李會(huì)娟 甄興剛 張曼 靳秀紅

1河南省兒童醫(yī)院呼吸科 河南鄭州 450000；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒內(nèi)科

哮喘是以氣道炎癥為主要病理特點(diǎn)的常見(jiàn)呼吸系統(tǒng)疾病，臨床普遍認(rèn)為哮喘的發(fā)生是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果，目前尚無(wú)根治的有效方案。因此臨床治療以控制癥狀和降低相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)為主要目的。近年臨床研究普遍認(rèn)為，哮喘的控制率受諸多因素影響，兒童作為哮喘中的特殊人群，其臨床控制率對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、生活質(zhì)量均有著直接的影響[1-2]。目前布地奈德福莫特羅吸入治療是維持哮喘穩(wěn)定性的有效治療方案；但研究顯示，仍有約10%的患者治療無(wú)效，其中基因的多態(tài)性是導(dǎo)致治療無(wú)效的重要因素[3]。鑒于此，本研究對(duì)兒童哮喘T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(TBX21)基因rs2240017位點(diǎn)和腺苷酸環(huán)化酶9抗體(ADCY9)基因rs2230739位點(diǎn)進(jìn)行觀察分析，旨在探討基因多態(tài)性在布地奈德福莫特羅吸入治療中的作用，為優(yōu)化臨床治療方案提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1一般資料 經(jīng)河南省兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，以2019年1月～2020年5月于河南省兒童醫(yī)院呼吸科確診為哮喘的198例患兒作為研究對(duì)象，患兒年齡6～12歲，平均(9.14±1.26)歲，男137例，女61例；病情程度：慢性持續(xù)期112例，中度持續(xù)期86例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合中國(guó)兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016版)[4]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡6～12歲；③近1個(gè)月無(wú)糖皮質(zhì)激素治療史；④自愿參與本次研究，家長(zhǎng)簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1個(gè)月有呼吸系統(tǒng)感染者；②合并有其他呼吸系統(tǒng)疾病者；③合并有肝、腎、心功能異常者；④具有本研究治療藥物禁忌者。

1.2方法

1.2.1治療方法 所有患兒均給予布地奈德福莫特羅吸入劑治療(AstraZeneca AB公司提供，規(guī)格：80μg布地奈德/4.5μg福莫特羅*60吸*1支，生產(chǎn)批號(hào)20180907)，每次1吸，2次/d，連續(xù)治療12周。

1.2.2口腔黏膜細(xì)胞采集和目的基因多態(tài)性測(cè)定 采集標(biāo)本前禁飲食30min，用采樣拭子在患兒頰內(nèi)壁反復(fù)刮拭7次，采樣完成后儲(chǔ)存于采集管中，常溫保存。使用北京天根(TianGen)公司口腔拭子基因組DNA提取試劑盒抽提DNA，-20℃保存。基因分型由上海解碼醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF，美國(guó)Agena Bioscience)進(jìn)行檢測(cè)。引物利用MassARRAY Assay Design 4.0軟件設(shè)計(jì)，由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成。檢測(cè)的ADCY9#553 T/Crs2230739基因位點(diǎn)、TBX21#555 C/Grs2240017基因位點(diǎn)和引物信息見(jiàn)表1。檢測(cè)步驟包括PCR擴(kuò)增、蝦堿性磷酸酶純化、延伸反應(yīng)、樹(shù)脂純化、點(diǎn)樣到芯片及上機(jī)檢測(cè)。兩位點(diǎn)分型結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 檢測(cè)基因位點(diǎn)和引物信息

圖1 rs2230739 和 rs2240017SNP分型結(jié)果

1.2.3療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)中國(guó)兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016版)[4]中≥6歲兒童哮喘控制水平分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)近4周哮喘癥狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)估項(xiàng)目：①日間癥狀>2次/周；②夜間因哮喘憋醒；③應(yīng)急緩解藥物使用>2次/周；④因哮喘而出現(xiàn)活動(dòng)受限。良好控制：無(wú)上述各項(xiàng)；部分控制：存在1～2項(xiàng)；未控制：存在3～4項(xiàng)。

2 結(jié)果

2.1基因組合類型分布 各基因組合類型檢出率見(jiàn)表2。198例患兒中部分控制、完全控制者共170例，未控制者28例，總有效率85.85%。IgE水平比較，ADCY9#553 T/C點(diǎn)位基因差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.303，P=0.001)，TBX21#555 C/G點(diǎn)位基因差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.673，P=0.512)。由于TBX21#555 C/G中GG檢出率<30例，不滿足統(tǒng)計(jì)分析要求，因此不納入后續(xù)分析中。

表2 基因組合類型分布及IgE水平比較

2.2不同基因組合類型患兒治療效果比較 ①ADCY9#553 T/Crs2230739位點(diǎn)各基因組合類型臨床療效差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組內(nèi)兩兩比較后，治療效果CT>TT>CC△。②TBX21#555 C/Grs2240017位點(diǎn)中，治療效果CC▲>CG。見(jiàn)表3。

表3 不同基因組合類型患兒治療效果比較[例(%)]

2.3基因組合治療效果影響因素分析 以治療效果為因變量(有效=1，無(wú)效=0)，年齡、性別、病程以及基因組型為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析顯示，性別、年齡、病情程度均不是患兒治療效果的影響因素(P>0.05)，ADCY9#553 T/Crs2230739和TBX21#555 C/Grs2240017基因組型與治療效果有關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 基因組合治療效果影響因素分析

3 討論

哮喘是兒童常見(jiàn)慢性呼吸系統(tǒng)疾病，全球哮喘倡議指南中推薦使用皮質(zhì)類固醇/長(zhǎng)效β2受體激動(dòng)劑組合藥物進(jìn)行維持性緩解治療[5]，在控制癥狀、預(yù)防惡化、減少對(duì)短效緩解藥物的需求以及改善肺功能方面相比單一維持性高劑量吸入性皮質(zhì)類固醇治療效果更佳[6-7]。盡管該治療方案被證實(shí)有效，但仍有不少患兒遭受周期性惡化的困擾。其原因，一方面哮喘的發(fā)作與局部和全身炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，兒童處于身體、情緒、認(rèn)知以及生活環(huán)境快速變化時(shí)期，這為誘發(fā)哮喘急性發(fā)作或惡化提供了諸多不確定因素，因此哮喘患兒作為哮喘中的特殊群體，相比成人哮喘更加難以控制。另一方面，近年越來(lái)越多的研究證實(shí)，遺傳因素在哮喘兒童的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。目前已證實(shí)FCER2和ADRB2分別是影響吸入性皮質(zhì)類固醇和β受體激動(dòng)劑治療效果的基因類型，但尚有其他基因類型在藥物治療中的作用有待進(jìn)一步研究[8]。

TBX21是T-box基因家族成員，臨床報(bào)道顯示其基因多態(tài)性與哮喘兒童的氣道高反應(yīng)性有關(guān)，研究表明，TBX21基因rs2240017多態(tài)性患者在接受吸入性皮質(zhì)類固醇治療12周后癥狀控制率顯著下降[9]，由此提示TBX21基因rs2240017多態(tài)性是影響臨床控制率的潛在反應(yīng)性生物標(biāo)記物。福莫特羅作為β受體激動(dòng)劑代表藥物之一，其含有的沙丁胺醇是用于搶救急性支氣管痙攣的ADRB2選擇性藥物，激活的ADRB2可在腺苷酸環(huán)化酶的介導(dǎo)下傳遞信號(hào)。研究認(rèn)為，I772M氨基酸替換的ADCY9基因rs2230739(T/C)編碼區(qū)的多態(tài)性相比原始ADCY9的腺苷酸環(huán)化酶活性明顯降低[10]。臨床研究也證實(shí)，ADCY9基因多態(tài)性與布地奈德福莫特羅治療效果有關(guān)[11]。TBX21基因rs2240017多態(tài)性、ADCY9基因rs2230739多態(tài)性分別與吸入性皮質(zhì)類固醇、β受體激動(dòng)劑治療有關(guān)，因此假設(shè)不同基因組型患兒在布地奈德福莫特羅治療中存在差異。

本次研究結(jié)果顯示，在TBX21基因rs2240017位點(diǎn)中CC▲、CG和GG各型的檢出率分別為80.81%、17.17%和2.02%，其中GG因檢出患者不足30例，因此不進(jìn)行療效統(tǒng)計(jì)，而CC▲和CG相比，CC▲治療效果優(yōu)于CG，臨床良好控制率分別為28.13%和20.59%，有效控制率分別為84.37%、88.24%。ADCY9基因rs2230739點(diǎn)位中CC△、CT和TT的檢出率分別為14.65%、48.99%和36.36%，臨床治療效果CT>TT>CC△，臨床良好控制率分別為28.87%、27.78%和27.59%，有效控制率分別為93.47%、83.33%和72.4%。因此ADCY9基因rs2230739位點(diǎn)中CT型哮喘患兒的臨床有效控制率最佳，為93.47%，良好控制率可達(dá)28.87%，并且不受年齡、性別以及病情嚴(yán)重程度的影響。

由此本研究認(rèn)為，TBX21基因rs2240017位點(diǎn)、ADCY9基因rs2230739位點(diǎn)不同基因型哮喘患兒在接受布地奈德福莫特羅吸入粉霧劑治療后的臨床有效控制率差異顯著，其中以ADCY9基因rs2230739位點(diǎn)CT型療效最佳，有效控制率為93.47%，而CC△型治療效果最差，有效控制率為72.41%，該結(jié)果可為確定臨床最佳治療方案提供依據(jù)，針對(duì)療效不佳的患兒基因組型有待進(jìn)一步探索高效治療方案，這也將成為下一步研究的重點(diǎn)。