鄭鳳家 ,劉 娜 ,王 林 ,焦燕妮 ,李 蔚 ,李鳳華 ,姜大峰,王翠翠

(1.山東省疾病預(yù)防控制中心,濟(jì)南 250014;2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,濟(jì)南 250101;3.山東省立醫(yī)院,濟(jì)南 250014)

美羅培南是新一代人工合成的碳青霉烯類抗生素,具有超廣譜抗菌活性和時(shí)間依賴性[1]。測(cè)定一定時(shí)間間隔內(nèi)血液中美羅培南的濃度,可用于多重耐藥菌引起的重癥感染患者給藥方案的優(yōu)化[2-4],指導(dǎo)臨床用藥時(shí)間。

目前,測(cè)定美羅培南的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[5]、液相色譜-質(zhì)譜法等[6];前處理方法有固相萃取[7]、液液萃取等[8],但這些前處理方法存在操作復(fù)雜、分析時(shí)間長、樣品需求量多、分析結(jié)果誤差較大等缺點(diǎn)[9-10]。分散液相微萃取技術(shù)具有節(jié)約試劑、綠色友好、簡便快速的優(yōu)點(diǎn),常被用于生物樣品、農(nóng)藥殘留、重金屬提取等[11-13]。針對(duì)嬰兒取血量少、易產(chǎn)生誤差的特點(diǎn),本工作以甲硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo),建立了分散液相微萃取-HPLC 測(cè)定嬰幼兒血清中美羅培南含量的方法,以期快速監(jiān)測(cè)嬰兒血清中美羅培南的濃度,為優(yōu)化給藥方案提供一定的參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

3-嗎啡丙磺酸(MOPS)緩沖液(pH 7.0):稱取MOPS標(biāo)準(zhǔn)品3.140 g,用水稀釋至1 L,再用0.5 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至7.0。

MOPS穩(wěn)定劑:稱取MOPS標(biāo)準(zhǔn)品2.615 g,用水稀釋至25 mL,混勻,再用0.5 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至6.8后,將其轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中,加入12.5 mL 乙二醇,用水稀釋至刻度,混勻,于4 ℃保存。

美羅培南標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:500 mg·L－1,稱取美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg 于10 mL 容量瓶中,用MOPS穩(wěn)定劑溶解并稀釋至刻度,于－18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液:50 mg·L－1,稱取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg于100 mL 容量瓶中,用乙腈溶解并稀釋至刻度,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

美羅培南標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于98%,甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于99%,MOPS 標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.5%;甲醇和乙腈均為色譜純;氫氧化鈉、乙二醇均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Welch C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫35 ℃;流動(dòng)相為體積比1∶9的MOPS緩沖液(pH 7.0)-乙腈混合液;流量0.8 mL·min－1;進(jìn)樣量10μL;檢測(cè)波長300 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

移取經(jīng)美羅培南藥物治療24 h后的嬰兒全血200μL,以轉(zhuǎn)速5 000 r·min－1離心5 min,取血清100μL,加入內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液50μL 和乙腈100μL,渦旋20 s,以轉(zhuǎn)速12 000 r·min－1離心5 min,取全部上清液,加入100μL二氯甲烷,渦旋20 s,再以轉(zhuǎn)速12 000 r·min－1離心5 min,取上清液10μL 供HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對(duì)美羅培南質(zhì)量濃度為50 mg·L－1、甲硝唑質(zhì)量濃度為25 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和嬰兒血清樣品進(jìn)行測(cè)定,所得色譜圖見圖1。

看不出這爿店，總算替她爭(zhēng)回了面子，不然把他帶到這么個(gè)破地方來——敲竹杠又不在行，小廣東到上海，成了“大鄉(xiāng)里”。其實(shí)馬上槍聲一響，眼前這一切都粉碎了，還有什么面子不面子？明知如此，心里不信，因?yàn)槿裨诳咕苤?，第一是不敢朝這上面去想，深恐神色有異，被他看出來。

圖1 色譜圖Fig.1 Chromatograms

2.2 流動(dòng)相的選擇

針對(duì)美羅培南和甲硝唑在C18色譜柱上均可保留且達(dá)到基線分離的特點(diǎn),試驗(yàn)選擇C18色譜柱為固定相。由于流動(dòng)相的比例對(duì)目標(biāo)物的分離和檢測(cè)的靈敏度有重要影響,試驗(yàn)以 MOPS 緩沖液(pH 7.0)-乙腈混合液為流動(dòng)相,考察了不同比例[MOPS緩沖液(pH 7.0)與乙腈的體積比分別為1∶7,1∶8,1∶9]的流動(dòng)相對(duì)嬰兒血清樣品中美羅培南和內(nèi)標(biāo)分離效果的影響。

結(jié)果顯示:當(dāng)MOPS緩沖液(pH 7.0)-乙腈的體積比為1∶7,1∶8時(shí),美羅培南的保留時(shí)間較短;當(dāng)MOPS緩沖液(pH 7.0)-乙腈的體積比為1∶9時(shí),美羅培南和甲硝唑的保留時(shí)間合適,分離效果好。因此,試驗(yàn)選擇的流動(dòng)相為體積比1∶9 的MOPS緩沖液(pH 7.0)-乙腈混合液。

2.3 萃取劑的選擇

按照試驗(yàn)方法考察了萃取劑分別為甲醇、乙腈時(shí)對(duì)嬰兒血清加標(biāo)樣品(加標(biāo)量為50 mg·L－1)中美羅培南回收率的影響。

結(jié)果顯示:以甲醇為萃取劑時(shí),美羅培南的回收率僅為18.6%,無法有效萃取美羅培南;以乙腈為萃取劑時(shí),美羅培南的回收率為98.6%,滿足測(cè)定要求,同時(shí)乙腈具有沉淀血清中蛋白質(zhì)的作用,可以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。因此,試驗(yàn)選擇的萃取劑為乙腈。

2.4 分散劑的選擇

按照試驗(yàn)方法考察了分散劑分別為二氯甲烷、三氯甲烷時(shí)對(duì)嬰兒血清加標(biāo)樣品(加標(biāo)量為50 mg·L－1)中美羅培南回收率的影響。

結(jié)果顯示,以二氯甲烷、三氯甲烷為分散劑時(shí),美羅培南的回收率分別為98.2%和99.3%,均表現(xiàn)出良好的分散效果?？紤]到三氯甲烷的毒性較強(qiáng),試驗(yàn)選擇以二氯甲烷為分散劑,并進(jìn)一步考察了二氯甲烷用量為50,75,100,150,200μL 時(shí)對(duì)美羅培南回收率的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 二氯甲烷用量對(duì)美羅培南回收率的影響Fig.2 Effect of methylene chloride amount on recovery of meropenem

結(jié)果顯示:隨著二氯甲烷用量的增加,美羅培南的回收率逐漸增大;當(dāng)二氯甲烷用量為100～200μL時(shí),目標(biāo)物的回收率基本保持不變,并且分散效果均較好。考慮到在保證萃取效率的前提下,應(yīng)盡量減少分散劑使用體積,以增大濃縮倍數(shù),試驗(yàn)選擇二氯甲烷的用量為100μL。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

血清樣品基質(zhì)復(fù)雜,對(duì)目標(biāo)物的分離會(huì)產(chǎn)生一定的基質(zhì)效應(yīng),試驗(yàn)選擇與美羅培南結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似的甲硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo),對(duì)美羅培南質(zhì)量濃度為5,10,50 mg·L－1的空白血清樣品基質(zhì)加標(biāo)溶液和相同質(zhì)量濃度的美羅培南標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,采用相對(duì)響應(yīng)值法,按照基質(zhì)效應(yīng)＝樣品基質(zhì)加標(biāo)溶液響應(yīng)值/標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值×100%[14]來計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示,基質(zhì)效應(yīng)分別為92.6%,99.4%,103.1%,說明采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法來制作工作曲線,內(nèi)標(biāo)法定量能夠降低基質(zhì)干擾對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

2.6 工作曲線和檢出限

移取適量的美羅培南標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液,用空白血清逐級(jí)稀釋,配制成美羅培南質(zhì)量濃度為0.25,0.50,1,2,5,10,25,50,100 mg·L－1,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為25 mg·L－1的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照儀器工作條件對(duì)上述溶液進(jìn)行測(cè)定,以美羅培南的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果顯示:美羅培南工作曲線的線性范圍為0.25～100 mg·L－1,線性回歸方程為y＝1.542×10－1x－2.116×10－2,相關(guān)系數(shù)為0.999 0。

對(duì)空白血清加標(biāo)樣品進(jìn)行測(cè)定,當(dāng)信號(hào)響應(yīng)值為3倍噪聲值時(shí),將該質(zhì)量濃度作為檢出限,結(jié)果得檢出限為0.06 mg·L－1。

2.7 精密度與回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)空白血清樣品進(jìn)行低(0.50 mg·L－1)、中(5 mg·L－1)、高(100 mg·L－1)等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平取6份血清,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n=6)

2.8 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)15名經(jīng)靜脈給予注射美羅培南的嬰幼兒靜脈血進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,美羅培南的測(cè)定值為19.2～98.9 mg·L－1。由于不同兒童個(gè)體的代謝差異較大,因此須對(duì)美羅培南藥物進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè),進(jìn)而指導(dǎo)臨床用藥。另外,由于美羅培南結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺,在水中會(huì)被堿性物質(zhì)催化后水解開環(huán),因此在試驗(yàn)中注意美羅培南標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,并且盡可能在短時(shí)間內(nèi)完成樣品檢測(cè),若樣品采集后無法立即測(cè)定,應(yīng)離心后冷凍保存[6]。

本工作建立了分散液相微萃取-HPLC 測(cè)定嬰幼兒血清中美羅培南含量的方法,該方法分析快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度好,并且減少了有機(jī)試劑的用量,環(huán)境友好,可滿足臨床上微量血清的檢測(cè)需求,為指導(dǎo)臨床用藥提供了一定的參考。