薛麗會，宋宏宇，高 旗，李 爽，趙晨蕾，白 楊，張博男,3,4, ，齊亞娟,3,4,

（1.華北理工大學藥學院，河北唐山 063210；2.華北理工大學基礎醫(yī)學院，河北唐山 063210；3.唐山市新藥基礎研究重點實驗室，河北唐山 063210；4.河北省慢性病重點實驗室，河北唐山 063210）

糖尿病是一種以高血糖為主要臨床特征的代謝性疾病，其發(fā)病機制與人口老齡化、肥胖、遺傳因素及不當?shù)纳罘绞降榷喾N因素密切相關(guān)[1?2]。我國糖尿病患者已有1.14億之多，已成為世界上的糖尿病大國[3?4]。糖尿病患者的血糖若長期控制不好，會出現(xiàn)血管、心、肝、腎及眼病等多器官并發(fā)癥[5]。其中，糖尿病并發(fā)的肝臟損傷一般由于血糖、脂肪、蛋白質(zhì)或水電解質(zhì)紊亂引發(fā)炎癥和氧化應激反應等，進而導致肝功能及肝臟糖脂代謝異常[6?8]，臨床上若糖尿病患者不能很好控制血糖，會誘發(fā)肝臟損傷甚至發(fā)展成肝硬化或肝癌。但目前還沒有針對糖尿病并發(fā)肝損傷的特效藥物[9?10]，如何防治糖尿病及其肝臟并發(fā)癥仍是醫(yī)學難題。

百合烏藥湯（Baihe Wuyao Decoction, BWD）由百合和烏藥組成，配比10:3，始載于清代陳修園所著的《醫(yī)學三字經(jīng)》，主用于治療淺表性胃炎[11]。百合是一種藥食同源的中藥，《中國藥典》2020年版規(guī)定的百合為百合科植物卷丹Lilium lancifoliumThunb.、百合Lilium browniiF.E.Brown var.ViridulumBaker或細葉百合Lilium pumilumDC.的干燥肉質(zhì)鱗葉，百合養(yǎng)陰潤肺，清心安神。用于陰虛燥咳、勞嗽咳血、虛煩驚悸、失眠多夢、精神恍惚[12]。烏藥始載于唐代《本草拾遺》，是一種傳統(tǒng)的理氣中藥，《中國藥典》2020年版規(guī)定烏藥為樟科植物烏藥Lindera aggregata（Sims）Kos-term.的干燥塊根，功能與主治包括行氣止痛，溫腎散寒。用于寒凝氣滯、胸腹脹痛、氣逆喘急、膀胱虛冷、遺尿尿頻、疝氣疼痛、經(jīng)寒腹痛[12]。為確定大劑量食用烏藥是否存在安全隱患，根據(jù)《保健食品安全性毒理學評價程序和檢驗方法規(guī)范》的要求，有學者[13?14]對烏藥進行了系列毒理試驗，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：烏藥經(jīng)口LD50>10.0 g/kg體重，微核試驗、精子畸形試驗、Ames試驗均表現(xiàn)為陰性，因此得出實驗結(jié)論：烏藥屬實際無毒，無致突變性。現(xiàn)代研究表明，百合及烏藥具有保肝、降膽固醇和降血糖[9]、抗炎[9?10]、抗凋亡[11]和抗氧化[15?17]等作用。研究發(fā)現(xiàn)BWD對CCl4誘發(fā)的慢性肝損傷和肝纖維化具有很好療效[18]，但BWD對1型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus, T1DM）及其并發(fā)的肝損傷是否具有保護作用尚無報道。

本研究采用STZ誘導小鼠T1DM并發(fā)肝損傷后，考察BWD對肝功能指標、肝組織中抗氧化指標、炎癥因子和胰島素信號通路的影響，旨在探究BWD對T1DM并發(fā)肝損傷的保護作用及其機制，以揭示T1DM并發(fā)肝損傷的病理機制，以期為進一步研發(fā)BWD的保健作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百合、烏藥 中國唐山唐人藥業(yè)有限公司，由公司專人進行質(zhì)檢，確保中藥飲片質(zhì)量符合規(guī)范。采用傳統(tǒng)水提法[19]，按照10:3的質(zhì)量比例稱重百合與烏藥，將藥材置于容器內(nèi)，加入藥材質(zhì)量8倍量的蒸餾水浸泡40 min，完成浸泡后煎煮1 h，濾過，藥材殘渣再加入原藥材質(zhì)量4倍量的蒸餾水煎煮1 h，再次濾過后，合并兩次濾液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液濃縮，制備濃度分別為2.7、0.9、0.45和0.23 g·mL?1的BWD；SPF級雄性昆明小鼠 6~8周齡，70只，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京華阜康生物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2014~0004；胰島素注射液 江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司；鏈脲佐菌素Streptozotocin（STZ） Cayman公司；0.1 mol·L?1檸檬酸鈉緩沖溶液 Beijing Solarbbio Science & Technology Co.,Ltd.；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒 北京瑞正善達生物工程技術(shù)有限公司；胰島素ELISA檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；Trizol試劑 Invitrogen公司；Promega GoScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒 Promega公司；PCR引物Sangon Biotech（中國分公司）。

VORTE X-5多功能酶標儀 美國伯圖騰儀器有限責任公司；G560E全自動生化分析儀 德國羅氏制藥有限公司；Image Lab4.1 software q-PCR儀Applied biosysterns英國；BX53F顯微鏡 日本OLYMPUS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗分組 昆明小鼠70只隨機分成空白組，模型組，陽性對照組，BWD高、中、低1和低2劑量組，劑量分別為15、5、2.5、1.25 g·kg?1·d?1，每組10只小鼠。

1.2.2 造模及處理 小鼠經(jīng)適應性飼養(yǎng)1周后，禁食不禁水12 h。然后，除空白組外，其余各組小鼠按60 mg·kg?1ip STZ溶液（STZ溶于0.1 mol·L?1檸檬酸緩沖液中，pH4.5，現(xiàn)配現(xiàn)用）[20]，空白組小鼠同法注射檸檬酸緩沖液（10 mL·kg?1）。5 d后，禁食6 h，尾尖采血測血糖，血糖高于16.7 mmol·L?1的小鼠視為造模成功，用于后期實驗。其中，陽性對照組小鼠皮下注射胰島素（0.091 U·kg?1），每天兩次；BWD的高、中、低1和低2劑量組分別灌胃15、5、2.5和1.25 g·kg?1·d-1的BWD；空白組和模型組每天同法灌胃蒸餾水。連續(xù)給藥6周，每2周檢測小鼠血糖和體質(zhì)量，給藥結(jié)束時，小鼠禁食12 h，然后被處死，同時收集血清和肝臟組織凍存于?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血清ALT和AST含量檢測 血清ALT和AST水平采用全自動生化分析儀，根據(jù)試劑盒說明書檢測。

1.2.4 肝組織中的SOD和MDA含量檢測 取肝組織研磨，用生理鹽水稀釋后，按照試劑盒說明書檢測小鼠肝組織中的SOD和MDA含量。

1.2.5 檢測肝臟炎癥因子、凋亡因子、抗氧化指標以及轉(zhuǎn)錄因子等基因mRNA表達 取肝組織利用trizol等試劑提取RNA后，采用Promega GoScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參[18,21]，通過Real-time PCR檢測肝臟組織炎癥相關(guān)因子（包括TNF-α、NF-κB 、IL-1β、IL-6和IL-8）、凋亡因子（包括Bcl2、Bax和CASP3）、氧化應激相關(guān)因子Mn-SOD和iNOS在mRNA水平的表達，PCR引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 檢測肝臟胰島素信號通路AKT的表達 剪取100 mg肝組織，經(jīng)研磨，提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度后進行Western-blot分別檢測p-AKT和AKT在蛋白水平的表達，并以α-tubulin為內(nèi)參[18,21]，用Image J軟件分析目的條帶灰度值，并計算其相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunet t檢驗，以P<0.05為具有統(tǒng)計學意義，P<0.01代表有極顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 BWD對T1DM小鼠的肝臟組織形態(tài)的影響

在顯微鏡下觀察HE染色狀態(tài)下的小鼠肝臟組織形態(tài)，空白組小鼠的肝細胞排列緊實，結(jié)構(gòu)完整；模型組小鼠的肝細胞排列疏松、腫脹，存在氣球樣變性。BWD干預后，小鼠肝臟有不同程度的恢復。BWD高劑量組小鼠肝臟的肝細胞排列較為緊密，結(jié)構(gòu)較完整，有極少量空泡；BWD中劑量組小鼠肝臟的肝細胞排列更加緊密，結(jié)構(gòu)更加完整；BWD低1劑量組小鼠肝臟的肝細胞排列和結(jié)構(gòu)的恢復程度次于前兩個給藥劑量，BWD低2劑量組小鼠肝臟的病理狀態(tài)也得到改善，程度次于前三個給藥劑量組。由此可見，BWD對T1DM小鼠并發(fā)的肝損傷具有保護作用（見圖1）。

圖1 HE染色觀察小鼠肝臟的病理變化Fig.1 HE staining to observe the pathological changes of the liver of T1DM mice

2.2 BWD對T1DM小鼠肝功能的影響

BWD對T1DM小鼠肝功能的影響見圖2，與空白組相比，模型組小鼠血清ALT和AST極顯著升高（P<0.01），提示小鼠肝功能受損；與模型組相比，BWD各劑量組可不同程度的改善小鼠血清ALT和AST水平，BWD高劑量可降低小鼠血清ALT和AST水平（P<0.05），BWD中劑量也可降低小鼠血清ALT和AST水平（P<0.05）且作用效果優(yōu)于BWD高劑量組，BWD低1劑量和低2劑量均可降低小鼠血清ALT和AST水平（P<0.01或P<0.05）；與空白組相比，BWD低1劑量的ALT沒有明顯差異，BWD低2劑量AST和ALT均沒有明顯差異，說明其恢復至正常水平。結(jié)合HE染色結(jié)果，可以得出BWD對T1DM小鼠并發(fā)肝損傷具有改善作用，綜合來看，BWD低1劑量組藥效較好，因此，后續(xù)實驗選用BWD低1劑量組進行探討。

圖2 百合烏藥湯對1型糖尿病小鼠血清ALT和AST的影響（±s, n=10）Fig.2 Effect of BWD on serum ALT and AST in T1DM mice （±s, n=10）

2.3 BWD對T1DM小鼠肝臟抗氧化能力的影響

與空白組相比，模型組小鼠肝臟勻漿中SOD水平明顯降低，而MDA水平顯著升高（P<0.05）；表明小鼠受到STZ刺激后，抗氧化能力降低。與模型組相比，BWD低1劑量組小鼠肝臟中SOD水平升高（P<0.05），MDA水平下降（P<0.05）。與空白組相比，模型組小鼠肝臟中的Mn-SOD在mRNA水平的表達降低，iNOS在mRNA水平的表達升高，在RNA水平驗證了小鼠抗氧化能力降低。BWD低1劑量可上調(diào)肝臟中Mn-SOD的表達，下調(diào)iNOS的表達（見圖3）。表明BWD低1劑量可增強T1DM小鼠肝臟的抗氧化能力。

2.4 BWD對T1DM小鼠肝臟中多種炎癥因子基因的影響

與空白組小鼠相比，模型組小鼠肝臟中的炎癥因子TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-6和IL-8在mRNA水平的表達均被上調(diào)；與模型組相比，BWD低1劑量顯著降低（P<0.01或P<0.05）以上各炎癥因子mRNA水平的表達（圖4）。揭示BWD低1劑量對T1DM小鼠肝臟具有良好的抗炎作用。

圖4 百合烏藥湯對1型糖尿病小鼠肝臟炎癥因子的影響（±s，n=10）Fig.4 Effect of BWD on inflammation factors in the liver of T1DM mice （±s, n=10）

2.5 BWD對T1DM小鼠肝臟中凋亡因子的影響

當肝臟發(fā)生肝損傷時，也會存在細胞凋亡與細胞增殖異?；顒?，因此采用Q-PCR檢測Bcl2、Bax、CASP3在mRNA水平的表達情況。如圖5所示，與空白組相比，模型組小鼠肝臟Bcl2的基因表達升高，而Bax和CASP3的表達下降，Bcl2/Bax的比例降低，表明在模型小鼠肝臟中細胞凋亡受到抑制。與模型組相比，BWD低1劑量組小鼠肝臟的Bcl2/Bax的比例增加，而CASP3的表達被下調(diào)，表明BWD低1劑量可抑制T1DM小鼠肝臟的細胞凋亡。

圖5 百合烏藥湯對1型糖尿病小鼠肝臟凋亡因子和細胞增殖因子的影響（±s，n=10）Fig.5 Effect of BWD on apoptosis factors and cell proliferation factors in the liver of T1DM mice （±s, n=10）

2.6 BWD對T1DM小鼠肝臟中AKT信號通路的影響

為探討B(tài)WD對T1DM小鼠并發(fā)肝損傷的改善作用是否與胰島素的AKT信號通路有關(guān)，進一步檢測了p-AKT和AKT在蛋白水平的表達（圖6）。與空白組相比，模型組小鼠肝臟中p-AKT/AKT的比值明顯降低，表明胰島素信號通路減弱。而與模型組相比，BWD低1劑量組小鼠肝臟中p-AKT/AKT的比值升高。表明BWD低1劑量可通過影響AKT改善胰島素信號通路保護T1DM小鼠的肝臟。

圖6 BWD對T1DM并發(fā)肝損傷小鼠肝臟中AKT的影響（±s, n=10）Fig.6 Effect of BWD on the AKT in the liver of T1DM mice （xˉ±s, n=10）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)BWD可緩解T1DM小鼠血清ALT和AST水平；改善肝臟病理形態(tài)結(jié)構(gòu)，表明BWD對T1DM并發(fā)的肝損傷具有較好保護作用。在T1DM發(fā)生和發(fā)展過程中存在胰島素抵抗，而胰島素抵抗不僅會導致糖代謝異常，還會引發(fā)脂毒性和氧化應激[22]。當脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生MDA等物質(zhì)時，SOD可清除機體內(nèi)的超氧陰離子自由基，從而保護細胞膜免受損傷，因此，SOD對機體的氧化和抗氧平衡起著重要作用。BWD低1劑量可上調(diào)肝臟組織中SOD的含量，而下調(diào)MDA。此外，BWD低1劑量可增強抗氧化參數(shù)Mn-SOD在mRNA水平的表達，并降低iNOS的表達。表明BWD低1劑量對T1DM并發(fā)的肝損傷保護作用，與抗氧化作用有關(guān)。

當糖尿病并發(fā)肝損傷時，肝細胞中NF-κB通路被激活，從而炎癥因子被大量釋放，進而導致炎癥和氧化應激反應，造成肝細胞功能受損甚至細胞死亡[23]。BWD低1劑量可下調(diào)炎癥因子：TNF-α、NFκB、IL-1β、IL-6和IL-8在mRNA水平的表達，表明BWD低1劑量可通過抗炎作用改善T1DM并發(fā)的肝損傷。

此外，胰島素的PI3K-AKT信號通路可調(diào)控多種生物學進程，特別是細胞增殖、細胞凋亡和糖原代謝，在多種疾病如癌癥、糖尿病、心血管疾病中均會發(fā)生該信號通路的失調(diào)[24]。PI3K受到刺激時可以誘導AKT磷酸化使其激活，而AKT的激活會進一步激活其下游信號通路如NF-κB和Foxo1等，影響氧化應激和炎癥反應[25?26]。在血糖升高的早期，胞核內(nèi)代償性增加的Foxo1可使胰島素基因啟動子（IPF-1/PDX-1）與增強子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合增強，促進β細胞的增殖與分化，進而胰島素會代償性升高[27]。BWD低1劑量可使T1DM小鼠肝臟中p-AKT/AKT的比值升高，改善胰島素抵抗，從而改善T1DM相關(guān)的肝損傷。細胞凋亡的級聯(lián)反應受到Bcl2家族蛋白質(zhì)的嚴格調(diào)控，包括促凋亡的Bax和抗凋亡因子Bcl2[28]。Bcl2通常位于線粒體的外膜上，它抑制細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中，而Bax位于細胞質(zhì)的，并且與Bcl2的活性相反[29]。CASP3是半胱氨酸蛋白酶家族的成員，是細胞凋亡級聯(lián)反應的關(guān)鍵執(zhí)行者[30]。CASP3被前胱天蛋白酶3裂解激活，隨后介導線粒體途徑細胞凋亡[31]。BWD的低1劑量在基因水平上增加了Bcl2/Bax基因表達，下調(diào)CASP3的表達，這表明BWD的低1劑量抑制了T1DM小鼠肝臟的細胞凋亡。

綜上所述，BWD以藥食同源的百合作為主要原料，搭配傳統(tǒng)理氣中藥烏藥，對T1DM并發(fā)的肝損傷具有良好保護作用，其機制與抗炎、抗氧化和改善胰島素抵抗有關(guān)，為進一步研發(fā)BWD奠定了基礎。