賈菲蕓，楊 靖，王稼苜，曹銀萍，李友勇,

（1.河南科技學院生命科技學院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2.河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學院，玉米研究所，河南新鄉(xiāng) 453000）

在我國上世紀70年代前，玉米屬于口糧。進入本世紀后，由于水稻和小麥的持續(xù)增產(chǎn)，基本能滿足居民主食口糧需要，因此，玉米逐漸變?yōu)檎{節(jié)食品作物。我國居民食用玉米，南方多鮮食，直接食用未成熟籽粒；北方多食用玉米粥、玉米餅、小麥玉米混合粉等制品，利用的是成熟玉米籽粒。由于人們將玉米作為調節(jié)食品，因而對食用玉米的品質要求也由過去的能量攝取變?yōu)槟壳暗淖非箫L味。糧食的風味，其中重要組成是香味，根據(jù)對水稻和小麥等作物的研究，這種香味是揮發(fā)性香氣物質產(chǎn)生的，部分作物中已鑒定出其關鍵成分[1?3]。玉米的風味及揮發(fā)性香氣物質國外研究較早，但主要集中在鮮食的甜、糯玉米上[4?6]，國內研究起步較晚，已有的研究也多是鮮食玉米[7?9]，成熟的籽粒玉米僅在酒類發(fā)酵和倉儲方面有少量報道[10?13]。雖然玉米成為調節(jié)食品，但在我國居民的膳食結構中仍有重要位置，一方面在部分人群中不可或缺，另一方面需求總量仍很大。據(jù)統(tǒng)計，我國玉米年產(chǎn)2.5億噸左右，其中食用占5%~10%[14]，達1250萬到2500萬噸，在品種改良和生產(chǎn)環(huán)節(jié)提高這部分玉米的食用品質有重要意義。

玉米品種，根據(jù)食用認知和研究，發(fā)現(xiàn)有的品種籽粒風味好，有的則差[15]，同一品種，新收獲的籽粒加工的食品風味好，貯藏陳化的籽粒風味差[16]；特殊地區(qū)，如同一品種在不同地區(qū)種植，收獲的籽粒食用品質不同[15]等。然而到目前，我國對于這些現(xiàn)象的系統(tǒng)研究則很少，玉米風味的食用品質評價體系和指標也未建立，重要香氣物質的種類和含量鮮有報道，品種選育和審定中香味品質也沒有參考指標，優(yōu)質食用籽粒玉米的種植還處于自發(fā)狀態(tài)。

為了逐步建立香味品質評價體系，掌握玉米不同品種間香味物質的成分和含量狀況，以及貯存后的成分變化，本文遴選過去20年中種植面積大、食用品質好的著名玉米品種鄭單958[15?16]，和新培育的籽粒鮮黃、白軸、半硬質，產(chǎn)量超鄭單958 5%以上的高產(chǎn)品系黃1號~黃4號4個品系為材料，取樣當年收獲籽粒和自然存放1~3年的果穗籽?；蛟蹫闃悠?，采用氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry GC-MS）方法[17?18]，測定樣品中的揮發(fā)性有機物質（volatile organic compounds，VOCs）的含量，分析這一重要食用品質的組分構成和品種間差異，為品種改良、優(yōu)質品種評價和貯存方法改進等提供關鍵成分信息和香氣物質含量參考指標。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

取樣的5個品種、品系材料在不同年份收獲后，果穗風干，放置普通紙箱內貯藏在低溫庫中，庫溫5±1 ℃。2019年保存一份黃2號籽粒全粉（籽粒去果皮磨粉）的樣品，普通PE食品袋包裝，非真空。2017年保存一份鄭單958玉米糝（碾碎的細顆粒）樣品，聚酯袋真空包裝。全部共10個樣品，其編號、產(chǎn)地、貯存處理等信息見表1；2-甲基-3-庚酮 純度99%，配制成正己烷溶液，濃度50 mg/mL，Sigma-Aldrich。

表1 玉米品種樣品及儲存處理Table 1 Samples of maize varieties and storage treatment

Thermo Trace 1300-ISQ7000氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；色譜柱 DBwax 石英毛細柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm） Agilent；配備的MPS2型CTC三位一體自動進樣器 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；20 mL頂空瓶、50/30 μm DVB/CAR on PDMS型萃取頭 上海安譜公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品準備 樣品取樣先取果穗3個，剝下籽粒，對半取樣法取樣100 g，去果皮后中藥粉碎機粉碎為粗粉。保存為全粉和糝的材料直接對半取樣法取樣100 g，即原始樣品，?72 ℃低溫保存。各項重復分析均從該原始樣品中取樣。氣相色譜測定的樣品取粗粉10 g，小型磨碎機磨粉，全部過60目網(wǎng)篩。

1.2.2 GC-MS檢測 參考Wang等[19]的方法，采用頂空固相微萃?。⊿olid phase micro-extraction，SPME），氣相色譜-質譜聯(lián)用儀檢測。

SPME條件：粉狀樣品2±0.01 g，加入頂空瓶，后加入內標2-甲基-3-庚酮正己烷溶液10 μL（加入量0.5±0.01 mg），渦旋混勻后微萃取。微萃取溫度60 °C，震蕩時間40 min，萃取時間50 min，震蕩速度250 r/min，解析時間5 min。

GC條件：色譜柱DB-wax石英毛細柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣溫度260 °C，分流比5，載氣是氦氣（純度99.999%），流量1.0 mL/min，柱溫70 °C保持2 min，以3 °C/min速率升至220 °C，保持3 min，循環(huán)時間50 min。

MS條件：接口溫度240 °C，離子源溫度230 °C，電離方式EI+，70 ev；掃描方式為全掃描，質量范圍33~550，質譜庫是國家標準與技術研究所（The National Institute of Standards and Technology，NIST）2017光譜數(shù)據(jù)庫“NIST 2017”。

1.2.3 定性、定量分析和差異顯著性檢驗方法 揮發(fā)性物質定性分析由MS結果給出。為了比較不同品種和不同貯藏時間之間揮發(fā)性物質含量的差異，計算各樣品揮發(fā)性物質的相對總含量，方法參考Wang等[19]和朱力杰等[20]的計算方法，相對總含量（mg/kg）=[（內標峰面積/內標進樣量（mg）×樣品總峰面積）]/樣品進樣量（mg）×106，用所有樣品含量數(shù)據(jù)估計總體均數(shù)、總體方差和總體標準誤，用已知總體方差和總體標準誤的兩個樣品間平均數(shù)顯著性檢驗方法做兩兩樣品間含量差異顯著性檢驗[21]。

2 結果與分析

10個樣品，經(jīng)氣相色譜儀檢測，離子流圖譜顯示內標峰和高含量峰的保留時間在樣品間保持一致，穩(wěn)定性好，樣品間峰的數(shù)目和高度，即峰面積存在差異，這是品種間差異。其中對照鄭單958（4#）和黃1號（1#）和黃2號（6#），峰數(shù)目多、面積大，揮發(fā)性物質總含量高，以該3個典型樣品為例，顯示總離子流圖見圖1。鄭單958的離子流圖中標注了部分高含量峰的物質名稱，未標注的高含量峰經(jīng)鑒定是硅氧烷，可能是游離的柱填充物或容器壁溶解物。多數(shù)樣品45 min前出峰完成，因此設置檢測總時間為50 min。

圖1 3個玉米品種揮發(fā)性物質 GC-MS 離子流圖Fig.1 GC/MS total ion chromatogram of volatile components of three maize varieties注：1：3-Heptanone, 2-methyl-（2-甲基-3-庚酮:（內標））；2：Dodecane（正十二烷）；3：styrene（苯乙烯）；4：Methyl 6-oxoheptanoate（6-氧代庚酸甲酯）；5：2-Propanol, 2-methyl-（叔丁醇）；6：[1,1'-Bicyclopropyl]-2-octanoic acid, 2'-hexyl-, methyl ester（2-己基-1,1-雙環(huán)丙烷-2-辛酸甲酯）；7：Benzaldehyde, 4-ethyl-（4-乙基苯甲醛）；8：12,15-Octadecadiynoic acid, methyl ester（12,15-十八碳二炔酸甲酯）；9：Paromomycin（巴龍霉素）；10：1-（3,4-dimethylphenyl）-（3,4-二甲基苯乙酮）；11：Phthalic acid, hex-3-yl isobutyl ester（鄰苯二甲酸，六-三酰異丁酯）。

2.1 峰數(shù)目、物質數(shù)目和類別

各樣品峰譜物質在質譜庫中檢索，共確定具對應物質峰195個。分析峰譜發(fā)現(xiàn)，同一物質同質荷比多峰現(xiàn)象比較普遍，最多達7個，如12,15-十八碳二炔酸甲酯、6-甲基十八烷等。將相同物質合并，鑒別出物質組分總數(shù)共101種。將101種被鑒定的化合物按有機物類別，烷、烯、醇、醛、酮、酸、酯、醚、酚、雜環(huán)等衍生化合物劃分，可分為12類（表2）。統(tǒng)計每類物質出現(xiàn)的頻次，數(shù)量最多的是酯，18種，其次是醇和酮，再次是烷、酰胺類，烯、醛、酸類較少，這些物質中，絕大多數(shù)具香氣，如5-羥基-4-辛酮（奶油香，食品用香料）、2-壬酮（果香和奶油香）、呋喃酮（果香和香味增效劑）、叔丁醇（香精原料）、月桂醇（紫羅蘭香）等[11,13,18]，因此，玉米的香氣風味也是多種香氣物質組成的天然混合香。

表2 鑒定的玉米揮發(fā)性物質的類別及數(shù)量Table 2 Categories and its quantities of identified volatile substances in maize

2.2 揮發(fā)性物質的相對總含量

將峰面積用內標參數(shù)換算為相對含量，10個樣品各自的總含量見表3，可看出，含量分布在36.66~68.00 mg/kg之間。9#樣品的鄭單958玉米糝最高，為68.001 mg/kg；其次是6#黃2號當年籽粒樣品，為65.145 mg/kg；新收獲的黃1號當年樣品，含量為63.788 mg/kg；最低的是2018年冬在海南種植，2019春季收獲，穗子在室內自然存放1.5年的黃1號，為36.660 mg/kg，含量僅為當年收獲的同品種樣品的58.19%。

表3 樣品的峰數(shù)目、揮發(fā)性物質種類、相對總含量和單組分平均含量

2.3 共有香氣物質和特有香氣物質

分析峰譜和質譜結果，其中所有樣品共有，且平均峰面積≥105的物質共51種，平均峰面積≥106的物質共13種（表4），峰面積≥107水平的高含量物質2種，叔丁醇和正十二烷。統(tǒng)計這些物質的共有成分，它們在總含量較高（≥50 mg/kg）樣品中貢獻總揮發(fā)性物質的40%~50%，在含量較低（<50 mg/kg）樣品中貢獻50.70%。除此之外，不同品種，不同貯藏時間樣品，還檢測到有各自的特有成分，這些特有成分的數(shù)量在樣品間分布4~16種不等，見表5，高含量樣品數(shù)目多，如1#和9#，分別有14種和16種，部分低含量樣品少，如4#、5#，僅4種。在黃1號中峰面積≥107的特有成分還有苯二甲酸酯，在黃2號中還有甲基3,6-十八碳二炔酸酯（3,6-Octadecadiynoic acid, methyl ester ），該物質峰面積高達4.22×107，是該樣品總面積的22.44%，但它的叔丁醇含量則較低。峰面積≥106的特有成分還有十四烷、十六碳烯酸、4-乙基苯甲醛、2-乙基苯甲酸甲酯、3,4-二甲基苯乙酮、鄰苯二甲酸二丁酯等。9號樣品品種是鄭單958，產(chǎn)地是涼爽的山區(qū)地區(qū)，其中檢測出三萜酯-纈氨酸、四乙酰-D-二甲基腈、十四烷、人參炔E等特殊成分。

表4 玉米籽粒全粉中相對含量峰面積大于106的共有揮發(fā)性化合物Table 4 Co-owned VOCs with peak area greater than 106 in the whole corn grain powder

表5 不同樣品中峰面積大于106的特有揮發(fā)性化合物數(shù)量Table 5 Number of specific VOCs with peak area larger than 106 in different samples

2.4 揮發(fā)性物質含量樣品間差異顯著性檢驗

表3 的樣品揮發(fā)性物質相對總含量數(shù)據(jù)，用已知總體方差的兩個樣品平均數(shù)差異顯著性檢驗方法[21]檢測兩兩樣品間含量差異，見表6，可看出：a.品種間總含量具顯著或極顯著性差異（P<0.05，P<0.01），黃1號和黃2號是高含量品種，鄭單958、黃3號和黃4號是中等含量品種；b.不同貯藏時間之間比較，總含量差異顯著（P<0.05），如1#到3#之間，5#與6#之間，相同品種，不同貯藏時間，含量差異顯著（P<0.05）。黃1號的3個樣品，貯藏時間越長，揮發(fā)性物質總含量下降越多，每年損失約15%；黃2號的磨粉樣品（10#），自然存放僅1年，揮發(fā)性物質總含量下降31.98%；c.9#樣品，是中等含量品種鄭單958，貯藏3年，總含量仍在高含量水平，與黃1號和黃2號當年樣品差異不顯著，推測樣品本身揮發(fā)性物質含量高或其在貯藏期間損耗小；該樣品產(chǎn)地河南欒川，聚酯袋密封抽真空包裝，2017年收存，5 ℃低溫下貯存，高含量揮發(fā)物可能與樣品產(chǎn)地有關，貯藏期間損耗小與包裝有關，隔絕空氣的密封包裝能有效防止香氣物質溢散。

表6 10個樣品間揮發(fā)性物質相對總含量差異顯著性檢驗（t檢驗）Table 6 Difference significant test (t-test) on relative total content of VOCs among ten samples

3 結論與討論

玉米可食用，籽粒具高能量，也具高含量保健成分，雖然目前在我國退出居民主食地位，但由于其特殊營養(yǎng)和人們的膳食習慣，作為調節(jié)食物原料目前仍保持相當利用數(shù)量。玉米的食用品質，香味物質是重要組成成分，本文用不同品種、同一品種新收獲籽粒和陳化籽粒、同一品種不同產(chǎn)地等處理的籽粒全粉，檢測其揮發(fā)性物質種類和含量，發(fā)現(xiàn)物質種類達100余種，單品種60~70種，不少于小麥[3]。高含量組分20余種，累加含量達品種總含量80%。高含量組分中可分為共有成分和特有成分，共有成分中發(fā)現(xiàn)正十二烷和叔丁醇含量最高，達4.345和6.472 mg/kg，可認為是重要成分；特有成分品種間變化較大，在一些品種中含量極高，如甲基3,6-十八碳二炔酸酯，在黃2號中超總揮發(fā)性香氣物質含量的20%。檢測結果還顯示，5個品種中揮發(fā)性香氣物質相對總含量為36.660~68.001 mg/kg，品種間差異顯著，陳化后含量下降，磨碎的全粉貯存后含量下降幅度更大，但真空包裝含量損耗輕微；山區(qū)地區(qū)生產(chǎn)的籽粒比平原地區(qū)生產(chǎn)的籽粒含量顯著提高，等等，這些結果為玉米籽粒香味物質評價、品種改良指標參考、貯藏方法改進等提供了重要實驗數(shù)據(jù)。

3.1 玉米香氣物質組分和含量

檢測結果顯示，玉米籽粒中揮發(fā)性物質種類可檢測到100種以上，但80%的物質由20余種物質組成，這與過去報道的籽粒玉米中組分數(shù)量和特征基本一致[7?13]，但本文結果與過去鑒定的組分比較，相似成分多，相同成分少，相同成分不超過10%，相似成分是同類物，差異主要是碳（C）的數(shù)目不同、側鏈甲基位置不同或功能基氧化程度不同，如十二烷、十四烷、十六烷、十八烷、6-甲基十八烷，壬酮和壬醛，月桂醇和月桂酸等。這些差異可能來自于玉米籽粒在貯藏期間的持續(xù)轉化和檢測時樣品前處理不同。玉米香氣物質的絕對含量過去報道也較少，主要原因是鑒定的揮發(fā)性物質不穩(wěn)定，單物質標準樣品純化較難、鑒定程序復雜等，因此過去考察含量的研究多使用歸一法相對含量參數(shù)[7?9,12?13]，但歸一法參數(shù)更多反映的是組分的構成，不反映含量。本文用內標法計算總近似含量，這是一個相對內標物2-甲基-3-庚酮的含量結果。檢測結果顯示當年收獲籽粒樣品高含量組的樣品總含量在60~70 mg/kg范圍級別，中等含量在50~60 mg/kg級別，低含量組在36~50 mg/kg級別。已知玉米的香氣物質含量在糧食作物中相對較低，低于小麥[11]，小麥中也鮮有絕對含量報道，因此成熟玉米籽粒中的揮發(fā)物含量還需更多的測定和特定內標物的利用。

3.2 玉米香氣物質的關鍵成分

本研究期望鑒定出成熟玉米籽粒中的關鍵性香味物質及含量，建立玉米食用品質的核心指標，但關鍵性成分的鑒定，需較多的研究結果支持。所謂關鍵性成分，一般認為，一是有典型的玉米香味，二是含量較高[1?3]。上世紀70年代國外在甜玉米中鑒定出二甲基硫醚是特征香味物質[4]，但該物質是在加熱中產(chǎn)生的，在生玉米中不存在。非甜玉米中很少檢測到二甲基硫醚[22]，籽粒玉米均是非甜玉米，因此不易檢測到該物質。還有研究認為乙酸乙酯是玉米高含量香氣物質[23]，但馬良等[13]檢測玉米陳化0、60、120和180 d后的香氣物質變化，只有120 d樣品檢測到乙酸乙酯，這表明玉米的香味物質在籽粒中不穩(wěn)定，不同品種可能不同。馬良等[13]認為玉米香味的關鍵性物質不是一種或少數(shù)幾種，而是一組，本研究發(fā)現(xiàn)高含量物質正十二烷和叔丁醇，還有特有的高含量成分，如甲基3,6-十八碳二炔酸酯，可認為是重要揮發(fā)性物質，是否關鍵組分，還需進一步鑒定和更多檢測。

3.3 影響香氣物質種類和含量改變的因素

實驗結果中檢測到3個影響香氣物質種類和含量改變的因素。第一是品種。過去幾乎所有的報道，主要是糯質、甜質品種的報道，均表明香氣物質種類和含量在品種間存在差異[7?13,24?25]，本研究結果也顯示籽粒品種之間存在顯著差異，這表明該差異是品種特性，因而意味著食用玉米品種可改良，可創(chuàng)新優(yōu)質品種；第二是產(chǎn)地。9#樣品品種是鄭單958，香氣物質屬中等含量類型，但種植在河南欒川地區(qū)，品質明顯提高，該地區(qū)海拔較高，夏季溫度較低，該地區(qū)生產(chǎn)的玉米比較平原地區(qū)夏種秋收的玉米籽粒，外觀胚乳角質化程度高，粥制食品顏色鮮黃，香氣濃郁，食用品質好，2017年收存的樣品，3年后檢測揮發(fā)性物質仍在高含量水平，這表明，對玉米來說，在高海拔溫涼地區(qū)種植品質更佳。已有報道，同一品種不同產(chǎn)地，其淀粉、蛋白質含量等食用品質也存在顯著差異[15]；第三是貯存。安全貯存能保持農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)鮮品質，延長保質期，加工業(yè)和居民均十分關注。從檢測結果可看出，開放保存的玉米穗、玉米粉，香氣物質損失嚴重，整穗保存每年損失15%以上，磨粉非密封保存每年損失30%以上，但密封保存的9#樣品，揮發(fā)性物質損失很少。馬良等[13]也有相同結果，其在25 ℃密閉空間貯存玉米籽粒180 d，除酮類物質有所下降外，其他揮發(fā)性物質沒有大的改變，宋江峰等[24]詳盡分析了甜糯玉米在軟包裝下成分的變化，論述了密封包裝的保鮮作用，這種目前成熟的包裝技術，對提高玉米初加工后的粉、糝產(chǎn)品保質期有顯著增加作用。