李云逸 婁越 楊立成

（中國(guó)船舶重工集團(tuán)公司第七一一研究所，上海 201108）

目前，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的自動(dòng)化核酸檢測(cè)工作站，基本為國(guó)外壟斷，國(guó)外裝備價(jià)格昂貴，并且需要專用試劑盒與耗材配套使用，使用上的局限性和高昂的維護(hù)成本限制了其在國(guó)內(nèi)的推廣。目前，我國(guó)在全自動(dòng)的重要病原體高通量核酸檢測(cè)設(shè)備領(lǐng)域還處于起步階段，急需研發(fā)出一款具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高通量核酸檢測(cè)自動(dòng)化檢測(cè)設(shè)備。本項(xiàng)目研發(fā)出一款環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、高性價(jià)比、快速高通量、多樣本多位點(diǎn)核酸檢測(cè)分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有DNA/RNA 提取、實(shí)時(shí)定量熒光檢測(cè)和基于人工智能的病原體分類功能，可安全且高效的完成大規(guī)模核酸檢測(cè)工作，可快速部署應(yīng)用于不具有P2+實(shí)驗(yàn)環(huán)境的方艙醫(yī)院、基層社區(qū)醫(yī)院和生物科研單位，對(duì)我國(guó)體公共衛(wèi)生安全的發(fā)展有重要意義。

1 核酸檢測(cè)工藝流程

設(shè)計(jì)生產(chǎn)密閉P2+環(huán)境自動(dòng)工作站，集成拭子暫存和掃碼、核酸提取、RT-PCR 反應(yīng)、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 擴(kuò)增4 個(gè)工作區(qū)，并通過(guò)機(jī)械臂和自動(dòng)化控制程序，實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)操作。在一個(gè)密閉工作站內(nèi)，對(duì)SARS-CoV-2 感染的肺炎疑似病例的咽拭子、肺泡灌洗液和痰液樣本中新型冠狀病毒的檢測(cè)，保證在4小時(shí)內(nèi)完成從樣本RNA 抽提到實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 的結(jié)果分析。核酸檢測(cè)工藝流程主要分為：樣本處理工藝、樣本純化工藝以及樣本熒光定量工藝。圖1 為總體工藝介紹與各工藝流程示意圖。

圖1 核酸檢測(cè)總體工藝流程

2 設(shè)計(jì)

2.1 系統(tǒng)架構(gòu)

可移動(dòng)式重要病原體高通量核酸檢測(cè)系統(tǒng)除了負(fù)壓隔離系統(tǒng)外，分為硬件驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)和上位機(jī)軟件系統(tǒng)兩大部分。硬件驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)分為控制模塊、封膜模塊、磁棒磁珠吸附模塊、掃碼模塊、噴碼模塊、實(shí)時(shí)熒光PCR 模塊等模塊?？刂颇K采用運(yùn)動(dòng)控制板卡與機(jī)器人實(shí)現(xiàn)核酸提取的動(dòng)作流程；實(shí)時(shí)熒光PCR 模塊采用QuantGene 9600 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析儀。整個(gè)系統(tǒng)主要分為兩部分：一是以PC 為主的抽提/PCR 儀控制系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過(guò)以太網(wǎng)集成ZMC432 運(yùn)動(dòng)控制卡，擴(kuò)展IO 卡以及機(jī)器人和相應(yīng)的氣動(dòng)元器件。通訊方式主要有和機(jī)器人掃碼槍交互的TCP/IP 協(xié)議，運(yùn)動(dòng)控制卡和伺服系統(tǒng)的EtherCat 協(xié)議。上位機(jī)軟件使用Labview開發(fā)，數(shù)據(jù)庫(kù)踩用SQL server2012。二是以PLC 為主的隔離器控制，實(shí)現(xiàn)兩個(gè)艙體的恒負(fù)壓環(huán)境，以及溫濕度檢測(cè)等。實(shí)現(xiàn)恒負(fù)壓主要采用PLC 的PID 功能。溫濕度等數(shù)據(jù)采集組要通過(guò)RS485 協(xié)議，如圖2 所示。

圖2 系統(tǒng)整體架構(gòu)圖

該系統(tǒng)總體構(gòu)成除了主體負(fù)壓隔離器設(shè)備，還包括PC 端控制軟件、抽屜式上料模塊、封膜設(shè)備、開蓋模組、磁棒磁珠吸附模組、96 孔板轉(zhuǎn)移模組、熒光定量PCR 設(shè)備以及移液設(shè)備等：主體設(shè)備是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的核心結(jié)構(gòu)，控制軟件則提供給用戶一個(gè)友好的人機(jī)交互界面，用于調(diào)整實(shí)驗(yàn)所需參數(shù)以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程的自動(dòng)化控制；移液槍用來(lái)進(jìn)行樣本前處理，將待測(cè)樣本添加至96 孔深孔板1，以及將純化樣本移液至96 孔PCR 板；掃描器用于掃描卡盒上的條形碼，自動(dòng)識(shí)別檢測(cè)類型，并完成實(shí)驗(yàn)條件的配置。核酸檢測(cè)一體機(jī)針對(duì)傳染病檢測(cè)容易產(chǎn)生同批次交叉污染的特點(diǎn)，采用負(fù)壓隔離器的設(shè)計(jì)方式，能夠在一體機(jī)內(nèi)完成全部的檢測(cè)流程，實(shí)現(xiàn)了核酸提取、實(shí)時(shí)熒光PCR 與數(shù)據(jù)分析的高度集成。

2.2 可移動(dòng)式重要病原體高通量核酸檢測(cè)裝備的布置與組成

可移動(dòng)式重要病原體高通量核酸檢測(cè)一體機(jī)主要由PCR艙體與DNA/RNA 抽提艙體組成，設(shè)備長(zhǎng)3350 寬1200 高2250，抽提艙長(zhǎng)1850 寬1200 高2250，PCR 艙長(zhǎng)1500 寬1200 高2250，各個(gè)艙體的布置與組成如圖3-6 所示。

圖3 核酸檢測(cè)裝備布局圖

圖4 RNA 抽提艙

3 裝備主要硬件設(shè)備

3.1 隔離器

無(wú)菌隔離器由整體不銹鋼板作為艙體的材料，用滿焊拋光處理，再集成了通風(fēng)過(guò)濾系統(tǒng)、手套操作附件、控制系統(tǒng)等組成一個(gè)智能化的隔離器。

3.1.1 汽化過(guò)氧化氫滅菌功能

內(nèi)置汽化過(guò)氧化氫滅菌功能，能對(duì)細(xì)菌病毒徹底殺滅，通過(guò)驗(yàn)證可實(shí)現(xiàn)生物指示物下降＞6log。通過(guò)測(cè)試分析出對(duì)滅菌效果影響最為突出的因素，在滅菌開發(fā)過(guò)程中采取控制措施，確保滅菌效果和重演性。

圖5 PCR 艙

圖6 上料工位示意圖

3.1.2 動(dòng)態(tài)防護(hù)功能

隔離器防護(hù)區(qū)安裝獨(dú)立的送排風(fēng)系統(tǒng)，系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)防護(hù)區(qū)內(nèi)氣流由低風(fēng)險(xiǎn)區(qū)向高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)流動(dòng)?；谏鲜隹剂?，所配置獨(dú)立的空調(diào)系統(tǒng)進(jìn)行室外取風(fēng)并在風(fēng)險(xiǎn)最高的排風(fēng)口配置生物防護(hù)過(guò)濾器，如獨(dú)立的袋進(jìn)袋出高效過(guò)濾器或集成于對(duì)應(yīng)的空調(diào)系統(tǒng)中。

3.2 高精度微量液體處理技術(shù)

本論文已完成對(duì)高精度微量移液泵的設(shè)計(jì)研究工作，設(shè)計(jì)了一種新型精密移液裝置，結(jié)構(gòu)緊湊，移液精度與移液效率高。并提出了一種移液器自動(dòng)液位檢測(cè)方法。包括可以實(shí)現(xiàn)過(guò)盈配合的移液泵與移液吸頭，移液泵內(nèi)包含有運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)液體的吸取和排出，實(shí)現(xiàn)液體的移取。

3.2.1 采用電容測(cè)量芯片構(gòu)建基于電容傳感器的液面檢測(cè)裝置，研究導(dǎo)電吸液頭在入液前后電容值的改變情況，據(jù)此可設(shè)定閾值對(duì)液面高度進(jìn)行判斷。

移液吸頭為不導(dǎo)電材料制成，在沿母線的兩側(cè)有兩條導(dǎo)電金屬嵌入壁中，作為電容器的兩極板。當(dāng)移液吸頭內(nèi)無(wú)液體時(shí)，電容兩極板間電介質(zhì)為空氣，當(dāng)存在液體時(shí)，電容兩極板間電介質(zhì)為液體與空氣，電介質(zhì)介電常數(shù)發(fā)生改變，電容量發(fā)生變化。通過(guò)讀取電容器極板電信號(hào)的變化，可以計(jì)算出移液吸頭中的液位高低以及液體含量。電容是指在給定電位差下的電荷儲(chǔ)藏量（記為c，單位法拉F），正常情況下電荷在電場(chǎng)中受力產(chǎn)生移動(dòng)，當(dāng)導(dǎo)體之間介質(zhì)陰礙了電荷的移動(dòng)而使得電荷在導(dǎo)體上累積儲(chǔ)存，儲(chǔ)存的電荷量則被稱為電容，在物理學(xué)中電容的表達(dá)式為：

式中：Q 為儲(chǔ)存電荷量；U 為電極板之間電壓；A 為電極板重疊面積；d 為電極板之間的距離；ε 為介質(zhì)介電常數(shù)，ε0為真空介電常數(shù)，εr為相對(duì)介電常數(shù)，且ε=ε0εr。

由公式可以看出電容值的大小與電極板之間的距離、有效重疊面積及介質(zhì)有關(guān)，因此可以通過(guò)控制變量的方法研究參數(shù)對(duì)電容值的影響，根據(jù)可變參數(shù)的不同，電容式傳感器的檢測(cè)方法分為面積型、距離型和介質(zhì)型三種不同的類型，面積型檢測(cè)方法主要是利用導(dǎo)電槍頭端部橫截面積與底部金屬操作臺(tái)之間形成電容，由于槍頭截面較小，電容變化不是很明顯，需要高靈敏度傳感器才能測(cè)得，而距離型的檢測(cè)方法在實(shí)現(xiàn)上較為復(fù)雜，因此在本次工作站設(shè)計(jì)中采用基于介質(zhì)型電容式液面探測(cè)，其原理如圖7 所示，利用槍頭雙金屬層結(jié)構(gòu)形成電容。

圖7 電容式液面探測(cè)原理

雙金屬層結(jié)構(gòu)中兩金屬管充當(dāng)正負(fù)電極板，當(dāng)接觸到液體表面時(shí)電極板之間的介質(zhì)由空氣逐漸從單一空氣轉(zhuǎn)變?yōu)榭諝夂痛郎y(cè)樣本，因此在接觸液面時(shí)總電容開始發(fā)生變化，總電容等于空氣介質(zhì)產(chǎn)生的電容和待測(cè)樣本產(chǎn)生的電容之和：

式中：R 為金屬管外徑；r 為金屬管內(nèi)徑；H 為金屬管內(nèi)介質(zhì)總高度；h 為槍頭下探深度；ε1為空氣介電常數(shù)；ε2為液體樣本介電常數(shù)；C0為初始電容；?C為電容變化量。

通過(guò)雙金屬層結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行液面探測(cè)，通過(guò)公式轉(zhuǎn)換，還可以根據(jù)檢測(cè)到的電容變化量反推出移液槍頭在液面下的深度h：

在利用該電容傳感器進(jìn)行液位探測(cè)時(shí)，當(dāng)移液槍頭接觸液面的瞬間介質(zhì)發(fā)生改變，介電常數(shù)變大，電容值明顯變大，當(dāng)槍頭停止下探時(shí)電容值不再發(fā)生變化；待吸液操作完成后移液槍頭開始離開液體，介電常數(shù)變小，電容值逐漸減小，當(dāng)離開液面時(shí)電容值恢復(fù)到初始值。因此雙金屬層結(jié)構(gòu)的電容傳感器不僅可以通過(guò)設(shè)定的閾值來(lái)判斷移液槍頭是否進(jìn)入或離開液面，還能反推出槍頭在液面下深度。

3.2.2 對(duì)移液過(guò)程中的氣泡、泡沫、Tip 頭過(guò)早的離開液面（吸液量不足檢測(cè)）以及容器中沒有液體（吸空檢測(cè)）進(jìn)行檢測(cè)，保證移液過(guò)程的穩(wěn)定性。

4 軟件系統(tǒng)組成

高通量核酸檢測(cè)一體機(jī)的上位機(jī)軟件主要分為控制檢測(cè)試驗(yàn)和數(shù)據(jù)管理兩大部分。

4.1 控制檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

首先根據(jù)核酸檢測(cè)的工藝流程，開發(fā)一套標(biāo)準(zhǔn)的核酸檢測(cè)控制軟件，包括掃碼、機(jī)械手震蕩混勻、樣本開蓋、微量液體處理、控制磁珠吸附、封膜控制、PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示等。核酸檢測(cè)一體機(jī)的上位機(jī)軟件設(shè)計(jì)分為兩種模式，第一種模式為根據(jù)正常的檢測(cè)的流程，開發(fā)完整的全自動(dòng)核酸檢測(cè)功能，用戶做好實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備后，直接點(diǎn)擊開始，設(shè)備開始自動(dòng)檢測(cè)，直至檢測(cè)完成后結(jié)束。第二種模式為，用戶可根據(jù)待測(cè)物，自行配置檢測(cè)流程，定義某項(xiàng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)，完成試驗(yàn)研究。

4.2 數(shù)據(jù)管理

數(shù)據(jù)管理涉及數(shù)據(jù)的獲取、分析和分享。改軟件需要從熒光定量PCR 儀獲取擴(kuò)增曲線及檢測(cè)結(jié)果，并顯示于上位機(jī)軟件界面。同時(shí)可對(duì)所有的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，形成報(bào)告，全部參數(shù)可儲(chǔ)存，避免數(shù)據(jù)丟失。

5 基于分類算法的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)在病原體分類、檢測(cè)中的應(yīng)用

本論文提出采用分類算法、數(shù)據(jù)挖掘分析技術(shù)協(xié)助檢測(cè)人員進(jìn)行診斷。首先，提供一批標(biāo)記數(shù)據(jù)讓機(jī)器進(jìn)行學(xué)習(xí)，可移動(dòng)式重要病原體高通量核酸檢測(cè)一體機(jī)還可在日常檢測(cè)中收集更多的病原體數(shù)據(jù)，同時(shí)根據(jù)大數(shù)據(jù)分析的結(jié)果迭代修改一些判定的權(quán)重參數(shù)，根據(jù)這些數(shù)據(jù)研究基于各種經(jīng)典分類算法的推理機(jī)方案，使用近鄰，統(tǒng)計(jì)以及決策樹等不同思想基礎(chǔ)的分類算法進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)分析，獲得具有疾病病理特征的潛在因子，從而篩選出適用于病原體檢測(cè)的分類算法。其次，通過(guò)系列稀釋“核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)”，并混合各類生物樣本，模擬抑制PCR 反應(yīng)的環(huán)境，對(duì)不同濃度的模板進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，獲得Ct值和擴(kuò)增曲線，并將結(jié)果交給AI 進(jìn)行訓(xùn)練，積累陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)據(jù)，最終通過(guò)人工智能來(lái)幫助判別擴(kuò)增結(jié)果是陽(yáng)性還是陰性，如圖8 所示。

圖8 病原體分類體系架構(gòu)

6 結(jié)論

智能化核酸檢測(cè)分析一體機(jī)具有可移動(dòng)性、高環(huán)境適應(yīng)性和智能化處理能力，配合野外樣品核酸快速抽提試劑盒以及整合的病原數(shù)據(jù)庫(kù)和結(jié)果展示技術(shù)，可以使野外或密閉艙室環(huán)境下的病原檢測(cè)所需工具簡(jiǎn)化成一臺(tái)筆記本和一個(gè)高通量可移動(dòng)裝備，實(shí)現(xiàn)病原菌的實(shí)時(shí)檢測(cè)。