李 彤，黃 芳，陳杰東，李文榜，林 岱，郭福川

（福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福建福州 350122）

肥胖是一種由多因素引起的慢性代謝性疾病，其會(huì)引起一系列健康問(wèn)題。隨著人們生活方式的改變，能量攝入和消耗不平衡引起肥胖患病率急劇上升。流行病學(xué)調(diào)查顯示中國(guó)成年人肥胖的患病率為14%，其中男性的患病率為14%，女性為14.1%；腹部肥胖患病率為35.1%，男性患病率為30.7%，女性為32.4%[1]。全球范圍內(nèi)，目前有13億人超重或肥胖[2]，肥胖已經(jīng)成為重要的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。

近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明腸道菌群紊亂與肥胖等代謝性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3?5]，腸道菌群在肥胖中的作用引起人們廣泛關(guān)注。共軛亞油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是亞油酸的同分異構(gòu)體，是具有共軛不飽和雙鍵的亞油酸位置異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的總稱(chēng)[6]。其中cis9、trans11-CLA和trans10、cis12-CLA是兩種主要異構(gòu)體[7]。CLA的主要天然食品來(lái)源是反芻動(dòng)物的肉類(lèi)和乳制品[8]。有研究表明，共軛亞油酸可以在改善肥胖和脂代謝等方面發(fā)揮有益作用[9?12]，但其對(duì)于肥胖的具體機(jī)制和對(duì)健康的影響還有待進(jìn)一步討論。此外，CLA還可通過(guò)增強(qiáng)腸道免疫力，發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)的作用[13]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，腸道沙門(mén)氏菌中的跨膜組氨酸激酶受體PhoQ可作為長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸（如CLA）的受體，而該受體對(duì)于沙門(mén)氏菌在腸道中的定植起到至關(guān)重要的作用[14]，因此推測(cè)CLA可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)受體進(jìn)而影響沙門(mén)氏菌等有害菌在腸道的定植。另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)接種產(chǎn)CLA的干酪乳酸菌可以預(yù)防沙門(mén)氏菌引起的腸道紊亂[15]。因此，CLA可以在一定程度上影響腸道菌群構(gòu)成，但是目前尚未見(jiàn)有關(guān)CLA對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)大鼠脂質(zhì)蓄積的預(yù)防作用以及與腸道菌群關(guān)系的研究報(bào)道。本研究通過(guò)采用脂肪供能比為45%的高脂飼料誘導(dǎo)建立大鼠肥胖模型，采用預(yù)防性給予CLA灌胃的方式，觀(guān)察其對(duì)肥胖大鼠脂質(zhì)蓄積及腸道菌群構(gòu)成的影響，從而為CLA通過(guò)影響腸道菌群進(jìn)而起到預(yù)防肥胖的作用機(jī)制提供線(xiàn)索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SPF級(jí)SD大鼠 40只，6周齡，體重150 g左右，福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心（福建福州，動(dòng)物許可號(hào)：SCXK（閩）2016-0002）；共軛亞油酸 其中c9、t11-CLA占38.6%，t10、c12-CLA占37.8%，其余異構(gòu)體占4.5%，棕櫚酸占4.0%，硬脂酸占2.5%，油酸占9.7%，亞油酸占1.9%，酸值196.9，購(gòu)自青島澳海生物有限公司；總膽固醇測(cè)試盒、甘油三酯測(cè)試盒南京建成生物工程研究所；45%棕櫚油高脂飼料 南通特洛菲飼料科技有限公司（飼料代碼：TP0861A），飼料配方：普通飼料49%，酪蛋白17%，糖10%，棕櫚油20%，纖維素1%，維生素和礦物質(zhì)4%，飼料能量4.3 kcal/g，總能量占比中蛋白質(zhì)為22%，脂肪為45%，碳水化合物為33%。

Satorius BS 224S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；XB160M-SCS電子天平 瑞士Precisa公司；Z323K型臺(tái)式冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)HERMLE公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；其林貝爾XW-80A旋渦混合器上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；Multisakn go酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將40只SPF級(jí)雄性SD大鼠按體重隨機(jī)分為四組，每組10只，除對(duì)照組（ND組）以普通飼料喂養(yǎng)外，其余組均以高脂飼料喂養(yǎng)。其中ND組和高脂模型組（HD組）均灌胃花生油1 g/kg；高脂共軛亞油酸低劑量組（LC組）和高脂共軛亞油酸高劑量組（HC組）分別灌胃以花生油稀釋的0.2%和2%共軛亞油酸1 g/kg BW，共干預(yù)9周。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠自由攝食和飲水，符合福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。

1.2.2 血清和肝臟生化指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)?zāi)瑢⒏鹘M大鼠禁食12 h后，使用干冰麻醉大鼠后心臟采血，血液樣本室溫靜置1 h后，3000 r/min，離心10 min，取血清樣本待測(cè)；將大鼠處死后，剖檢采集肝臟組織、腎周脂肪和睪周脂肪組織，并用電子天平測(cè)定脂肪重量；取肝臟組織樣本，加入無(wú)水乙醇制備10%的肝勻漿，冰水浴條件下進(jìn)行組織勻漿，2500 r/min，離心10 min，取上清液待測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定血清和肝臟樣本中的TC和TAG，計(jì)算各指標(biāo)含量。

1.2.3 糞便微生物提取及16S rDNA測(cè)序 實(shí)驗(yàn)?zāi)o(wú)菌采集大鼠糞便，于?80 ℃保存。采集的糞便樣本委托上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行糞便微生物16S rDNA測(cè)序。測(cè)序過(guò)程如下：提取樣品總DNA后，用細(xì)菌16S rRNA （V3+V4）區(qū)域引物（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和5'-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，15個(gè)循環(huán)（95 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min），最后72 ℃延伸7 min。獲取PCR產(chǎn)物后，用1.8%的瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，然后對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟如下：樣品與磁珠按照1:1混勻后進(jìn)行磁珠篩選片段，35 μL洗脫。向PCR產(chǎn)物中加入50 μL的磁珠，混勻室溫5 min后，置于磁力架上5 min，去上清；加入200 μL的80%乙醇清洗磁珠，室溫30 s后棄上清，重復(fù)此步驟一次；置磁力架上干燥3 min，用37 μL雙蒸水重懸磁珠，室溫孵育2 min，置于磁力架上2 min，吸取35 μL上清至新的PCR管中。電泳結(jié)束后，用ImageJ軟件定量。根據(jù)Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列，結(jié)果以FASTQ文件格式存儲(chǔ)，其中包含測(cè)序序列的序列信息以及其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以Xˉ±SEM表示。多組比較數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)，進(jìn)行單因素方差分析，若方差齊則采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，若方差不齊則采用Dunnet’T3進(jìn)行兩兩比較。不符合正態(tài)分布則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 CLA干預(yù)對(duì)大鼠體重的影響

如圖1A所示，4組大鼠的初始體重?zé)o顯著性差異（P>0.05）。圖2B顯示了各組的體重變化趨勢(shì)，可以看出干預(yù)期間大鼠體重逐漸增加，而HC組在干預(yù)第8周開(kāi)始體重出現(xiàn)下降趨勢(shì)。干預(yù)9周后，與ND組比較，HD組大鼠體重顯著增加（P<0.05）。與HD組相比，HC組大鼠體重顯著降低（P<0.05），而LC組體重并無(wú)顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果表明預(yù)防性給予高劑量CLA可抑制高脂飼料喂養(yǎng)大鼠體重增長(zhǎng)。

2.2 CLA對(duì)SD大鼠內(nèi)臟脂肪重量及血生化指標(biāo)的影響

由表1可見(jiàn)，與ND組相比，高脂飼料誘導(dǎo)可顯著升高大鼠腎周脂肪、睪周脂肪重量，升高血清TC和TAG水平，證實(shí)高脂模型組造模成功。與HD組相比，低劑量CLA干預(yù)對(duì)大鼠腎周脂肪、睪周脂肪重量、血清TAG、肝臟TC和肝臟TAG無(wú)顯著影響（P>0.05），但能降低血清TC水平（P<0.05）；高劑量CLA干預(yù)可顯著降低大鼠腎周及睪周脂肪重量，降低血清TC、TAG和肝臟TC水平（P<0.05），但對(duì)肝臟TAG水平無(wú)顯著影響（P>0.05）。以上結(jié)果表明高劑量CLA可預(yù)防高脂飼料喂養(yǎng)引起的大鼠內(nèi)臟脂肪含量增加。此外，CLA干預(yù)后大鼠血清TC、TAG和肝臟TC水平明顯降低，說(shuō)明CLA同時(shí)可預(yù)防大鼠血清TAG和TC的蓄積，該結(jié)果與其他研究的人群和動(dòng)物研究結(jié)果相近[12,16?19]。

2.3 CLA對(duì)腸道菌群多樣性及結(jié)構(gòu)的作用

2.3.1 腸道菌群的α和β多樣性分析α多樣性反映的是單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性，Chao1和Ace指數(shù)是用于衡量物種豐富度的指標(biāo)，Chao1和Ace指數(shù)越大，說(shuō)明物種的豐富度越高。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明物種多樣性越高。由表2可見(jiàn)，Ace指數(shù)分析顯示，高劑量CLA的菌群多樣性指數(shù)與高脂模型組比較顯著降低（P<0.05），而低劑量CLA的菌群多樣性指數(shù)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P>0.05）；Chao 1指數(shù)分析顯示，高劑量CLA的菌群多樣性與高脂模型組比較顯著降低（P<0.05），而與對(duì)照組的菌群多樣性無(wú)顯著性差異（P>0.05）；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示了各組的腸道菌群多樣性無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明高脂飼料和CLA對(duì)腸道菌群的多樣性無(wú)明顯影響。β多樣性反映了不同組之間的豐度差異，如圖2所示，四組間β多樣性的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高脂模型組和對(duì)照組的腸道菌群組成有顯著性差異（P<0.05），高脂模型組和高劑量CLA組的腸道菌群組成的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明高脂模型組和對(duì)照組的腸道菌群組成有明顯差異，且CLA可以明顯改變受到高脂飼料影響的腸道菌群組成。

2.3.2 腸道菌群組成差異分析 為進(jìn)一步分析四組腸道菌群組成差異，采用LEfSe分析進(jìn)行兩兩比較，ND與HD組相比，在屬水平上，ND組的主要菌群為Alloprevotella（擬普雷沃菌屬）、Prevotellaceae_U CG_001（普雷沃氏菌科_UCG-001）、Ruminococcus_2（瘤胃球菌屬_2），HD組主要菌群為Eubacterium_coprostanoligenes_group（真桿菌屬）、Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）、Corynebacterium_1（棒狀桿菌屬_1）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）（圖3A）；LC與HD組相比，在屬水平上，LC組的主要菌群為Roseburia（羅氏菌屬）、Leptolyngbya_PCC_6406（瘦鞘絲藻屬_PCC_6406）、uncultured_bacterium_f_Clostridium_sp__K4410_MGS_306（未分類(lèi)的梭菌屬），HD組的主要菌群為Psychrobacter（嗜冷桿菌屬）、Corynebacterium_1（棒狀桿菌屬_1）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）（圖3B）；HC與HD組相比，在屬水平上，HC組的主要菌群為Ruminococcaceae_UCG_014（瘤胃球菌科_UCG_014）、Romboutsia（羅姆布茨菌屬）、Bifidobacterium（雙歧桿菌屬），HD組的主要菌群為Escherichia_shigella（大腸志賀氏桿菌屬）、Enterococcus（腸球菌屬）、Corynebacterium_1（棒狀桿菌屬_1）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）（圖3C）。

圖3 LEfSe分析Fig.3 LEfSe analysis

為研究HC組與肥胖相關(guān)的菌群，進(jìn)一步作如圖4所示的屬水平關(guān)鍵腸道菌群相對(duì)豐度，結(jié)果顯示，在屬水平上，HC組顯著升高了Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）、Butyrivibrio（丁酸弧菌屬）、Ruminococcaceae_UCG_014（瘤胃球菌科_UCG_014）等的相對(duì)豐度（P<0.05），顯著降低了Corynebacterium_1（棒狀桿菌屬_1）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）等的相對(duì)豐度。其中，Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）、Butyrivibrio（丁酸弧菌屬）、Ruminococcaceae_UCG_014（瘤胃球菌科_UCG_014）是與短鏈脂肪酸（shortchain fatty acids，SCFA）生成有關(guān)的菌群。Agnieszka等[20]研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者中，Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）豐度顯著低于健康個(gè)體，并與高密度脂蛋白濃度呈正相關(guān)。其可通過(guò)產(chǎn)生SCFA，維持糖脂平衡，減少肥胖的發(fā)生發(fā)展[21]。Ruminococcaceae_UCG_014（瘤胃球菌科_UCG_014）和Butyrivibrio（丁酸弧菌屬）在緩解肥胖發(fā)生發(fā)展同樣發(fā)揮著重要的作用。Ruminococcaceae_UCG_014（瘤胃球菌科_UCG_014）是瘤胃球菌屬家族的一員，據(jù)報(bào)道該菌是SCFA的產(chǎn)生菌[22]，具有緩解高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的作用[23]。Butyrivibrio（丁酸弧菌屬）則是丁酸的產(chǎn)生菌[24]，丁酸可以有效緩解肥胖[25]。以上結(jié)果表明，高劑量CLA可以顯著逆轉(zhuǎn)由于高脂飼料導(dǎo)致的腸道菌群紊亂，增加短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌屬的相對(duì)豐度。

圖4 屬水平關(guān)鍵腸道菌群相對(duì)豐度Fig.4 Bar plots of critical intestinal microbiota on genus level

2.3.3 菌群相對(duì)豐度與肥胖相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析將四組體重、內(nèi)臟脂肪重量和生化指標(biāo)與菌門(mén)和菌屬數(shù)據(jù)作Spearman相關(guān)性分析，如圖5所示，在門(mén)水平上，Bacteroidetes（擬桿菌門(mén)）與血清TAG呈顯著正相關(guān)（P<0.05），Epsilonbacteraeota與體重和睪周脂肪呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），Rokubacteria（棒狀桿菌門(mén)）與腎周脂肪和睪周脂肪呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），Tenericutes（軟壁菌門(mén)）與血清TC呈顯著正相關(guān)（P<0.05），F(xiàn)irmicutes（厚壁菌門(mén)）與血清TAG呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；在屬水平上，Corynebacterium_1（棒狀桿菌屬_1）與體重呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與血清TC呈顯著正相關(guān)（P<0.01），而B(niǎo)ifidobacterium（雙歧桿菌屬）與血清TAG呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），其他菌群與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性無(wú)顯著性差異（P>0.05）。因此，Corynebacterium _1（棒狀桿菌屬_1）可能與肥胖的發(fā)生發(fā)展和血脂異常有關(guān)，而B(niǎo)ifidobacterium（雙歧桿菌屬）能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的血脂異常。

圖5 菌群與肥胖相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between microbiota and obesity-related parameters

3 討論與結(jié)論

在本研究中，高劑量CLA干預(yù)可顯著降低高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠體重和內(nèi)臟脂肪重量（P<0.05），說(shuō)明CLA可預(yù)防高脂飼料誘導(dǎo)的體重和脂肪的增長(zhǎng)。同時(shí)，CLA干預(yù)后大鼠血清TC、TAG及肝臟TC降低，說(shuō)明CLA可預(yù)防體內(nèi)的甘油三酯和膽固醇的蓄積。此外，腸道菌群的結(jié)果顯示高劑量CLA可逆轉(zhuǎn)由高脂飼料導(dǎo)致的腸道菌群紊亂，主要表現(xiàn)在顯著增加產(chǎn)生短鏈脂肪酸的菌屬Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）、Butyrivibrio（丁酸弧菌屬）、Ruminococcaceae_UCG-014（瘤胃球菌科_UCG-014）的相對(duì)豐度，這些菌群在維持腸腔厭氧環(huán)境中有關(guān)鍵作用[26]。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)血清TAG和Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）。Chaplin A等[27]的研究表明CLA干預(yù)未逆轉(zhuǎn)高脂飼料導(dǎo)致的Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）的降低。而本研究顯示CLA能夠顯著升高Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）的相對(duì)豐度，可能是由于該研究采用的是C57BL/6小鼠每日灌胃6 mg/d干預(yù)54 d，與本研究的動(dòng)物品系、干預(yù)劑量和干預(yù)時(shí)間不同所致。Ruminococcaceae_UCG-014（瘤胃球菌科_UCG-014）和Butyrivibrio（丁酸弧菌）在緩解肥胖發(fā)生發(fā)展同樣發(fā)揮著重要的作用。本研究顯示對(duì)照組和高脂模型組組Butyrivibrio（丁酸弧菌）的相對(duì)豐度非常低，而CLA干預(yù)后隨著劑量的升高其相對(duì)豐度越來(lái)越高，提示Butyrivibrio（丁酸弧菌）可能是CLA干預(yù)的特征菌群。以上可知，在高劑量CLA干預(yù)下，腸道中某些與SCFA產(chǎn)生的專(zhuān)性厭氧菌明顯增加，這可能是CLA發(fā)揮抑制肥胖和調(diào)節(jié)血糖的生理基礎(chǔ)之一。此外，兼性厭氧菌相對(duì)豐度的顯著增加是腸道菌群失調(diào)的重要特征之一[26]，本研究發(fā)現(xiàn)在CLA干預(yù)后兼性厭氧菌的相對(duì)豐度明顯降低，其中由于高脂飲食誘導(dǎo)的Staphylococcus（葡萄球菌屬）、Corynebacterium_1（棒狀桿菌屬_1）等相對(duì)豐度的顯著增加可以被高劑量的CLA干預(yù)逆轉(zhuǎn)。據(jù)報(bào)道，低氧環(huán)境利于專(zhuān)性厭氧菌生長(zhǎng)，它們可降解纖維生成SCFA，進(jìn)而促進(jìn)宿主健康[28]。另有研究發(fā)現(xiàn)，SCFA刺激PPAR-γ信號(hào)傳導(dǎo)，驅(qū)動(dòng)結(jié)腸上皮細(xì)胞的能量代謝向β-氧化轉(zhuǎn)化，抑制腸道上皮細(xì)胞氧合作用，維持腸腔厭氧環(huán)境，形成不利于兼性厭氧菌生長(zhǎng)的腸腔微環(huán)境[29]，進(jìn)而維持腸道屏障，避免脂多糖、鞭毛蛋白等有害菌群代謝產(chǎn)物入血循環(huán)，抑制全身炎癥發(fā)生，這對(duì)機(jī)體糖脂穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[30]。因此，高劑量CLA干預(yù)后兼性厭氧菌減少可能與SCFA產(chǎn)生相關(guān)的腸道菌群明顯增加有關(guān)。

綜上所述，CLA能夠顯著降低體重、內(nèi)臟脂肪并且改善高脂飼料導(dǎo)致的甘油三酯和膽固醇蓄積，可能與CLA重塑腸道菌群有關(guān)。經(jīng)過(guò)高劑量CLA干預(yù)后，腸道菌群中專(zhuān)性厭氧菌和兼性厭氧菌的相對(duì)豐度發(fā)生顯著的變化，同時(shí)與SCFA產(chǎn)生有關(guān)的菌群在高劑量的CLA干預(yù)后顯著增加，這可能是CLA發(fā)揮抑制肥胖和降低脂質(zhì)蓄積的重要生理基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究存在一定的局限性，尚未檢測(cè)糞便中的菌群代謝物，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步采用腸道菌群測(cè)序與代謝組學(xué)技術(shù)以明確CLA調(diào)節(jié)肥胖相關(guān)的菌群代謝物。