between wavelength shift and lipase concentration

3 基于損耗調(diào)節(jié)的微流激光生化傳感技術(shù)

在微流激光生化傳感的應(yīng)用中，除了檢測(cè)增益介質(zhì)、微腔的變化之外，也可以通過(guò)微腔內(nèi)不同的損耗實(shí)現(xiàn)傳感。與待測(cè)物相關(guān)聯(lián)的物質(zhì)對(duì)激光產(chǎn)生吸收或散射效應(yīng)，會(huì)使激光強(qiáng)度下降，從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的傳感。目前基于損耗調(diào)節(jié)的微流激光傳感技術(shù)主要分為兩種：一是基于散射損耗傳感，二是基于吸收損耗傳感。激光腔增強(qiáng)了光和物質(zhì)的相互作用，可放大吸收損耗和散射損耗，進(jìn)而提升傳感的靈敏度。

3.1 基于散射損耗實(shí)現(xiàn)生化傳感

在傳統(tǒng)的免疫比濁法中，抗體與其抗原混合形成抗原抗體復(fù)合物（AACs）。在促聚劑的作用下從液相析出，形成懸浮于液相中的微顆粒，溶液會(huì)出現(xiàn)一定的濁度，對(duì)光有吸收、散射和反射作用，使光強(qiáng)減弱。Yang 等[25]將微流激光技術(shù)與免疫比濁法結(jié)合，提出微流激光免疫比濁法，如圖9(a) 所示。在抗體過(guò)量的情況下，抗原濃度不同，形成的AACs 的尺寸和濃度也隨之發(fā)生變化，產(chǎn)生的損耗也不同，則可通過(guò)檢測(cè)光強(qiáng)來(lái)表征抗原濃度（如圖9(b) 所示）。利用光學(xué)微腔和激光增強(qiáng)了光與物質(zhì)的相互作用，實(shí)現(xiàn)了高靈敏的蛋白質(zhì)傳感。以激光強(qiáng)度作為傳感參量，實(shí)現(xiàn)了5 個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍，以及0.18 pg/mL 的極低檢測(cè)下限。與傳統(tǒng)單次透射法和腔增強(qiáng)熒光法相比，微流激光免疫比濁法得益于微腔和激光的放大作用，具有較高的檢測(cè)靈敏度。

圖9 微流激光免疫比濁法Figure 9 Optofluidic laser immunoturbidimetry

此外，Yang 等[25]在研究一次性微流激光傳感器時(shí)，也采取了散射損耗調(diào)節(jié)的方案。將IgG 標(biāo)準(zhǔn)溶液與Tris-PEG 緩沖液混合并孵育，記為A 溶液。再將抗體溶液加入A 溶液中，孵育并靜置，獲得免疫復(fù)合物懸浮液，記為B 溶液，最后將RhB 溶液與B 溶液按1∶9 的體積比混合，吸入HOF，立即記錄激光輸出?？乖涂贵w特異性結(jié)合，并在PEG 的輔助下形成不溶于水的免疫復(fù)合物，如圖10(a) 所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，免疫復(fù)合物的大小和濃度都會(huì)增加。當(dāng)免疫復(fù)合物的尺寸達(dá)激光波長(zhǎng)的1/30～1/6 時(shí)，根據(jù)瑞利散射理論和Beer-Lambert定律，HOF 內(nèi)的免疫復(fù)合物引起吸收、散射和反射損耗以衰減激光輸出，以激光強(qiáng)度作為傳感輸出，可以在10 min 內(nèi)完成蛋白質(zhì)檢測(cè)，如圖10(b) 所示。

圖10 基于微流激光的一次性免疫傳感Figure 10 Disposable immunosensor based on optofluidic laser

3.2 基于吸收損耗實(shí)現(xiàn)生化傳感

通過(guò)吸收損耗調(diào)節(jié)激光輸出特性實(shí)現(xiàn)傳感，也是實(shí)現(xiàn)微流激光生化傳感的一個(gè)途徑。不同濃度的待測(cè)物對(duì)激光的吸收能力不同，對(duì)比激光通過(guò)待測(cè)物前后的強(qiáng)度就可以完成對(duì)待測(cè)物的傳感。為產(chǎn)生較強(qiáng)的吸收損耗，通常將激光波長(zhǎng)優(yōu)化至待測(cè)物的吸收帶?；诖耍珿ong等[26]實(shí)現(xiàn)了分布式光纖微流激光器，用于高通量生化傳感。利用沿光纖軸向連續(xù)分布的微環(huán)諧振腔作為一維光源，在其上方集成5 根方形石英毛細(xì)管作為樣品通道，如圖11(a) 所示。光纖出射的激光可以被毛細(xì)管內(nèi)部的反應(yīng)物吸收，導(dǎo)致透過(guò)毛細(xì)管后攝像機(jī)接受到的激光強(qiáng)度下降。通過(guò)計(jì)算分布式光纖微流激光器輸出信號(hào)的透射率變化，就可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每個(gè)通道的反應(yīng)過(guò)程[20]。根據(jù)重吸收效應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)下方光纖激光器增益介質(zhì)的濃度可以實(shí)現(xiàn)輸出波長(zhǎng)調(diào)節(jié)，使其與上方方形石英毛細(xì)管中產(chǎn)物的吸收峰相對(duì)應(yīng)。在方形石英管中，放置HRP 酶和無(wú)色底物TMB 的混合物，二者混合后會(huì)逐漸變成藍(lán)色，其吸收強(qiáng)度會(huì)隨著反應(yīng)的進(jìn)行而增大，根據(jù)Beer-Lambert 定律，傳感通道的透射率減小。以透射率降低到初始值的90%的時(shí)間作為傳感信號(hào)。圖11(b) 為不同HRP 濃度下，歸一化光透過(guò)率隨反應(yīng)時(shí)間變化的關(guān)系曲線。結(jié)果表明，該方法通過(guò)調(diào)節(jié)吸收損耗，成功實(shí)現(xiàn)了14 pM 的檢測(cè)下限，并實(shí)現(xiàn)了陣列化的酶濃度傳感。

圖11 分布式光纖微流激光用于高通量傳感Figure 11 Distributed fiber microfluidic laser for high throughput sensing

4 結(jié) 語(yǔ)

本文綜述了微流激光生化傳感的主要機(jī)理，并從增益分子、微腔、損耗3 個(gè)角度闡釋了微流激光的傳感原理。利用增益分子的數(shù)目和狀態(tài)變化，微腔的尺寸與形狀變化，激光的散射與吸收損耗等都可以完成高靈敏度的生化傳感。微流激光傳感相對(duì)于傳統(tǒng)的熒光傳感而言，在信號(hào)產(chǎn)生原理和輸出特性上有著本質(zhì)的不同，這使得微流激光在靈敏度、光譜復(fù)用度、成像空間分辨率和生物相容性等方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。微流激光技術(shù)與最新的生化檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，有望開(kāi)拓出更多新的應(yīng)用領(lǐng)域。