郭寧 秦合偉 李彥杰 牛麗 牛雨晴 宋雪梅 劉昊源

1河南中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院（鄭州450046）；2河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）康復(fù)科（鄭州450002）

神經(jīng)源性膀胱（neurogenic bladder，NB）是指中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)病變導(dǎo)致膀胱和尿道的儲(chǔ)尿和排尿功能障礙，進(jìn)而產(chǎn)生一系列下尿路癥狀及并發(fā)癥，最常見(jiàn)原因之一是脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，約80%的SCI 患者在受傷后1年內(nèi)出現(xiàn)不同程度的膀胱功能障礙［1］，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)。

瞬時(shí)受體電位通道（transient receptor potential channels，TRPc）超家族通過(guò)Ca2+、Na+和K+通道參與機(jī)體多種器官內(nèi)機(jī)械感覺(jué)與傷害感受的傳導(dǎo)，其中瞬時(shí)受體電位香草酸1（transient receptor po?tential vanilloid 1，TRPV1）在人類和大鼠的神經(jīng)元和非神經(jīng)元組織中均有表達(dá)，通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)正常膀胱感覺(jué)的產(chǎn)生［2］。研究發(fā)現(xiàn)TRP 通道、ATP釋放和嘌呤能受體的異常表達(dá)與膀胱功能障礙程度密切相關(guān)［3］。

近年來(lái)，電針已成為SCI后NB中醫(yī)治療的主流方法［4-5］。本實(shí)驗(yàn)選取“中極”“關(guān)元”兩穴進(jìn)行干預(yù)，中極為足三陰與任脈交會(huì)穴、膀胱募穴，穴下為交感神經(jīng)支配的膀胱傳出神經(jīng)分支髂腹下神經(jīng)，電針此穴可對(duì)膀胱及尿道內(nèi)括約肌的交感支配產(chǎn)生影響；關(guān)元強(qiáng)壯腎陽(yáng)，與中極同處小腹，正是膀胱在體表的投射區(qū)，針感可直接傳導(dǎo)到病灶，促進(jìn)膀胱對(duì)尿液的氣化固攝［6-7］。本研究將以膀胱逼尿肌為靶標(biāo)，以TRPV1 及其下游信號(hào)通路為切入點(diǎn)展開研究，并通過(guò)設(shè)立TRPV1 抑制劑組驗(yàn)證電針“中極”“關(guān)元”穴是否通過(guò)抑制TRPV1 通道的激活發(fā)揮治療作用，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組健康SPF 級(jí)SD 雌性大鼠60 只，體質(zhì)量（220±20）g，7～9 周齡，購(gòu)自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（豫）2019?0002，所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。常規(guī)飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)挑選15 只作為假手術(shù)組，其余45 只大鼠進(jìn)行骶上脊髓損傷手術(shù)造模。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）倫理委員會(huì)審查通過(guò)（PZ?HNSZYY?2020?016）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑TRPV1 抗體（博奧森）、P2X2抗體（博奧森）、GAPDH 抗體（博奧森）、C?Kit 抗體（San?ta Cruz 公司）、TRPV1 抑制劑capsazepine（Sigma 公司）、HE 染色試劑盒（索萊寶）。

1.3 模型制備2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，以第十三浮肋相連接的T13 作為骨性標(biāo)志，以T10?11 為中心縱行切開約2 ～ 3 cm，鈍性分離，手術(shù)刀緊貼棘突兩側(cè)將椎旁肌縱行切開，暴露T10?T11 的棘突及椎板，切開棘間韌帶，止血鉗輕輕咬除T10 椎板直至暴露脊髓。用尖刀片于暴露的脊髓上緣橫向反復(fù)切割數(shù)次，此時(shí)若大鼠雙下肢抽搐，鼠尾呈松弛性甩動(dòng)，表明脊髓已完全橫斷［8］。術(shù)后每天三次定時(shí)crede手法排尿，記錄排尿量。

1.4 模型評(píng)價(jià)成模標(biāo)準(zhǔn)：（1）脊髓損傷行為學(xué)（basso beanie bresnahan，BBB）評(píng)分：后肢在前肢行走時(shí)處于拖動(dòng)狀態(tài)，不能參與行走，BBB 評(píng)分為0分；（2）膀胱功能評(píng)估：脊髓休克期，大鼠腹部可觸及脹大膀胱，需手法排尿，籠內(nèi)墊料干燥。脊休克期過(guò)后，膀胱脹大不明顯，無(wú)需手法輔助排尿，大鼠下腹部及部分墊料潮濕，尿流動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示高壓、低順應(yīng)性，說(shuō)明膀胱逼尿肌產(chǎn)生了無(wú)抑制性收縮。若出現(xiàn)雙后肢自主運(yùn)動(dòng)、自主排尿或尿潴留的情況，亦將其剔除。

1.5 各組干預(yù)方法造模成功后，將大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組、抑制劑組，各組開始治療：假手術(shù)組：暴露T10?T11，僅去除T10 棘突（不切斷脊髓），正常飼養(yǎng)；模型組：造模后不做任何處理，正常飼養(yǎng)；電針組：以0.3 mm×25.0 mm 毫針斜刺“中極”“關(guān)元”2 ～ 5 mm，電針儀參數(shù)設(shè)定為疏密波（10 Hz/50 Hz），強(qiáng)度1 mA，以針刺處出現(xiàn)規(guī)律性收縮為宜，留針20 min，每日1 次，連續(xù)2 周。抑制劑組：膀胱灌注TRPV1 抑制劑（2.5 mL，100 nmol/L，30 min），每天1 次，連續(xù)2 周。

1.6 標(biāo)本采集及檢測(cè)

1.6.1 尿流動(dòng)力學(xué)模型穩(wěn)定和電針治療結(jié)束后，2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，排空膀胱后將大鼠仰臥位固定，將F3 導(dǎo)尿管經(jīng)三通管與微量注射泵及尿動(dòng)力儀連接，緊貼尿道壁緩慢插入導(dǎo)尿管，排空管腔氣體，待導(dǎo)尿管插入膀胱并固定，此時(shí)壓力值為膀胱基礎(chǔ)壓（cmH2O），隨后以0.2 mL/min 的速度向膀胱內(nèi)灌注溫生理鹽水至膀胱壓力穩(wěn)定，記錄膀胱漏尿點(diǎn)壓（cmH2O）和膀胱最大容量（mL），計(jì)算膀胱順應(yīng)性（mL/cmH2O）。

1.6.2 標(biāo)本采集尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，在冰塊上將膀胱組織剪取兩塊，一塊放置固定液固定，以備HE染色和免疫熒光染色，一塊置于凍存管-80 ℃凍存，用于蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)。

1.6.3 HE 染色梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋；切片機(jī)以厚度4 μm 進(jìn)行切片；進(jìn)行蘇木素?伊紅染色；× 400 光鏡下觀察膀胱組織形態(tài)學(xué)改變。

1.6.4 免疫熒光雙標(biāo)染色將切好的石蠟切片脫蠟，抗原修復(fù)，山羊血清封閉后，滴加P2X2（1∶500）4 ℃過(guò)夜，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的二抗室溫1 h，然后滴加C?Kit（1∶200）4 ℃過(guò)夜，Cy3 標(biāo)記的二抗室溫1 h，TBST漂洗，含DAPI 的抗熒光衰減封片劑封片。×200 熒光顯微鏡下觀察、采集圖像，統(tǒng)計(jì)C?Kit 與P2X2 受體的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6.5 Western blot 檢測(cè)檢測(cè)大鼠膀胱組織中TRPV1、C?Kit、P2X2 蛋白表達(dá)取凍存的膀胱組織提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，240 mA 恒流轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（TRPV1 1∶1 000、C?Kit 1∶500、P2X21∶500），4 ℃搖床過(guò)夜，TBST 洗膜后加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，洗膜后ECL 顯色、曝光顯影。Image Lab 分析軟件進(jìn)行圖像處理和灰度值計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析，方差齊采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett′s T3 檢驗(yàn)方法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型評(píng)價(jià)脊髓休克期，模型組大鼠雙后肢無(wú)任何運(yùn)動(dòng)，呈拖行狀態(tài)，行為學(xué)評(píng)分（0.07±0.19）較假手術(shù)組（21.00 ± 0.00）明顯降低（P＜0.01），腹部可摸到脹大充盈的膀胱，手法排尿量達(dá)到頂峰且標(biāo)準(zhǔn)差波動(dòng)較大；脊髓恢復(fù)期膀胱脹大不明顯，表現(xiàn)為尿失禁，無(wú)需手法排尿，尿量明顯減少逐漸趨于穩(wěn)定。結(jié)合尿流動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，模型組大鼠膀胱基礎(chǔ)壓和漏尿點(diǎn)壓升高，膀胱最大容量和順應(yīng)性降低，表明逼尿肌反射亢進(jìn)型膀胱模型制備成功。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 術(shù)后模型組大鼠的手法排尿量Fig.1 Manual urine output of rats in the model group after operation

表1 術(shù)后兩組大鼠尿流動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較Tab.1 Comparison of urine flow dynamics between the two groups after operation ±s

表1 術(shù)后兩組大鼠尿流動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較Tab.1 Comparison of urine flow dynamics between the two groups after operation ±s

注:與假手術(shù)組比較，**P ＜0.01

組別假手術(shù)組模型組t 值P 值例數(shù)15 45基礎(chǔ)壓（cmH2O）16.635±2.548 37.648±3.603**-9.523＜0.001漏尿壓（cmH2O）35.091±3.938 54.537±3.8074**-7.100＜0.001最大容量（mL）4.345±0.452 1.273±0.304**11.277＜0.001膀胱順應(yīng)（mL/cmH2O）0.206±0.029 0.052±0.012**9.504＜0.001

2.2 治療后尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)電針干預(yù)后，與模型組比較，電針組、抑制劑組大鼠膀胱基礎(chǔ)壓和漏尿點(diǎn)壓下降，膀胱最大容量和順應(yīng)性升高（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 電針干預(yù)后各組大鼠尿流動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較Tab.2 Comparison of the results of urine flow dynamics in each group after electroacupuncture intervention ±s

表2 電針干預(yù)后各組大鼠尿流動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較Tab.2 Comparison of the results of urine flow dynamics in each group after electroacupuncture intervention ±s

注：與假手術(shù)組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01

組別假手術(shù)組模型組電針組抑制劑組F 值P 值例數(shù)15 15 15 15基礎(chǔ)壓（cmH2O）15.885±1.641 35.648±2.581**23.857±1.852##26.707±3.045##48.268＜0.001漏尿壓（cmH2O）35.091±3.938 53.537±2.829**40.556±1.158##41.580±1.869##30.089＜0.001最大容量（mL）4.402±0.452 1.306±0.349**2.990±0.197##2.639±0.257##59.974＜0.001膀胱順應(yīng)（mL/cmH2O）0.231±0.026 0.073±0.012**0.166±0.022##0.171±0.024##36.417＜0.001

2.3 膀胱組織HE 染色假手術(shù)組膀胱移行上皮細(xì)胞排列整齊，固有膜完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)異常出血、增生及纖維化改變；模型組膀胱移行上皮細(xì)胞排列紊亂，固有膜結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞間存在大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，組織水腫、出血明顯，結(jié)締組織增生呈纖維化趨勢(shì)；與模型組比較，電針組和抑制劑組膀胱組織的炎癥、水腫、出血程度有所減輕，單核細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量減少。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠膀胱組織形態(tài)學(xué)變化（HE，×400）Fig.2 The bladder histomorphological changes of rats in each group（HE，×400）

2.4 各組大鼠膀胱ICC 細(xì)胞C?Kit、P2X2 受體陽(yáng)性表達(dá)水平免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示膀胱ICC 細(xì)胞C?Kit 與P2X2受體共同表達(dá)于膀胱肌束邊緣，C?Kit 陽(yáng)性細(xì)胞著色為紅色，P2X2陽(yáng)性細(xì)胞著色為綠色。與假手術(shù)組比較，模型組C?Kit 和P2X2免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多（P＜0.01）；與模型組比較，電針組與抑制劑組均有少量表達(dá)（P＜0.01）。見(jiàn)圖3、表3。

表3 免疫熒光各組大鼠膀胱ICC 細(xì)胞C?Kit、P2X2受體的陽(yáng)性共表達(dá)量Tab.3 Positive expression of C?Kit and P2X2 receptor in ICC cells of rats in immunofluorescence groups ±s

表3 免疫熒光各組大鼠膀胱ICC 細(xì)胞C?Kit、P2X2受體的陽(yáng)性共表達(dá)量Tab.3 Positive expression of C?Kit and P2X2 receptor in ICC cells of rats in immunofluorescence groups ±s

注：與假手術(shù)組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01

組別假手術(shù)組模型組電針組抑制劑組F 值P 值例數(shù)15 15 15 15 C?Kit 與P2X2共表達(dá)量3.728±1.236 10.914±2.294**7.343± 0.941##6.178±1.278##15.264＜0.001

圖3 各組大鼠膀胱ICC 細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果（×200）Fig.3 Results of ICC immunofluorescence double?label staining in each group（×200）

2.5 Western blot 檢測(cè)各組大鼠膀胱組織中TRPV1、C?Kit、P2X2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較與假手術(shù)組比較，模型組TRPV1、C?Kit、P2X2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，電針組、抑制劑組膀胱組織中TRPV1、C?Kit、P2X2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖4、表4。

表4 各組大鼠膀胱組織中TRPV1、C?Kit、P2X2受體蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Tab.4 Comparison of TRPV1，C?Kit and P2X2 receptor protein expressions in bladder tissues of rats in each group±s

表4 各組大鼠膀胱組織中TRPV1、C?Kit、P2X2受體蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Tab.4 Comparison of TRPV1，C?Kit and P2X2 receptor protein expressions in bladder tissues of rats in each group±s

注：與假手術(shù)組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01

組別假手術(shù)組模型組電針組抑制劑組F 值P 值例數(shù)15 15 15 15 TRPV1 0.128±0.040 0.591±0.028**0.349±0.036##0.362±0.037##79.416＜0.001 C?Kit 0.179±0.031 0.517±0.034**0.279 ±0.019##0.302±0.045##71.656＜0.001 P2X2 0.167±0.034 0.560±0.048**0.274±0.024##0.269±0.031##90.679＜0.001

圖4 各組大鼠膀胱組織中TRPV1、C?Kit、P2X2受體蛋白電泳圖Fig.4 TRPV1，C?Kit and P2X2 receptor proteins in bladder tissues of rats in each group

3 討論

中醫(yī)電針療法在治療SCI 后泌尿系統(tǒng)疾病已取得了一定的進(jìn)展，常選擇任、督脈及足太陽(yáng)膀胱經(jīng)上穴位，如“大椎”、“次髎”、“中極”、“三陰交”等［9］，其機(jī)制研究以細(xì)胞凋亡、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)及其受體調(diào)控為主。關(guān)聯(lián)規(guī)則分析顯示“中極”“關(guān)元”為針灸治療SCI 后NB 核心腧穴組合［10-11］，且臨床上多兩穴聯(lián)合使用治療泌尿系統(tǒng)相關(guān)疾病，但關(guān)于兩穴的機(jī)制研究尚未明確，本實(shí)驗(yàn)從膀胱感覺(jué)功能著手，以膀胱逼尿肌為靶標(biāo)，以TRPV1 及其下游信號(hào)通路為切入點(diǎn)展開研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示電針“中極”、“關(guān)元”穴后大鼠行為學(xué)、尿流動(dòng)力學(xué)和病理組織形態(tài)均有所恢復(fù)，說(shuō)明該兩穴可有效改善逼尿肌反射亢進(jìn)型大鼠尿失禁癥狀。

TRPV1 是一種Ca2+高滲透性的非特異性陽(yáng)離子通道，病理狀態(tài)下，TRPV1 受體被各種炎性遞質(zhì)和蛋白激酶C 等磷酸化而過(guò)度活化，通道開放大量Ca2+內(nèi)流，胞內(nèi)陽(yáng)離子增多，引起神經(jīng)元及其纖維釋放肽類物質(zhì)，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥產(chǎn)生，傳入沖動(dòng)增加［12］。在泌尿道，TRPV1 表達(dá)于初級(jí)感覺(jué)傳入神經(jīng)纖維、膀胱尿路上皮和平滑肌細(xì)胞中，促進(jìn)膀胱充盈期間的傳入神經(jīng)反應(yīng)，感受膀胱擴(kuò)張感覺(jué)［3］。研究發(fā)現(xiàn)SCI 引起逼尿肌過(guò)度活動(dòng)時(shí)，膀胱尿路上皮細(xì)胞中的TRPV1 通道表達(dá)增加［13］。Capsazepine是感覺(jué)神經(jīng)元興奮性毒素TRPV1 的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，可阻斷電壓激活的鈣通道，使感覺(jué)神經(jīng)元脫敏、失活，減小離體膀胱對(duì)膀胱內(nèi)容量負(fù)荷的收縮反應(yīng)［14］，這表明TRPV1 在膀胱感覺(jué)功能中起到了重要作用，介導(dǎo)了SCI 后NB 的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠膀胱組織中TRPV1 蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，表明SCI 可上調(diào)膀胱TRPV1 表達(dá)，激活TRPV1 通路，導(dǎo)致膀胱機(jī)械感受功能被激活。給予電針干預(yù)、抑制劑灌注后，電針組和抑制劑組大鼠膀胱組織中TRPV1 蛋白表達(dá)水平較模型組均顯著降低，提示電針療法的治療作用可能與TRPV1信號(hào)通路活性的抑制有關(guān)。

固有層Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICC）是神經(jīng)調(diào)控膀胱平滑肌的“信號(hào)中轉(zhuǎn)站”、“起搏細(xì)胞”，ICC 細(xì)胞上可表達(dá)多種神經(jīng)受體亞型［15-16］。膀胱神經(jīng)釋放的神經(jīng)遞質(zhì)、肽類物質(zhì)與ICC 細(xì)胞上的神經(jīng)受體結(jié)合后，介導(dǎo)Na+和Ca2+的非選擇性陽(yáng)離子內(nèi)流以及K+外流，啟動(dòng)細(xì)胞去極化，進(jìn)一步誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞收縮［17］。嘌呤能P2X2作為TRPV1 通道下游相關(guān)因子及ICC 細(xì)胞受體在膀胱的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)方面發(fā)揮著重要作用［18］。研究發(fā)現(xiàn)P2X2受體的阻滯可顯著抑制膀胱肌條的收縮，降低膀胱壓力和骨盆神經(jīng)放電，增加有效排尿收縮時(shí)間，減少脊髓反射缺陷引起的逼尿肌過(guò)度活動(dòng)［19-20］。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光雙標(biāo)染色顯示膀胱ICC 細(xì)胞標(biāo)志物C?Kit 與P2X2受體共表達(dá)于膀胱平滑肌肌束邊緣，且膀胱組織中C?Kit、P2X2受體蛋白表達(dá)與TRPV1 表達(dá)趨勢(shì)一致，分析其作用機(jī)制是電針通過(guò)抑制膀胱組織中TRPV1 過(guò)表達(dá)，對(duì)TRPV1 通道產(chǎn)生抑制效應(yīng)，神經(jīng)元敏感性不足導(dǎo)致Ca2+離子滲透性降低使膀胱上皮ATP 釋放減少，激活膀胱黏膜下層感覺(jué)傳入神經(jīng)纖維上的嘌呤能P2X2受體表達(dá)的能力減弱，ICC 細(xì)胞收縮頻率相應(yīng)減少，從而改善逼尿肌和尿道外括約肌的協(xié)調(diào)性，減少膀胱壓力，增加膀胱容量，提高膀胱順應(yīng)性。

綜上所述，電針或許是通過(guò)抑制TRPV1 通道使膀胱內(nèi)的生理活動(dòng)和神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生改變，減少平滑肌收縮頻率，改善膀胱功能。這不僅為電針對(duì)SCI 后NB 的臨床治療提供了新的理論支持與可行思路，也在一定程度上豐富了中醫(yī)治療膀胱功能障礙的科學(xué)依據(jù)，但電針對(duì)TRPV1 通道周圍膜電勢(shì)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。