王 玲, 葉冬梅, 包文泉, 白玉娥, 吳曉萌, 孫昊田

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

云杉屬(Picea)是僅次于松屬(PinusLinn)和冷杉屬[Abiesfabri(Mast.)Craib]的隸屬于松科(Pinaceae Spreng)的第三大屬[1]，該屬是裸子植物中較大的一個(gè)屬[2]，廣泛分布于北半球[3].目前被世界普遍認(rèn)可的云杉屬約有34個(gè)種(亞洲23個(gè)、北美洲8個(gè)、歐洲3個(gè))、3個(gè)雜交種、3個(gè)亞種和15個(gè)變種[4].白杄(PiceameyeriRehd.et Wils)(又名毛枝云杉)是我國的特有樹種，分布較廣，主要分布于山西(五臺(tái)山區(qū)、管涔山區(qū)、關(guān)帝山)、河北(小五臺(tái)山區(qū)、霧靈山區(qū))和內(nèi)蒙古西烏珠穆沁旗[5]，其海拔分布是由南向北呈遞減分布[6].白杄所處的環(huán)境與地理位置的不同，也表現(xiàn)為群體對環(huán)境的適應(yīng)能力和群體內(nèi)部的穩(wěn)定性不同，因此對白杄群體進(jìn)行遺傳多樣性研究，可以探究白杄群體對環(huán)境的適應(yīng)能力和種內(nèi)變異程度，對我國云杉屬及林木育種研究具有重要的理論和實(shí)踐意義.

遺傳多樣性的本質(zhì)是DNA的多態(tài)性[7]，廣義的遺傳多樣性是指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和，但通常情況下所說的遺傳多樣性指的是種群內(nèi)的遺傳多樣性，即種群內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異總和，故也稱其為基因多樣性[8,9]，分子標(biāo)記是研究遺傳多樣性的方法之一.對云杉屬多個(gè)物種采用常規(guī)染色進(jìn)行染色體組和核型分析已有50多年[10-15]，最主要的分子標(biāo)記有RFLP、SSR、RAPD、AFLP、ISSR和DNA序列標(biāo)記等，研究的云杉屬樹種約有20種，以歐洲云杉(Piceaabies)樹種居多[16-25].王改妮等[26]對云杉復(fù)合體中的白杄(Piceameyeri)、云杉(Piceaasperata)、紅皮云杉(Piceakoraiensis)和西伯利亞云杉(Piceaobovata)的34個(gè)居群(332個(gè)個(gè)體)進(jìn)行了DNA提取，分別擴(kuò)增了13個(gè)核基因片段，結(jié)果表明4個(gè)云杉屬物種擁有共同祖先，其中西伯利亞云杉最先分化，其次是白杄、云杉和紅皮云杉，但后三個(gè)物種的分化程度卻不高.Li et al[27]通過mtDNA、nrDNA、cpDNA測序，研究川西云杉(Picealikiangensis)自然種群遺傳分化，結(jié)果表明，川西云杉具有較高的生態(tài)位分化.2013年構(gòu)建了約20 GB的歐洲云杉基因組草圖[28,29]，可通過分析全基因組DNA序列變異為云杉屬群體遺傳學(xué)的深入研究提供可靠的背景，同時(shí)提供嶄新的視角和豐富的信息.但是在眾多研究中，白杄群體間的遺傳多樣性和基因分化未見報(bào)道.

葉綠體DNA(chloroplast DNA, cpDNA)存在于高等植物葉綠體基質(zhì)中，多以閉合環(huán)狀雙鏈分子存在[30]，且cpDNA為單親遺傳，細(xì)胞分裂時(shí)不發(fā)生重組[31]，其進(jìn)化速率僅為核基因進(jìn)化速率的1/2[32].此外，cpDNA的非編碼區(qū)進(jìn)化速率更快，能夠提供更多遺傳學(xué)信息，常用于種下與種間植物信息系統(tǒng)重建[30].cpDNA還具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化保守及多拷貝等優(yōu)點(diǎn)[33]，可以在短時(shí)間內(nèi)構(gòu)建植物cpDNA限制圖譜和只依靠cpDNA即可構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean,UPGMA).近幾年，cpDNA被廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域如分子進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育等[30-31，34-35].因此，基于cpDNA分子標(biāo)記分析白杄群體間遺傳多樣性，探究白杄群體間的遺傳結(jié)構(gòu)、分化、親緣關(guān)系和種內(nèi)變異程度，對于白杄種質(zhì)資源的保護(hù)與利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究材料取自山西省(龐泉溝、大石洞、五臺(tái)山)、河北省(小五臺(tái)山、霧靈山、機(jī)械林場)和內(nèi)蒙古自治區(qū)(多倫、正藍(lán)旗、九峰山)的9個(gè)天然群體，大多數(shù)群體分布于氣溫較低且潮濕的森林地帶，有少數(shù)幾個(gè)群體分布于氣溫較低但較為干燥的平原地帶(表1).

表1 9個(gè)采樣地的詳細(xì)信息

每個(gè)群體選擇30個(gè)生長正常的單株用GPS進(jìn)行定位，單株之間的距離至少大于100 m.將無病蟲害的白杄嫩葉迅速裝入密封袋中，放入冰盒，于-80 ℃超低溫冰箱保存待用.

1.2 DNA提取及純度檢測

經(jīng)過DNA預(yù)試驗(yàn)，最終確定選用試劑盒(Hipure SF plant DNA mini kit)法提取DNA.采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取到的DNA純度.選擇條帶明亮且不拖尾的DNA樣品于-20℃冰箱用于后續(xù)PCR擴(kuò)增.試驗(yàn)共檢測了9個(gè)群體227個(gè)個(gè)體.

1.3 cpDNA引物篩選及產(chǎn)物測序

通過NCBI查找獲得9對葉綠體基因片段的信息，合成普通引物，對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選獲得最適引物.最終從9個(gè)葉綠體通用引物中篩選出3個(gè)(matk、trnS-trnG和ndhK-C)進(jìn)行試驗(yàn)(表2).試驗(yàn)采用的PCR擴(kuò)增體系：反應(yīng)的總體積為25 μL，模板DNA 2 μL，正反引物各1 μL，2xTaq Plus Master Mix 25 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL.反應(yīng)體系的條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)尾，38個(gè)循環(huán).取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格的PCR產(chǎn)物送往上海生工公司進(jìn)行測序.

表2 引物詳細(xì)信息

1.4 數(shù)據(jù)分析

將測序正常的序列通過NCBI進(jìn)行BLAST比對，確定所獲得的序列是否為目的序列.然后用MEGA 7.0軟件對目的序列進(jìn)行比對.使用POPGEN軟件分析觀測等位基因數(shù)Na、有效等位基因數(shù)Ne、Nei′s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon′s信息指數(shù)(I)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)、多態(tài)位點(diǎn)百分比(parallel programming library, PPL)、總體遺傳多樣性Ht、群體內(nèi)遺傳多樣性Hs、基因分化系數(shù)Gst和基因流Nm等參數(shù)，根據(jù)Nei′s遺傳距離繪制聚類圖.使用DNAsp軟件對多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)、平均核苷酸差異(K)、核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)、單倍型個(gè)數(shù)(A)和單倍型多樣性(Hd)進(jìn)行分析.此外，利用APLEQUIN VERSION 3.5軟件分析群體的分子方差變異(AMOVA)，統(tǒng)計(jì)群體內(nèi)及群體間的變異方差分布和居群間遺傳分化系數(shù)(Fst).

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增

使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量(圖1)，DNA長度均>2000 bp，1、2、4、5、6號(hào)泳道的DNA濃度約1 000 ng·μL-1，3號(hào)泳道的DNA濃度約800 ng·μL-1，提取到的DNA可用于PCR擴(kuò)增反應(yīng).

M：Marker;1～6：不同個(gè)體的DNA.

4、7、8、16號(hào)泳道的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶較弱，不可用于后續(xù)的測序，其他產(chǎn)物條帶清晰，濃度高，與目的條帶一致(圖2).

M：Marker;1～18指PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.

2.2 遺傳多樣性

白杄群體個(gè)體的檢測結(jié)果表明(表3)，每個(gè)位點(diǎn)檢測到的等位基因平均值(Na)、有效等位基因平均值(Ne)、Nei′s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon′s信息指數(shù)(I)均值分別為2.470 6，1.091 5，0.065 0和0.133 2.基于群體水平，上述指標(biāo)除Ne外均有降低，分別降低47.4%、6.3%、22.0%，而Ne增加了5.5%.9個(gè)群體檢測的Na為1.117 6～1.882 4，表現(xiàn)為DL>JFS=PQG>JXLC=ZLQ>DSD=XWTS=WLS>WTS.Ne是反映群體遺傳變異程度的重要指標(biāo)，其數(shù)值越接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)，表明等位基因在群體中分布越均勻；Ne為1.034 4～1.779 7，表現(xiàn)為DL>PQG>JXLC>JFS>WLS>ZLQ>DSD>WTS>XWTS，所以DL群體的等位基因在群體中的分布較均勻.各群體的H為0.028 2～0.144 8，表現(xiàn)為DL>PQG>JXLC>JFS>ZLQ>WLS>DSD>WTS>XWTS.I反映位點(diǎn)遺傳多樣性程度，I為0.051 9～0.264 4之間，表現(xiàn)為DL>PQG>JFS>JXLC>ZLQ>WLS>DSD>WTS>XWTS；DL群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)與多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPL)最大，為15個(gè)和88.24%，WTS群體的S和PPL最小，為2個(gè)和11.76%.

表3 基于cpDNA分子標(biāo)記各群體遺傳多樣性1)

綜上分析可知，DL群體的遺傳多樣性指標(biāo)值最高，所以DL群體的遺傳多樣性較高，且具有較好的適應(yīng)能力與進(jìn)化潛力，而XWTS群體的遺傳多樣性指標(biāo)值最低，故XWTS的遺傳多樣性較低，對環(huán)境的適應(yīng)能力與進(jìn)化潛力相對減弱.

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化參數(shù)

基于cpDNA分子標(biāo)記，白杄群體總遺傳多樣度(Ht)0.065 9，群體內(nèi)遺傳多樣性(Hs)0.060 9，基因分化系數(shù)(Gst)0.074 9，基因流(Nm)6.172 6，可得出結(jié)論：白杄群體間基因分化程度較低且存在廣泛的基因交流.通過對群體間分化水平研究白杄群體的遺傳結(jié)構(gòu)，白杄群體間的分化程度Fst為1.033%，即總遺傳變異的1.033%來自于群體間的遺傳變異，98.97%來自于群體內(nèi)的遺傳變異(表4).

表4 基于cpDNA分子標(biāo)記的白杄群體方差分析

2.4 各群體單倍型分析

3個(gè)葉綠體基因片段(matk、trnS-trnG和ndhK-C)共有61個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，表現(xiàn)為：ndhK-C>matk>trnS-trnG；平均核苷酸差異(K)：ndhK-C>trnS-trnG>matk；共產(chǎn)生124個(gè)單倍型，表現(xiàn)為：ndhK-C>trnS-trnG>matk.所以ndhK-C片段的多態(tài)性最豐富(表5).

表5 葉綠體基因單倍型多樣性、核苷酸多樣性和核苷酸平均差異1)

群體多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)12～51個(gè)，表現(xiàn)為：DL>WLS>DSD>WTS>JFS=JXLC>PQG=ZLQ>XWTS；群體平均核苷酸差異(K)5.110～11.487，表現(xiàn)為：DL>WLS>DSD>XWTS>WTS>JFS>ZLQ>JXLC>PQG；核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)0.003 36～0.007 55，表現(xiàn)為：DL>WLS>DSD>XWTS>WTS>JFS>ZLQ>JXLC>PQG；單倍型個(gè)數(shù)(A)12～18個(gè)，表現(xiàn)為：JXLC>DSD=JFS=PQG=ZLQ>WLS>XWTS>DL=WTS；單倍型多樣性(Hd)0.987～1.000，表現(xiàn)為：DSD=WTS=PQG=JXLC=WLS=XWTS>ZLQ>JFS>DL(表6).

表6 白杄9個(gè)群體的葉綠體基因單倍型多樣性、核苷酸多樣性和核苷酸平均差異1)

綜上，DL群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)最大，所以DL群體對環(huán)境變化的適應(yīng)能力更強(qiáng)，更穩(wěn)定，不易受環(huán)境的影響，JXLC群體單倍型個(gè)數(shù)(A)和單倍型多樣性(Hd)最大，故JXLC群體較其他群體來說遺傳多樣性較高.

2.5 群體間的遺傳距離與聚類分析

參照Nei′s(1972)分析計(jì)算9個(gè)群體的親緣關(guān)系.當(dāng)Nei′s遺傳距離(D)為0，遺傳一致度(I)為1時(shí)，兩個(gè)群體完全一樣，相反則無任何親緣關(guān)系.群體的I為0.942 3～0.999 2，其平均值為0.992 8，說明群體間存在一定的遺傳變異；D為0.000 8～0.016 0，其平均值為0.005 7，說明群體間相似程度較高.JXLC群體與XWTS群體的D最大(D=0.016 0)，說明兩群體遺傳相似性水平較低，遺傳分化程度較小.DSD群體與ZLQ群體的D最小(D=0.000 8)，說明兩群體的遺傳相似性水平較高(表7).

表7 9個(gè)群體間的Nei′s(1972)遺傳距離(****下)與遺傳一致度(****上)1)

利用白杄群體的遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析(圖3).結(jié)果表明，DSD群體與ZLQ群體的遺傳距離最小，可忽略不計(jì)，故DSD群體與ZLQ群體的遺傳多樣性相差較小可視為同一群體，與WLS群體的關(guān)系也較為密切.JXLC群體與XWTS群體的遺傳距離最大.在0.365 24～0.397 88任意取值時(shí)，分為3類，河北的JXLC群體自成一類，內(nèi)蒙古的JFS群體和山西的XWTS群體聚為一類，其他6個(gè)群體聚為一類.由此可知，白杄群體的遺傳多樣性程度較高.

DL：多倫；DSD：大石洞;WTS：五臺(tái)山;JFS：九峰山;PQG：龐泉溝;JXLC：機(jī)械林場;WLS：霧靈山;WTS：小五臺(tái)山;ZLQ：正藍(lán)旗.

3 討論與結(jié)論

有研究表明[2]，云杉線粒體基因序列變異水平較低，不適合用于云杉屬的物種界定研究.本試驗(yàn)選取了4套線粒體(mtDNA)基因片段用以PCR擴(kuò)增測序，結(jié)果也表明，各片段之間無特異性位點(diǎn).本試驗(yàn)還利用cpDNA分子標(biāo)記對白杄群體遺傳多樣性進(jìn)行研究.結(jié)果表明，葉綠體DNA序列在云杉屬中擁有更豐富的變異.基因流(Nm)為6.1726，而鄭舒文[36]采用18對ISSR引物研究云杉遺傳多樣性，結(jié)果表明，Nm為2.8441.本試驗(yàn)基因流程度較高的原因可能由于采樣地較多及采樣點(diǎn)不同的原因.本試驗(yàn)結(jié)果還得出，白杄群體遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.074 9，F(xiàn)st為1.033%，表明白杄群體的分化能力較弱，但與前人的研究結(jié)果不同(白杄群體的Gst為0.078，F(xiàn)st為0.05～0.15，白杄群體間遺傳分化能力表現(xiàn)為中等)[37]，造成試驗(yàn)結(jié)果不同的原因可能是所選取基因組片段結(jié)構(gòu)不同，從而得到兩種不同的白杄群體分化結(jié)果.

主要研究結(jié)果：(1)各群體遺傳多樣性指標(biāo)存在差異.ZLQ群體的遺傳多樣性較高，具有較好的適應(yīng)能力與進(jìn)化潛力；XWTS群體的遺傳多樣性較低，對環(huán)境的適應(yīng)能力與進(jìn)化潛力相對減弱；(2)在葉綠體基因水平上共有61個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(S)，共有124個(gè)單倍型(A)，單倍型多樣性(Hd)為0.997 2；片段ndhK-C的多態(tài)性最好；(3)白杄群體間基因分化程度不大(Gst=0.074 9)，存在廣泛的基因交流(Nm=6.172 6)；總遺傳變異的1.033%來自于群體間的遺傳變異，98.97%來自于群體內(nèi)的遺傳變異；(4)通過遺傳距離的UPGMA聚類分析，將9個(gè)群體分為3類群，即河北的機(jī)械林場(JXLC)自為一類，內(nèi)蒙古的九峰山(JFS)與山西的小五臺(tái)山(XWTS)聚為一類，其他6個(gè)群體聚為一類，所以白杄群體的遺傳多樣性程度較高.