邱婷，劉志峰，陸程翔

1.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 廈門 361004；2.南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510010；3.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，福建 廈門 361004

重癥中暑是以體溫迅速升高和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為特征的致死性緊急狀態(tài)。腦損傷是其常見(jiàn)表現(xiàn)，具有很高的發(fā)生率，僅次于多器官功能障礙[1-2]。重癥中暑的機(jī)制復(fù)雜，已有研究顯示，腦細(xì)胞凋亡是其重要機(jī)制之一[3]。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種通過(guò)基因技術(shù)新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性神經(jīng)肽。它不僅在血管舒張及神經(jīng)傳導(dǎo)中扮演重要角色，也與腦損傷的發(fā)生、發(fā)展有緊密的關(guān)聯(lián)[4-5]。研究表明，CGRP能顯著增加缺血性病損傷的腦血流，并能減少其缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷[6]。在燙傷、寒冷、紫外線照射、水浸等刺激后，CGRP的表達(dá)也有明顯增加[7-9]。因此，本研究假設(shè)CGRP對(duì)于重癥中暑所致的腦細(xì)胞凋亡損傷也有保護(hù)作用。然而，目前為止，相關(guān)研究甚少。為此，本研究通過(guò)構(gòu)建重癥中暑模型來(lái)探討CGRP對(duì)重癥中暑腦細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康成年雄性Wistar大鼠20只，質(zhì)量200～230 g，置于常溫環(huán)境[12 h光照，室溫(25.0±0.5)℃，濕度(35±5)%]且能自由飲水。

1.2 模型制備及干預(yù) 20只大鼠飼養(yǎng)于室溫(25.0±0.5)℃、濕度(35±5)%的常溫環(huán)境，隨機(jī)分為對(duì)照組、熱打擊組(HS組)、熱打擊+注射CGRP組(HS+CGRP組)、熱打擊+注射CGRP8-37組(HS+CGRP8-37組)，每組5只。造模前大鼠均腹膜腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉。所有大鼠均于熱打擊前插入套管針至頸動(dòng)脈備用(24 g)。對(duì)照組維持在常溫環(huán)境。實(shí)驗(yàn)組均放入人工熱氣候模擬艙，艙內(nèi)控制干球溫度(36.5±0.5)℃、濕度(60±5)%。用肛溫表持續(xù)監(jiān)測(cè)肛溫。當(dāng)肛溫達(dá)到41.0℃中止熱打擊。HS+CGRP組大鼠復(fù)溫后經(jīng)頸動(dòng)脈注射CGRP(2μg/mL，0.5 mL)；HS+CGRP8-37組大鼠復(fù)溫后經(jīng)頸動(dòng)脈注射CGRP8-37(30 nmol/kg，0.5 mL)。HS組、對(duì)照組僅注射等量生理鹽水。

1.3 腦組織采集及處理

1.3.1 腦組織采集 各組大鼠于造模后2 h行麻醉后立即解剖取腦。大鼠腦浸入10%中性甲醛溶液內(nèi)固定并行脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)。腦組織切片(3 mm)行蛋白免疫印跡檢測(cè)。

1.3.2 TUNEL檢測(cè)切片 常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗；將切片浸入新鮮配制的3%過(guò)氧化氫(H2O2)，室溫封閉20 min，PBS漂洗；之后將切片浸入0.1%Triton x-100通透液中，室溫促滲，PBS漂洗；依次加入TUNEL混合工作液反應(yīng)。然后再加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)工作液，室溫顯色反應(yīng)，PBS漂洗；用蘇木素復(fù)染、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。每張切片選3個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.3.3 蛋白免疫印跡檢測(cè) 腦組織塊以裂解液進(jìn)行裂解。用蛋白質(zhì)定量(BCA)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。之后稀釋樣本至2μg/μL。取40μg樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上蛋白樣品轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上并加入兔一抗封閉過(guò)夜。次日5%脫脂奶粉-等滲緩沖鹽溶液(TBST)稀釋二抗，羊抗兔IgG(H+L)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中以β-actin作為內(nèi)參照。繼以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)反應(yīng)后顯影、定影。用Quantity One軟件進(jìn)行定量測(cè)定(v4.62版本)。結(jié)果以待測(cè)蛋白與內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的灰度值比值表示。

1.4 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。所有計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較，方差齊性者采用Bonferroni法；方差不齊者采用Dunnett's T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦細(xì)胞凋亡情況比較 如圖1、表1所示，與對(duì)照組比較，熱打擊后(HS組)顯著增加神經(jīng)細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。注射CGRP可以明顯抑制熱打擊誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，與HS組比較，HS+CGRP組的凋亡細(xì)胞明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。相反，注射CGRP8-37則增加了熱打擊誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，與HS組比較，HS+CGRP8-37組的凋亡細(xì)胞明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠腦細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比較(±s，n=5)

表1 各組大鼠腦細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比較(±s，n=5)

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05，與HS組比較，b P＜0.05。

組別對(duì)照組HS組HS+CGRP組HS+CGRP8-37組F值P值TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1.97±0.43 11.23±2.86a 4.21±1.05b 18.67±3.67b 39.986 0.001

圖1 TUNEL檢測(cè)各組腦細(xì)胞凋亡水平(×200)

2.2 各組大鼠活化Caspase-3蛋白水平比較 蛋白免疫印跡檢測(cè)顯示腦細(xì)胞Caspase-3蛋白水平在HS組較對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。注射CGRP可以明顯抑制Caspase-3蛋白水平的增高，與HS組比較，HS+CGRP組Caspase-3蛋白水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而HS+CGRP8-37組的Caspase-3蛋白水平與HS組比較則明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖2和表2。

圖2 各組大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)水平

表2 各組大鼠腦細(xì)胞Caspase-3比較(±s，n=5)

表2 各組大鼠腦細(xì)胞Caspase-3比較(±s，n=5)

組別對(duì)照組HS組HS+CGRP組HS+CGRP8-37組F值P值Caspase-3 0.23±0.04 0.59±0.12a 0.41±0.09b 0.79±0.10b 32.387 0.001

2.3 各組大鼠Bcl-2水平比較 接受熱打擊后，HS組Bcl-2蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。注射CGRP后，HS+CGRP組Bcl-2蛋白水平較HS組顯著增加，接近于對(duì)照組水平，與HS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。注射CGRP8-37后，Bcl-2顯著下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而與HS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖3和表3。

圖3 各組大鼠腦組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平

注：與對(duì)照組比較，a P＜0.05。

3 討論

根據(jù)其病理生理反應(yīng)，重癥中暑被定義為與系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)及誘發(fā)多器官功能障礙相關(guān)的高熱狀態(tài)。其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害尤其明顯[10-11]。當(dāng)熱負(fù)荷持續(xù)存在時(shí)，熱損傷將會(huì)進(jìn)展。其癥狀可從輕癥的熱驚厥到重癥的死亡。對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理變化的認(rèn)識(shí)對(duì)于重癥中暑機(jī)制的理解十分必要。然而，目前相關(guān)資料甚少。BOUCHAMA等[3]證實(shí)熱打擊后腦內(nèi)出現(xiàn)了包括腦細(xì)胞凋亡增加等不同情況的損害。在熱打擊的鼠模型中，甚至在體溫39℃時(shí)即出現(xiàn)了明顯的腦細(xì)胞凋亡等損害，而隨著溫度的上升這種損害進(jìn)一步加重，即使復(fù)溫處理也不能阻止[12]。然而，這種損害的機(jī)制仍不清楚。臨床上還缺乏有效的方法來(lái)阻止這種腦損傷。CGRP是新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性神經(jīng)肽，其在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布廣泛，并且被認(rèn)為在腦梗塞、蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦創(chuàng)傷以及膿毒癥等多種類型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害中有保護(hù)性作用[13-16]。因此，本研究對(duì)這一潛在保護(hù)性因素進(jìn)行了探討。

臨床及實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡是引起各種類型腦損傷的重要原因。凋亡有雙面效應(yīng)：它能清除老化細(xì)胞而發(fā)揮保護(hù)作用，而過(guò)度的凋亡則導(dǎo)致大量神經(jīng)細(xì)胞喪失而損害神經(jīng)功能，引起繼發(fā)性損害。隨著對(duì)重癥中暑機(jī)制的持續(xù)深入理解，越來(lái)越多的研究表明熱打擊也能誘導(dǎo)腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12，17]。CGRP對(duì)熱打擊所致腦細(xì)胞凋亡的作用尚未得到證實(shí)。因此，本研究檢測(cè)了大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，熱打擊誘發(fā)的細(xì)胞凋亡被CGRP明顯地削弱。相反的，CGRP8-37則增加了細(xì)胞凋亡(CGRP8-37為CGRP8特異性拮抗劑)?？梢酝茰y(cè)CGRP在熱打擊中能抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。已知CGRP是通過(guò)激活G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的。其激活可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP增高并進(jìn)一步改變包括凋亡在內(nèi)的細(xì)胞功能。Caspase-3蛋白在凋亡中起著關(guān)鍵性作用。它是凋亡最常見(jiàn)的下游調(diào)控因素[18-19]。相關(guān)研究顯示，CGRP在心臟、腦、胃腸道缺血再灌注損傷中的細(xì)胞保護(hù)作用是通過(guò)下調(diào)Caspase-3來(lái)實(shí)現(xiàn)的[20-21]。本研究通過(guò)檢驗(yàn)熱打擊后CGRP是否能調(diào)節(jié)Caspase-3蛋白水平來(lái)探討其相關(guān)的分子機(jī)制。結(jié)果顯示，注射CGRP在熱打擊后能顯著降低Caspase-3蛋白水平，而注射CGRP8-37則相反。這提示CGRP能通過(guò)干預(yù)Caspase-3發(fā)揮對(duì)凋亡的抑制作用。這個(gè)結(jié)果與既往研究結(jié)果相近。然而，仍然不清楚下調(diào)Caspase-3的是哪個(gè)上游信號(hào)，這需要進(jìn)一步的研究。已知Bcl-2是調(diào)節(jié)凋亡過(guò)程的基因家族的基本成員之一，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Caspase-3活性來(lái)發(fā)揮作用。因此，在檢測(cè)Caspase-3活性的同時(shí)進(jìn)行Bcl-2檢測(cè)，可以進(jìn)一步佐證腦組織凋亡的變化情況。本研究中，注射CGRP后，大鼠腦組織Bcl-2出現(xiàn)了明顯增高，更加說(shuō)明了CGRP對(duì)腦組織凋亡的抑制作用。

綜上所述，CGRP對(duì)于重癥中暑腦細(xì)胞凋亡有抑制作用，而且證實(shí)其機(jī)制是通過(guò)下調(diào)Caspase-3來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。本研究對(duì)CGRP在重癥中暑中的作用提出了新的看法，但是對(duì)于重癥中暑腦損害的檢測(cè)只局限于單一時(shí)間點(diǎn)，缺乏更長(zhǎng)期的觀察。因此，需要更進(jìn)一步的研究來(lái)探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。