劉昊陽 徐寧 田記超 邵帥銘 劉維宇 楊衛(wèi)良

骨肉瘤，一種骨組織惡性腫瘤，其結締組織能直接誘導產生腫瘤骨或骨樣組織，常發(fā)生于管狀骨，例如股骨下端及脛骨上端，且預后不良；主要發(fā)生于青少年，在兒童惡性腫瘤中發(fā)生率為 5%[1]。近 40 年來，從手術、治療和放射治療方面的最新進展來看，骨肉瘤患者的 5 年存活率，已從不足 20% 上升到 70%[2]。張清等[3]統(tǒng)計的 10 年數(shù)據(jù)證明，患者一旦出現(xiàn)遠處組織轉移，平均生存時間一般 < 1 年。所以有必要進一步進行骨肉瘤基因水平的研究。近 30 年來，一些 LncRNA 逐漸被發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤組織中有不同的表達和影響，LncRNA 是沒有編碼蛋白質功能的一組長度 > 200 個核苷酸的基因編碼產物，其在多種腫瘤病情的發(fā)展中發(fā)揮重要功能；現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其在不同物種中的自我保守性不穩(wěn)定，但某些表達重要功能的 LncRNA 中，含有部分高保守元件，這些高保守元件可維持其功能的穩(wěn)定表達，降低異變性，這可能是一個治療骨肉瘤的靶點方向[4]。而近年來發(fā)現(xiàn) LncRNA 與 miRNA 存在海綿效應，即 LncRNA 作為 miRNA 的內源競爭性 RNA ( ceRNA )，可像海綿吸水一樣將 miRNA 吸附到 LncRNA 的長鏈上進行調控作用，進而發(fā)揮促進或抑制骨肉瘤發(fā)展的功能?，F(xiàn)就骨肉瘤中 miRNA 關聯(lián)的長鏈非編碼 RNA 的研究進展綜述如下。

一、促進骨肉瘤增殖發(fā)展的 LncRNA

最新的許多研究表明，較多 LncRNA 對骨肉瘤的病情發(fā)展有促進作用，將其沉默后可達到緩解病情的目的，而其中大部分都與 miRNA 有關。

1. ADPGK-AS1：Luo 等[5]研究發(fā)現(xiàn) ADPGK-AS1 在骨肉瘤組織與細胞中被大量誘導表達，而 miR-542-3p 在同等環(huán)境下表達降低；功能實驗表明，抑制 ADPGK-AS1 可以促進細胞凋亡。同時 miR-542-3p 被證實是 ADPGK-AS1 的靶向 miRNA，miR-542-3p 表達上調可以逆轉 ADPGK-AS1對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的正向作用。但其中詳細分子機制尚待進一步研究。

2. LINC00963：Zhou 等[6]經研究發(fā)現(xiàn) LINC00963 在骨肉瘤細胞中高表達。熒光素酶報告基因實驗顯示，LINC00963 可以通過靶向結合 miR-204-3p 來抑制其表達；此外，研究初步證明了 FN1 ( 纖維連接蛋白 1，F(xiàn)ibronectin-1 ) 是 LINC00963 / miR-204-3p 軸在骨肉瘤中的靶點，F(xiàn)N1 是纖維連接蛋白家族的一個成員，近年來的研究已證明其與多種癌癥的侵襲遷移有關[7-8]，但其在骨肉瘤中詳細作用機制尚不明朗，綜上所述，LINC00963 可通過負向調控 miR-204-3p，并促進 FN1 的表達來增強骨肉瘤細胞的增殖和遷移。

表1 14 種 Lnc RNATab.1 14 kinds of Lnc RNA

3. SND1-IT1：SND1-IT1 在近期研究中被發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中過表達[9]。實驗發(fā)現(xiàn) miRNA-665 是 SND1-IT1 的靶基因，兩者呈負相關，而 POU2F1 ( 第 2 類 POU 結構域轉錄因子 1 ) 是 miRNA-665 的靶基因，其過表達可導致 DNA異常表達，并且可以促細胞上皮轉化 EMT[10-11]，實驗發(fā)現(xiàn)，miRNA-665 可使 POU2F1 表達水平降低，而 SND1-IT1可促進其表達。由此可初步推測，SND1-IT1 可通過抑制miRNA-665 表達從而上調 POU2F1，加強骨肉瘤的增殖和遷移能力，最終促進骨肉瘤的進展。

4. TMPO-AS1：TMPO-AS1 在近期研究中被發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤組織和細胞中顯著過表達[12]。研究表明，TMPO-AS1可以靶向結合于 miR-199a-5p，且 miR-199a-5p 的過表達可抑制骨肉瘤發(fā)展。此外，WNT7B ( Wnt 蛋白家族 7B 抗體 ) 是 Wnt / β-catenin 通路的關鍵成分之一[13]，其被證實是 miR-199a-5p 的下游基因，過表達可促進組織上皮化，提高細胞異型性。挽救實驗表明，在抑制 miR-199-5p 表達的骨肉瘤組織中再度抑制 WNT7B，細胞增殖程度下降，這證明了 WNT7B 的表達被 miR-199a-5p 反向調控。由此可推測 TMPO-AS1 通過負向作用于 miR-199a-5p，增強了 WNT7B 表達，從而促進骨肉瘤的發(fā)展，這為臨床治療提供了全新的治療方向。Liu 等[14]發(fā)現(xiàn) TMPO-AS1 與miR-329 呈負相關，miR-329 與 E2F1 呈負相關；E2F1 是一個關鍵的細胞內轉錄因子，是 E2F 家族中第一個克隆的蛋白，其與 EMT 高度相關，因此 TMPO-AS1 可通過負調控 miR-329 來促進 E2F1 表達，進而促進 EMT 的發(fā)展，最終導致骨肉瘤發(fā)生發(fā)展。

5. RP11-361F15.2：RP11-361F15.2 經最新研究發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤組織中顯著升高[15]。研究發(fā)現(xiàn) miR-30c-5p 可負向作用于 CPEB4 ( 胞質聚腺苷酸結合蛋白 4 )，而 RP11-361F15.2 可通過競爭性地結合 miR-30c-5p 來上調 CPEB4的表達，而 CPEB4 在多種人類腫瘤中均有異常表達[16]，且在癌癥患者中的異常表達與預后有顯著相關性。而在骨肉瘤中，RP11-361F15.2 可通過抑制 miR-30c-5p 使 CPEB4的表達上調，從而促使骨肉瘤細胞遷移侵襲，另外 RP11-361F15.2 還可以誘導 TAMs 極化，研究已證實腫瘤相關巨噬細胞 ( TAMs ) 的極化被認為在腫瘤遷移和侵襲中起關鍵作用[17]；但關于 RP11-361F15.2 相關的 TAMs 極化方面的詳細分子機制尚不明確，應進一步深入研究。

6. PCAT6：Zhu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中 PCAT6表達升高，并且 PCAT6 的表達上調與骨肉瘤細胞的轉移狀態(tài)和晚期預后呈正相關。此外 PCAT6 可作為 ceRNA負向調控 miR-185-5p，從而增強 miR-185-5p 的靶向標志物 TGFBR1 和 TGFBR2 的表達，進而激活 TGF-β 通路，而 TGF-β[19-20]在較多腫瘤中都被證明可促進癌細胞增殖侵襲?？傊?，PCAT6 通過抑制 miR-185-5p 促進 TGF-β 通路表達，從而促進骨肉瘤的發(fā)展。有學者發(fā)現(xiàn)將 PCAT6過表達后，MDM2E3 ( 泛素蛋白連接酶 ) 表達增加，P53和 P21 水平降低，骨肉瘤的細胞學功能得到促進，下調MDM2 后，骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力受到抑制[21]。此外，當 MDM2 下調后，P53 和 P21 的表達得到了部分恢復。這些結果表明，PCAT6 通過促進 MDM2 的表達，抑制 P53 和 P21 的表達，從而促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。

7. CDKN2B-AS1：CDKN2B-AS1 經近期研究表明在骨肉瘤組織中過表達[22]，研究發(fā)現(xiàn) CDKN2B-AS1 可靶向作用于 miR-4458，而 MAP3K3 經分子機制實驗被證實是骨肉瘤中 miR-4458 的下游靶點，并被 miR-4458 負調控；在 CDKN2B-AS1 抑制后的骨肉瘤組織中，MAP3K3 的強制過表達可以部分挽救被抑制的細胞增殖狀態(tài)。因此，CDKN2B-AS1 通過負調控 miR-4458 增強 MAP3K3 的表達，從而促進了骨肉瘤的進展，但關于 MAP3K3 的詳細功能，應進一步研究。Abula 等[23]發(fā)現(xiàn) CDKN2B-AS1 可抑制 microRNA-122-5p ( miR-122-5p )，使細胞周期蛋白 G1( CCNG1 ) 表達升高，進而促進骨肉瘤細胞的增殖。

8. DDX11-AS1：DDX11-AS1 在 Zhang 等[24]的研究下發(fā)現(xiàn)其在骨肉瘤細胞中顯著過表達。功能缺失實驗發(fā)現(xiàn) DDX11-AS1 表達水平降低后，骨肉瘤細胞增殖、轉移及上皮 - 間質轉化 ( EMT ) 過程遭受抑制；實驗證明DDX11-AS1 可以通過抑制 miR-873-5p 來上調骨肉瘤組織中 DDX11 的表達，而 DDX11 已證明與多種腫瘤組織的病情進展有關[25-26]，同時功能試驗證明了 miR-873-5p 表達上調可以在骨肉瘤中的細胞增殖、轉移和 EMT 過程發(fā)揮抑制性作用。此外，DDX11-AS1 在骨肉瘤中通過與 IGF2BP2( 人胰島素樣生長因子 2 mRNA 結合蛋白 2 ) 結合來提高 DDX11 穩(wěn)定性，而 IGF2BP2 已被證明參與維持多種LncRNA 的穩(wěn)定，可間接促進腫瘤細胞的生長[27-28]。綜上所述，DDX11-AS1 通過抑制 miR-873-5p 上調骨肉瘤組織中 DDX11，并可通過與 IGF2BP2 結合穩(wěn)定并促使 DDX11發(fā)揮功能，從而促進骨肉瘤進展。

9. DANCR：Pan 等[29]研究發(fā)現(xiàn) DANCR 在骨肉瘤組織和細胞系中過表達。功能實驗表明 DANCR 的表達下調可誘導細胞凋亡。DANCR 是 miR-216a-5p 的 ceRNA，而SOX5 是 miR-216a-5p 的直接靶點，過表達的 miR-216a-5p通過下調 SOX5 的表達起到抑制細胞增殖的作用。SOX 基因家族是一類 Y 染色體性別決定區(qū) ( SRY ) 相關基因構成的基因家族，SOX5是其家族中一員，與多種腫瘤發(fā)展呈正相關[30-32]。總之 DANCR 可通過抑制 miR-216a-5p 上調SOX5 的表達，從而促進骨肉瘤組織增殖侵襲。Wang 等[33]發(fā)現(xiàn)下調 DANCR 可抑制 ROCK1 介導的骨肉瘤細胞增殖和轉移，并通過負作用于 miR-335-5p 和 miR-1972，促進ROCK1 介導的侵襲轉移；ROCK1 ( Rho 相關卷曲螺旋形成蛋白激酶 ) 高表達可提升肌球蛋白輕鏈磷酸化水平，增加肌動蛋白和肌球蛋白的收縮力，提升細胞的侵襲能力[34]。

10. FTX：Huang 等[35]發(fā)現(xiàn) FTX 通過調控 TXNRD1 /miR-320a 軸發(fā)揮其對骨肉瘤的調控作用，Huang 等經QRT-PCR 實驗發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤中 FTX 和 TXNRD1 表達水平異常上調，而 miR-320a 表達明顯下降；熒光素酶報告基因分析顯示，F(xiàn)TX 和 TXNRD1 均可與 miR-320a 結合，并可同時抑制其表達，但內在詳細的分子機制尚不明確，待進一步深入研究發(fā)現(xiàn)。Chen 等[36]發(fā)現(xiàn) FTX 在骨肉瘤組織和細胞系中的表達水平升高，與 miR-214-5p 的表達水平呈負相關。沉默 FTX 后骨肉瘤的生長和轉移受到抑制，此過程中 miR-214-5p 表達上升。此外，F(xiàn)TX 還可以通過作用調控 miR-214-5p 進而調節(jié) SOX4 的表達；SOX4 是SRY-BOX 轉錄因子家族中的一員，已發(fā)現(xiàn)其在多種癌癥中過表達[37]。綜上，F(xiàn)TX 可負調控 miR-214-5p，進而上調SOX4 表達，從而導致骨肉瘤發(fā)生發(fā)展。

11. KCNQ1OT1：Wang 等[38]經實驗發(fā)現(xiàn) KCNQ1OT1在骨肉瘤中的表達上調，分子機制實驗表明，KCNQ1OT1可作為 miR-4458 的 ceRNA 抑制 miR-4458 的功能，并增強了 KCNQ1OT1 靶基因 CCND2 ( cyclinD-2 ) 的表達，而 CCND2 與多種腫瘤細胞增殖有關[39-40]?？偠灾琄CNQ1OT1 抑制其 ceRNA-miR-4458 的表達，從而使得自我表達增強，同時上調其靶基因 CCND2 的表達，最終使骨肉瘤細胞及組織增殖侵襲能力增強。Huang 等[41]發(fā)現(xiàn)下調 KCNQ1OT1 可抑制骨肉瘤中的 Wnt / β-catenin 信號通路。KCNQ1OT1 可以負調控 miR-3666，Kruppel 樣因子 7( KLF7 ) 是 miR-3666 的靶基因，當 miR-3666 被下調后，KLF7 表達上升，Huang 等發(fā)現(xiàn)，KLF7 過表達后，已抑制的 KCNQ1OT1-Wnt / β-catenin 信號傳導得到恢復。總的來說，KCNQ1OT1 通過靶向作用 miR-3666 / KLF7 軸促進骨肉瘤進展并激活 Wnt / β-catenin 信號傳導。

12. MIR17HG：MIR17HG 經最新研究發(fā)現(xiàn)其在骨肉瘤中過表達，并能提升細胞的順鉑耐藥性[42]。分子機制實驗發(fā)現(xiàn) MIR17HG 可靶向作用于 miR-130a-3p 和轉錄因子SP1，并且可以抑制 miR-130a-3p 表達，促進 SP1 表達；SP1 已被證明與多種癌癥病情發(fā)展相關[43-44]。此外，SP1還可以與 MIR17HG 啟動子區(qū)再次結合，進一步促進其表達，形成反饋環(huán)。這種自有反饋環(huán)的分子系統(tǒng)是一個全新的發(fā)現(xiàn)，是很有價值的研究方向，有必要繼續(xù)深入研究。

13. PBB12：PBB12 經近期研究發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中表達增加[45]。分子機制研究發(fā)現(xiàn)，PBB12 可與 hsa-miR-204-5p競爭性結合，同時 PBB12 可干預 kruppel 樣因子 4 ( KLF4 )來激活轉錄因子 2 ( ATF2 ) 通路，進而增強骨肉瘤細胞的增殖和侵襲。PBB12 高表達可導致抑癌基因 KLF4 和hsa-miR-204-5p 功能喪失。此外，功能實驗數(shù)據(jù)顯示，PBB12 沉默后，KLF4 對腫瘤細胞增殖和侵襲的抑制作用被顯著增強。總之，PBB12 通過抑制 hsa-miR-204-5p 表達，促進自我表達上升并激活 ATF2 通路，抑制 KLF4 的表達，從而促進骨肉瘤發(fā)展。

14. MYOSLID：MYOSLID 在最新研究中發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤組織中高度表達[46]，MYOSLID 被敲除后可抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲；通過熒光素酶報告基因實驗和 RNA 下拉實驗，證實了 MYOSLID 與 miR-1286 可直接相互作用，由此推測 miR-1286 是 MYOSLID 的靶標基因。MYOSLID 被抑制后，可促進 miR-1286 在骨肉瘤細胞中的表達，這說明 MYOSLID 的表達與 miR-1286 的表達呈負相關。另外用生物信息學方法以及熒光素酶報告基因實驗，證實了 miR-1286 的靶向基因是 RAB13。而 RAB13 是多種癌癥的典型致癌基因。因此可認為，MYOSLID 可通過抑制miR-1286 的表達上調 RAB13，從而加快骨肉瘤的進程。

綜上所述，LncRNA 作為 miRNA 的 ceRNA ( 內源競爭性 RNA )，可充分發(fā)揮其海綿功能，可吸附相關 miRNA進行單向正表達水平的調控，進而通過相關信號通路或因子促進骨肉瘤的發(fā)展變化，現(xiàn)已確定 LncRNA 單向調控miRNA，但 miRNA 是否能反作用于 LncRNA，是否可以通過相關通路或細胞因子進行負反饋作用，現(xiàn)在尚不得知，若 miRNA 可靶向負反饋調節(jié) LncRNA，對于臨床治療將有很大意義，這些問題仍須繼續(xù)深入研究。

二、抑制骨肉瘤增殖發(fā)展的 LncRNA

在骨肉瘤中，除了大多數(shù)起到促進作用的 LncRNA，另有一些 LncRNA 的表達可抑制骨肉瘤的發(fā)展，起到負向作用，現(xiàn)將與 miRNA 相關的該類基因的作用機制列舉如下：

1. LINC-PINT：該基因近期研究被發(fā)現(xiàn)在多種癌性組織中均有抑制性表達；Liu[47]經研究發(fā)現(xiàn) LINC-PINT 在骨肉瘤組織中表達減低，而在其表達增強的組織中發(fā)現(xiàn)miRNA-21 表達下降，由此可見 LINC-PINT 過表達可抑制miRNA-21 表達，實驗已證明 miRNA-21 過表達會提高細胞的增殖侵襲性，但 miRNA-21 過表達卻對 LINC-PINT 表達無明顯影響，這說明 LINC-PINT 對其發(fā)揮單向作用的功能。總之，LINC-PINT 可能通過下調 miRNA-21 抑制骨肉瘤發(fā)展，而詳細的分子機制應進一步深入研究。

2. MEG3：近年研究證明 MEG3 在骨肉瘤組織中異常表達[48]，有明顯的抑癌功能，而既往研究表明 MEG3可與 p53 結合，發(fā)揮協(xié)同正向作用抑制腫瘤發(fā)展[49]。而最新研究發(fā)現(xiàn) MEG3 和 miR-361-5p 在骨肉瘤組織和細胞系中同比顯著下調，實驗發(fā)現(xiàn) MEG3 可直接靶向結合miR-361-5p，顯著上調其表達，上調的 MEG3 和 miR-361-5p明顯抑制骨肉瘤細胞生長轉移，但其中具體的分子機制尚不明朗，尚需進一步查明[50]。

3. SERTAD：SERTAD 基因，被認為是關鍵的核轉錄參與者，在細胞增殖及異變性上發(fā)揮著重要的調控作用。近期研究發(fā)現(xiàn)其與骨肉瘤的發(fā)展有關[51]；實驗中發(fā)現(xiàn)SERTAD2-3 在骨肉瘤細胞中過表達，并可通過誘導細胞G1 期周期阻滯和細胞凋亡來抑制細胞生長；而 miR-29c經研究發(fā)現(xiàn)其是 SERTAD2-3 的 ceRNA，且兩者的表達呈負相關。實驗發(fā)現(xiàn) miR-29c 在骨肉瘤組織中表達上調，并可靶向抑制于抑癌基因 PTEN，提高骨肉瘤細胞的增殖侵襲性，因此初步推測，SERTAD 通過抑制 miR-29c 的表達，促進 PTEN 表達，進而抑制骨肉瘤的發(fā)展。

綜上所述，LncRNA 作為 miRNA 的 ceRNA，可充分發(fā)揮其海綿功能，可吸附相關 miRNA 進行單向負表達水平的調控，從而抑制骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，但有兩個問題：( 1 ) 抑制性 miRNA 相關 LncRNA 較促進性 LncRNA數(shù)量要少，這是否和 miRNA 的某些作用有關；( 2 ) 抑制性 miRNA 相關的信號通路和因子未得到深入研究，這是否說明在抑制骨肉瘤的過程中，某些信號通路和細胞因子的功能發(fā)揮的較為隱匿或者是消極作用，這些都須進一步研究。

三、LncRNA 及 miRNA 共同作用下的骨肉瘤預后情況

骨肉瘤作為一種預后極差的骨科疾病相關腫瘤，遠期的生存率尤為重要，現(xiàn)對于骨肉瘤基因層面的研究仍不完善，探索到抑制骨肉瘤相關 LncRNA 較少，而抑制性 LncRNA 的意義對于骨肉瘤的治療有著極其重要的作用，但對于強化抑制性 LncRNA 表達后會不會減弱增強性LncRNA 的作用，還須進一步研究證明。而 miRNA 大多數(shù)可作為內源性競爭性 RNA 調控 LncRNA 的表達進程，這也是能夠改善預后的治療方向?？傊F(xiàn)今骨肉瘤的預后年限雖然上升，但總體不容樂觀，仍須繼續(xù)研究延長患者預后時間。

四、展望

目前，對于參與骨肉瘤病情發(fā)展的 LncRNA 的研究日漸廣泛及深入，少部分被發(fā)現(xiàn)存在抑制性表達，如 SERTAD、LINC-PINT 和 MEG3 等可起到抑癌作用，而大多數(shù) LncRNA 都傾向過表達，如 ADPGK-AS1、LINC00963、CDKN2B-AS1 和 MIR17HG 等都增強了骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移性，現(xiàn)是否可將某些高度表達的 LncRNA 作為生物標志物來預測骨肉瘤患者的預后，認為是一個較新的研究領域，這可為治療方案的制訂提供更好的方向，應充分進行發(fā)掘研究。此外，還有很多與骨肉瘤相關的 LncRNA 未被發(fā)現(xiàn)，即使發(fā)現(xiàn)了的 LncRNA 依然尚有很多分子機制不明確，尤其是關于作為內源性競爭性RNA 的 miRNA 的具體調控機制，還須繼續(xù)研究，所以還需要繼續(xù)不斷的發(fā)展分子生物學技術，以求未來對骨肉瘤的治療提供更多的指導方向，但可以明確的是，LncRNA及 miRNA 在骨肉瘤方面的角色十分重要。