張麗華，王 霞，查蒙蒙，唐培鑫，石 訓(xùn)，縱 偉, ，趙光遠(yuǎn)

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450002；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002；3.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002；4.好想你健康食品股份有限公司，河南新鄭 451162；5.河南省國(guó)德科果蔬研究院有限公司，河南新鄭 451162）

富含益生菌的食品已成為眾多消費(fèi)者的選擇，益生菌作為發(fā)酵劑或者功能性成分被廣泛應(yīng)用到酸奶[1]、奶酪[2]、冰淇淋[3]和益生菌粉[4]等產(chǎn)品中。由于素食主義興起以及對(duì)乳制品引起過(guò)敏的擔(dān)憂，非乳制品消費(fèi)者對(duì)益生菌的需求也在不斷增加。被賦予“健康食品”美譽(yù)的水果和蔬菜[5]，已被證實(shí)是一種新型益生菌生長(zhǎng)的適宜載體[6]。

近年來(lái)，蔬果脆片逐漸占據(jù)市場(chǎng)，成為廣大消費(fèi)人群所追捧的休閑食品。胡蘿卜具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含類(lèi)胡蘿卜素、維生素、多酚、微量元素等多種生物活性物質(zhì)[7]。前期研究表明，添加紅棗汁和植物乳桿菌復(fù)合發(fā)酵胡蘿卜，可以提高胡蘿卜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又可以掩蓋胡蘿卜原有的藥腥味，散發(fā)出果蔬發(fā)酵獨(dú)有的風(fēng)味[8]。所以，可以通過(guò)發(fā)酵將益生菌富集到果蔬片上，再聯(lián)合真空冷凍干燥技術(shù)[9]制備果蔬脆片。但是富含益生菌的食品由于菌株的特殊性，在生產(chǎn)、包裝和運(yùn)輸中會(huì)發(fā)生益生菌數(shù)量銳減，導(dǎo)致益生菌食品向更廣泛的消費(fèi)者推廣受到阻礙。

益生菌膠囊化技術(shù)作為一種提高益生菌在產(chǎn)品中生存能力的有效方法，已被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于功能食品中[10]。海藻酸鈉和乳清分離蛋白作為復(fù)合壁材包埋益生菌，既具有抵抗外界壓力的能力[11?13]，又可以提高包埋率[14?15]，保證益生菌能夠抵抗胃腸消化等惡劣的環(huán)境條件。Massounga等[16]的研究表明，經(jīng)乳清分離蛋白-低聚果糖復(fù)合物為壁材包埋益生菌的凍干香蕉粉在不利條件及長(zhǎng)時(shí)間貯存時(shí)，可保持較高的菌活力和較好的貯藏穩(wěn)定性。王婷婷[17]探討了以海藻酸鈉和濃縮乳清蛋白包埋益生菌制備的微膠囊在乳清發(fā)酵中的活菌數(shù)和pH變化，證明其在實(shí)際應(yīng)用中不受限制可以完全釋放。María等[18]以含低聚果糖的甲基纖維素膜包埋植物乳桿菌應(yīng)用于蘋(píng)果片，不僅可以提高蘋(píng)果片的活菌數(shù)還可以保持其原有的品質(zhì)。Altamirano-Fortoul等[19]以淀粉對(duì)嗜酸乳桿菌進(jìn)行微囊化，通過(guò)可食用的涂層將其固定到面包表面，制作出的功能性面包除具有與普通面包相似的特性，還具有一定的健康益處。

為制備一款風(fēng)味良好，富含益生菌的胡蘿卜脆片，本研究通過(guò)發(fā)酵改善胡蘿卜的風(fēng)味，又引入微膠囊技術(shù)提高活菌數(shù)。探討了植物乳桿菌微膠囊發(fā)酵對(duì)胡蘿卜脆片品質(zhì)的影響，及其在冷凍干燥以及模擬胃液中活菌數(shù)的變化，以期為益生菌微膠囊在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供一定技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胡蘿卜 市售；紅棗品種：“灰棗” 好想你健康食品股份有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum；L. plantarum）（CICC.20022） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；海藻酸鈉 臨夏州華安生物制品有限責(zé)任公司；分離乳清蛋白 浙江一諾生物科技有限公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基

北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；紅菲咯啉（BP） 上海晶純生化科技股份有限公司；氫氧化鈉、三氯乙酸（TCA）、三氯化鐵 天津大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇、磷酸、石油醚 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；濃硫酸 洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、抗壞血酸 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司。

SW-CJ-IBV型超凈工作臺(tái) 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；SC-80C型全自動(dòng)色彩色差計(jì) 北京康光光學(xué)儀器有限公司；FE28型pH計(jì)、AL204型電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；BC/BD-429H型冰柜 青島海爾股份有限公司；HC-3618R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；XY-FD-18冷凍干燥機(jī) 上海欣諭儀器有限公司；BPH-9272型精密恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；78-2雙向磁力加熱攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司；HH-S4型恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器

上海申安醫(yī)療器械廠；TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TA-XT Plus型物性分析儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；JSM-7001F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化 植物乳桿菌凍干粉接種到滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)48 h，連續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)2次，將所得菌液離心（4 ℃，5000 r/min，10 min），倒掉上層培養(yǎng)基，用無(wú)菌水將沉淀洗2~3次后得到菌泥，再將其轉(zhuǎn)入無(wú)菌水中振蕩均勻，菌懸液活菌數(shù)達(dá)到（9.0±0.05） lg （CFU/mL），備用。

1.2.2 植物乳桿菌微膠囊的制備與表征

1.2.2.1 植物乳桿菌微膠囊的制備 稱(chēng)取一定質(zhì)量的海藻酸鈉粉末溶于無(wú)菌水中，70 ℃下水浴加熱過(guò)夜至粉末充分溶解，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的海藻酸鈉溶液，冷卻備用。稱(chēng)取一定質(zhì)量的乳清分離蛋白粉末溶于無(wú)菌水中，在磁力攪拌器上攪拌直至溶解完全，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的乳清分離蛋白溶液。稱(chēng)取一定質(zhì)量的氯化鈣顆粒溶于純凈水，121 ℃高壓滅菌15 min，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%氯化鈣溶液。

采用擠壓法制備微膠囊[20]：將2 mL菌懸液與2.5 mL乳清分離蛋白溶液混合，之后加入到2.5 mL海藻酸鈉溶液中攪拌水合1 h。使用注射器將混合液擠壓滴入100 mL氯化鈣溶液中，形成微膠囊，磁力攪拌器攪拌30 min，使微囊充分凝固，用蒸餾水沖洗3次，除去多余的鈣離子和未被包埋的益生菌，即得濕膠囊。

1.2.2.2 微膠囊包埋率的測(cè)定 包埋率的測(cè)定參照Darjani等[21]的方法略有改動(dòng)。稱(chēng)取濕微膠囊樣品1 g精確到0.10，加入9 mL檸檬酸鈉（0.06 mol/L）和碳酸氫鈉（0.20 mol/L）混合液中，渦旋振蕩10 min使得膠粒溶解，乳酸菌完全釋放。將混合液梯度稀釋后涂布于MRS瓊脂上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h并計(jì)數(shù)。微膠囊的包埋率按照下式計(jì)算：

式中：N為包埋后膠粒釋放的活菌數(shù)量，CFU/g；N0為包埋前溶液活菌數(shù)量，CFU/g。

1.2.2.3 微膠囊的形態(tài)觀察 參考陳秉彥等[22]的方法以場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察凍干微膠囊的整體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.3 胡蘿卜片的制備 胡蘿卜清洗，切成厚度為0.4 cm的扇形，90 ℃熱燙15 s，撈出瀝水后，備用。紅棗清洗、去核，按照料液比1：8（g/mL）進(jìn)行打漿，雙層紗布過(guò)濾3次得到棗汁，調(diào)整棗汁的糖度為10%（w/v），鹽1%（w/v），80 ℃下滅菌30 min，冷卻，備用。

對(duì)照組：將1.2.1的菌懸液以4% （w/v）接入棗汁，再以1:1（w/v）的比例加入處理好的胡蘿卜片，在37 ℃條件下發(fā)酵6 d后于?20 ℃預(yù)凍8 h，真空冷凍干燥14 h。

試驗(yàn)組：取與對(duì)照組相同接種量的菌懸液，以1.2.2的方法制成微膠囊接入棗汁，以1:1（w/v）的比例加入處理好的胡蘿卜片，在37 ℃條件下發(fā)酵6 d后于?20 ℃預(yù)凍8 h，真空冷凍干燥14 h。

1.2.4 微膠囊發(fā)酵胡蘿卜過(guò)程中指標(biāo)的測(cè)定

1.2.4.1 pH的測(cè)定 采用pH計(jì)，每天取50 mL發(fā)酵液，進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.2 活菌數(shù)的測(cè)定 每天取發(fā)酵液1 mL，以稀釋平板涂布法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5 胡蘿卜脆片指標(biāo)的檢測(cè)

1.2.5.1 質(zhì)構(gòu)的測(cè)定 采用物性分析儀，參照李瑞杰[23]的方法測(cè)定胡蘿卜干燥后的硬度和脆度。采用P 0.5探頭，TPA模式，測(cè)前速度（pre-test speed）為5 mm/s，測(cè)試速度（test speed）為2 mm/s，測(cè)后速度（post-test speed）為5 mm/s，觸發(fā)力（target force）為20 g，壓縮距離（distance）為3 mm。每種處理樣品重復(fù)做五次，取其平均值。

1.2.5.2 色差的測(cè)定 采用全自動(dòng)色彩色差計(jì)測(cè)定胡蘿卜片的明亮度（L*值）和綠/黃值（a*正值表示紅色，a*負(fù)值表示綠色；b*正值表示黃色，b*負(fù)值表示藍(lán)色）。取胡蘿卜片的外圍部分進(jìn)行測(cè)量。

1.2.5.3 多糖含量的測(cè)定 參照SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定苯酚-硫酸法》[24]的方法，測(cè)定胡蘿卜多糖含量，單位以（g/100 g）表示。

1.2.5.4 胡蘿卜素含量的測(cè)定 采用周新麗等[25]的方法稍加修改，測(cè)定胡蘿卜素含量，單位為（mg/100 g）。

1.2.5.5 抗壞血酸含量的測(cè)定 采用分光光度計(jì)法[26]，測(cè)定抗壞血酸含量，單位為（mg/100 g）。

1.2.5.6 真空冷凍干燥后活菌數(shù)的測(cè)定 參照于紅等[27]的方法，分別取對(duì)照組和試驗(yàn)組的胡蘿卜片，以料液比1:10接入無(wú)菌生理鹽水中，37 ℃，50 r/min振蕩2 h后對(duì)真空冷凍干燥后的活菌數(shù)計(jì)數(shù)。

1.2.5.7 模擬胃液消化后活菌數(shù)的測(cè)定 采用常柳依等[28]的方法，配制模擬胃液：用濃鹽酸將2 mg/mL NaCl溶液的pH調(diào)至2.0，再加入胃蛋白酶并使最終質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 g/L，121 ℃滅菌15 min。

分別取對(duì)照組和試驗(yàn)組的胡蘿卜片以料液比1:10接入模擬胃液溶液，渦旋30 s完全分散。在37 ℃，50 r/min搖床培養(yǎng)2 h。分別在5、30、60、120 min取1 mL樣品溶液進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5.8 植物乳桿菌活菌數(shù)的計(jì)數(shù) 計(jì)數(shù)方法參考GB 4789.35-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[29]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有獨(dú)立試驗(yàn)至少重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，Origin 8.5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊的包埋率及形態(tài)觀察

由表1可知，SA-WPI微膠囊的包埋率為70.40%±2.80%，活菌數(shù)為（9.47±0.02） lg （CFU/g）。細(xì)菌細(xì)胞的表面主要由糖蛋白組成，糖蛋白可以與壁材建立相互作用。蛋白質(zhì)與碳水化合物的混合物通過(guò)靜電吸引、氫鍵和范德華力結(jié)合，具有補(bǔ)充的包埋作用[30]。

表1 微膠囊的包埋率及活菌數(shù)Table 1 Encapsulation yield and viable bacteria count of microcapsules

植物乳桿菌的形態(tài)如圖1A，呈現(xiàn)乳酸菌典型的棒狀形態(tài)，菌體表面平整，大小約為1.00 μm×0.50 μm。微膠囊的形態(tài)如圖1B，在25倍的鏡頭下可以看到微膠囊的粒徑大小約1 mm。放大到10000倍時(shí)如圖1C，表面光滑而且裂紋淺，呈現(xiàn)出致密的表面形態(tài)，植物乳桿菌基本全被包埋于內(nèi)部。這可能是由于乳清蛋白-Ca2+交聯(lián)海藻酸鹽，微膠囊更加緊湊，以防止芯材的變質(zhì)或丟失，有利于無(wú)任何裂紋的光滑表面的形成[31]。

圖1 植物乳桿菌微膠囊的形態(tài)Fig.1 Morphology of Lactobacillus plantarum microcapsule

2.2 植物乳桿菌微膠囊發(fā)酵胡蘿卜pH和活菌數(shù)的變化

由圖2A可知，發(fā)酵過(guò)程中試驗(yàn)組和對(duì)照組的pH變化趨勢(shì)相同，在發(fā)酵第1 d時(shí)pH都快速下降，2~6 d的降低速度減緩，pH的變化比較慢。發(fā)酵第6 d的pH分別降到3.27和3.31。圖2B是試驗(yàn)組和對(duì)照組的胡蘿卜發(fā)酵6 d的活菌數(shù)變化，兩組的活菌數(shù)在0~6 d變化趨勢(shì)都是先增加后減少。試驗(yàn)組由于微膠囊化對(duì)植物乳桿菌的限制，發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)低于對(duì)照組。結(jié)合pH的變化，微膠囊化的植物乳桿菌雖然釋放速度慢，但是并不影響發(fā)酵進(jìn)程。

圖2 植物乳桿菌微膠囊發(fā)酵胡蘿卜pH（A）和活菌數(shù)（B）的變化Fig.2 Changes of pH （A）and viable count （B）of carrot by Lactobacillus plantarum microcapsules fermentation

2.3 植物乳桿菌微膠囊發(fā)酵對(duì)胡蘿脆卜片品質(zhì)的影響

由表2可知，與未發(fā)酵的胡蘿卜片相比，對(duì)照組和試驗(yàn)組的胡蘿卜脆片的硬度下降，脆度無(wú)明顯變化，這可能是微生物活動(dòng)引起的變化，與張麗華等[8]的研究結(jié)果一致。方差分析表明對(duì)照組和試驗(yàn)組的胡蘿卜在硬度和脆度上無(wú)顯著性差異（P>0.05）。相較于未發(fā)酵的脆片，對(duì)照組和試驗(yàn)組的胡蘿卜片的亮度（L*）升高，這可能與發(fā)酵過(guò)程中水分變化有關(guān)[32]，紅色值a*升高，黃色值b*比較穩(wěn)定，變化不顯著（P>0.05）。方差分析結(jié)果表示，試驗(yàn)組和對(duì)照組的胡蘿卜色澤差異不顯著（P>0.05）。所以，微膠囊化和未微囊膠化的植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)胡蘿卜片的硬度、脆度和色澤影響不顯著（P>0.05）。

由表2可知，相較于未發(fā)酵的脆片，對(duì)照組和試驗(yàn)組的胡蘿卜片由于植物乳桿菌對(duì)多糖的分解，胡蘿卜多糖含量顯著降低（P<0.05）。胡蘿卜素含量明顯降低，可能與微生物本身代謝有關(guān)以及環(huán)境因素的影響而發(fā)生降解[33]。抗壞血酸含量沒(méi)有顯著變化（P>0.05），可能是乳酸發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的酸性環(huán)境和CO2造成的缺氧環(huán)境有利于胡蘿卜中抗壞血酸的保存[34]。方差分析結(jié)果表明，對(duì)照組和試驗(yàn)組多糖、胡蘿卜素和抗壞血酸含量的變化差異不顯著（P>0.05）。植物乳桿菌膠囊化不會(huì)對(duì)胡蘿卜片的品質(zhì)產(chǎn)生影響。

表2 植物乳桿菌微膠囊對(duì)胡蘿卜脆片品質(zhì)的影響Table 2 Effects of Lactobacillus plantarum microcapsules on the quality of carrot chips

2.4 微囊化植物乳桿菌在真空冷凍干燥中活菌數(shù)的變化

如圖3所示，真空冷凍干燥前由于微膠囊化的限制，對(duì)照組胡蘿卜的活菌數(shù)比試驗(yàn)組高0.45 lg（CFU/g）。冷凍干燥后試驗(yàn)組的活菌數(shù)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），活菌數(shù)分別為（8.47±0.02）和（6.40±0.03） lg（CFU/g）。微膠囊化植物乳桿菌可有效保護(hù)冷凍干燥對(duì)菌體造成的損傷，一方面可能是包埋壁材在植物乳桿菌周?chē)纬烧承詫?，抑制冰晶生長(zhǎng)。另一方面膠囊的微環(huán)境延遲了菌體的再水合作用，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的滲透性休克產(chǎn)生保護(hù)作用[35]，從而提高植物乳桿菌在凍干過(guò)程中的活菌數(shù)。

圖3 微囊化植物乳桿菌在真空冷凍干燥中活菌數(shù)的變化Fig.3 Changes in activity of encapsulated Lactobacillus plantarum during vacuum freeze drying

2.5 微囊化植物乳桿菌在模擬胃液中活菌數(shù)的變化

由圖4可知，對(duì)照組和試驗(yàn)組的活菌數(shù)在體外模擬胃液處理的120 min內(nèi)連續(xù)降低。對(duì)照組在胃酸的作用下，活菌數(shù)快速下降，處理120 min后活菌數(shù)為（3.51±0.11） lg（CFU/g）。這是因?yàn)橹参锶闂U菌在低pH條件下，其細(xì)胞膜跨膜運(yùn)輸不能正常進(jìn)行從而導(dǎo)致其死亡[36]。試驗(yàn)組的植物乳桿菌具有較高的細(xì)胞活力，120 min后細(xì)胞活力保持在（8.31±0.01） lg（CFU/g）。這與Han等[37]的研究結(jié)果基本一致，可能是微膠囊在植物乳桿菌和外界環(huán)境之間形成物理屏障，減少酸的滲入有效緩解了對(duì)菌體細(xì)胞的損傷。

圖4 微囊化植物乳桿菌在模擬胃液中活菌數(shù)的變化Fig.4 Changes in activity of encapsulated Lactobacillus plantarum in simulated gastric juice

3 結(jié)論

由試驗(yàn)組與對(duì)照組的比較可知，微膠囊化的植物乳桿菌雖然釋放速度慢，但是并不影響發(fā)酵進(jìn)程。而且，與對(duì)照組相比，植物乳桿菌微膠囊發(fā)酵對(duì)胡蘿卜脆片的質(zhì)構(gòu)、色澤、多糖含量、胡蘿卜素含量和抗壞血酸含量沒(méi)有顯著影響。但是，植物乳桿菌微囊化可以顯著提高益生菌在冷凍干燥和模擬胃液中的活菌數(shù)，分別保持在（8.47±0.02）和（8.31±0.01） lg（CFU/g）?；谏鲜?，微膠囊技術(shù)可以明顯提升益生菌對(duì)不良環(huán)境（如低溫、胃液）的抗性，因而可以在保證胡蘿卜片良好品質(zhì)特性的同時(shí)，提高益生胡蘿卜片的功能潛力，具有一定的應(yīng)用前景。