邵曉妮，丁玥瑤，穆卡然·艾買江，李 娜，吳美薇

(西南民族大學藥學院，四川 成都 610041)

隨著人們飲食的多樣化，高嘌呤和高脂肪食物攝入量的增加容易打破人體內(nèi)尿酸含量的動態(tài)平衡，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生率增加.高尿酸血癥是一種由于嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致尿酸過量或尿酸排泄減少而導(dǎo)致血尿酸水平超過正常水平的代謝性疾病[1].據(jù)調(diào)查研究顯示，目前高尿酸血癥在中國的總體患病率已達13.3%，成為繼糖尿病之后又一常見代謝性疾病[2]，被稱作除高血壓、糖尿病和高脂血癥之外的“第四高”[3].除引起痛風外，也有證據(jù)表明高尿酸血癥與心血管疾病、慢性腎臟病、糖尿病和其他疾病的發(fā)生也有相關(guān)聯(lián)系[4].高尿酸血癥與腎病關(guān)系密切，其會對腎小球囊內(nèi)毛細血管細胞的收縮性造成損害，使急性腎損傷發(fā)生風險增大[5].高尿酸血癥通過激活NLRP3炎癥小體、損傷腎小管內(nèi)皮細胞，刺激TLR誘導(dǎo)炎癥因子和血管平滑肌增生，這些都是導(dǎo)致腎病發(fā)生的重要因素[6].因此，尋找對高尿酸血癥靶向性高、療效好的藥物成分，并對其進行相關(guān)研究具有重要意義.

菊苣(Cichorium intybus L.)來源于菊科植物毛菊苣或菊苣，藥用部位為其干燥地上部分或根，具有清肝利膽，健胃消食，利尿消腫等多種功效，對治療水腫尿少、濕熱黃疸、胃痛食少等多種病癥都有好的療效[7].菊苣是維吾爾族和蒙古族習用藥材，對肥胖、糖尿病、多代謝紊亂等許多方面也具有一定治療作用[8].根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，菊苣對于治療高尿酸血癥有明顯療效[9].中藥治療具有多成分、多途徑、多靶點協(xié)同作用的特點，通過檢索網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫收集信息，構(gòu)建針對性的“疾病-靶點-藥物成分”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從多成分、多途徑、多靶點的研究思路出發(fā)，可以從整體上對藥物的作用靶點及其作用機制進行預(yù)測[10].本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接技術(shù)研究菊苣抗高尿酸血癥作用機制，為其藥效機制的深入探討提供思路.

1 材料與方法

1.1 菊苣化學成分收集及篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數(shù)據(jù)庫TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)搜索菊苣，得到菊苣的主要化學成分.以口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18對化學成分進行評估篩選，以得到符合條件的有效成分，進行收集并與本實驗室前期研究相結(jié)合，整理獲取菊苣活性成分，基本建立“菊苣主要活性成分數(shù)據(jù)庫”.

1.2 菊苣活性成分作用靶點收集及篩選

搜集已獲取的菊苣潛在活性成分的作用靶點并篩選.在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索活性成分名并整理其靶點，并在PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中輸入在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選得到的活性成分，下載分子信息以及化合物結(jié)構(gòu).UniProt(http://www.uniprot.org/)是國際知名蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，主要包括三個部分:UniRef參考序列集、UniProt-KB知識庫和UniParc歸檔庫，其核心數(shù)據(jù)是蛋白質(zhì)序列，因此也常被稱為蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，或簡稱蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫[11].本實驗中主要運用UniProtKB知識庫，將上述途徑進行預(yù)測所得化合物靶點合并去重，在UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)一為靶基因名，建立“菊苣有效成分-靶點數(shù)據(jù)庫”.

1.3 高尿酸血癥靶點的搜集和篩選

以“Hyperuricemia”為關(guān)鍵詞，在GeneCards(https://www.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)、Disgenet(https://www.disgenet.org/)及OMIM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)數(shù)據(jù)庫檢索并獲得與高尿酸血癥相關(guān)的基因，將所得結(jié)果合并、去重，整合有效疾病靶點，與菊苣活性成分作用靶點進行匹配.安裝R語言3.6.3中的“VennDiagram”數(shù)據(jù)包，作出韋恩圖并取其交集，得到各數(shù)據(jù)集共有的差異表達基因，即可獲得菊苣中可抗高尿酸血癥的活性成分的潛在作用靶基因.

1.4 構(gòu)建菊苣“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)

將菊苣化學成分及抗作用靶點信息導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，構(gòu)建菊苣“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，其中的節(jié)點(Node)代表靶蛋白、有效成分或藥物，邊(Edge)代表節(jié)點之間的關(guān)系，度數(shù)(Degree)和接近中心度(Betweenness Centrality)可反映每個節(jié)點的重要性.接近中心度越大，代表與其他所有節(jié)點越接近.節(jié)點的Degree代表與其相連的邊數(shù)，Degree值越大，說明該節(jié)點參與的生物功能越多，即該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)圖中重要性越大.該網(wǎng)絡(luò)分析進一步推斷了菊苣抗高尿酸血癥的藥理機制.

1.5 構(gòu)建菊苣治療高尿酸血癥靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)可用于預(yù)測靶蛋白之間的相互作用[12].在STRING數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入菊苣抗高尿酸血癥的潛在作用靶點，物種設(shè)定為“Home sapiens”，獲得菊苣治療高尿酸血癥靶點蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，得到靶點蛋白相互作用關(guān)系，用R語言計算關(guān)鍵靶點并制圖.

1.6 生物過程分析

在R語言中安裝Bioconductor相關(guān)軟件包“clusterProfiler”，以P≤0.05為篩選標準對菊苣活性成分潛在作用靶點進行GO功能富集分析及KEGG通路分析，篩選出具有顯著性差異的生物過程及作用通路，取排名前20的結(jié)果整合繪制柱狀圖和點狀圖.

1.7 分子對接

在UniProt中搜索上述中得到的核心靶蛋白的PDB ID，利用RSCB PBD數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)檢索并下載PBD格式的3D結(jié)構(gòu)文件，然后運用PyMOL、AutoDock Tools 1.5.6對下載的靶蛋白進行前處理，對分子對接的活性位點進行初步確定.用AutoDockVina進行分子對接，由受體與配體的結(jié)合自由能可以判斷其親和力大小.

2 結(jié)果

2.1 菊苣化學成分及靶點的結(jié)果獲取

通過查詢TCMSP數(shù)據(jù)庫共得到菊苣化學成分52種，其中符合篩選標準OB≥30%、DL≥0.18的化合物有12種，包括Luteolin、Beta-sitosterol、Delphinidin等，其中有2個化合物無靶點，見表1.

表1 菊苣中的主要活性成分Table 1 Main active ingredients in chicory

2.2 菊苣抗高尿酸血癥靶點預(yù)測結(jié)果及韋恩圖

用TCMSP搜集以上10種菊苣化學成分的靶點，共得到147個，篩選后得最終有效成分靶點98個.以“Hyperuricemia”為關(guān) 鍵詞 在Drugbank、GeneCards、OMIM及DisGeNet數(shù)據(jù)庫中檢索與高尿酸血癥相關(guān)的基因，在OMIM數(shù)據(jù)庫中搜集到疾病靶點15個，DisGeNet數(shù)據(jù)庫中196個，Drugbank數(shù)據(jù)庫中35個，GeneCards數(shù)據(jù)庫中20 396個，四者去重結(jié)合后共得到860個高尿酸血癥疾病靶點.用R語言將其與菊苣活性成分靶點取交集，共得到39個菊苣抗高尿酸血癥潛在作用靶點，采用R語言中的“VennDiagram”數(shù)據(jù)包作韋恩圖并取交集，見圖1，菊苣抗高尿酸血癥潛在作用靶點見表2.

表2 菊苣抗高尿酸血癥潛在靶蛋白信息Table 2 Information of potential anti-hyperuricemic nephropathy targets from chicory

圖1 菊苣-高尿酸血癥交集靶點及韋恩圖Fig.1 Chicory-Hyperuricemiacommunicative targets and Venn Diagram

2.3 菊苣“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將菊苣活性成分及成分作用的靶點信息數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建菊苣“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖2.

圖2 菊苣化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)紅色代表靶點蛋白，黃色代表活性化合物Fig.2 Components-targets network of chicoryThered is the targets，the yellow is the main active ingredients

由圖可見，網(wǎng)絡(luò)中共有109個節(jié)點，158條邊，說明每個活性成分可作用于多個靶點.其中，紅色菱形表示菊苣活性成分作用靶蛋白，黃色表示菊苣主要活性成分，邊表示相互關(guān)系.活性成分DY1表示Poriferast-5-en-3beta-ol，DY2表示Beta-sitosterol，DY3表示Delphinidin，DY4表示Eseramine，Y5表示Luteolin，DY6表示2S，2‘S-Aurantiamide acetate，DY7表示Lactucopicrin，DY8表示(2R)-3-[3-(5-allyl-2-hydroxyphenyl)-4-hydroxyphenyl]propane-1，2-diol，DY9表示Gitoxigenin，DY10表示Cyanidin 3-glucoside＿qt.

2.4 菊苣抗高尿酸血癥靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)PPI構(gòu)建結(jié)果

采用STRING數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入菊苣抗高尿酸血癥的潛在作用靶點，構(gòu)建菊苣治療高尿酸血癥的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3A.圖中節(jié)點表示菊苣抗高尿酸血癥潛在靶蛋白，邊表示靶蛋白之間的關(guān)系.與其他蛋白關(guān)系越密切，該蛋白越關(guān)鍵，為核心靶點.用R語言計算核心基因，對排名前30的基因進行作圖，見圖3B.可見TP53、IL6、JUN、CASP3和TNF為最重要的五個核心基因.

圖3 菊苣抗高尿酸血癥靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖及核心基因A.蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；B.關(guān)鍵基因Fig.3 Protein interaction network and core gene ofchicoryA.Protein interaction network；B.Key gene

2.5 靶點的生物過程分析結(jié)果

2.5.1 靶點的GO富集分析結(jié)果

采用R語言中的“clusterProfiler”進行靶點的GO分析，共得生物過程77條，取前20條作圖，見圖4.提示菊苣可能主要參與細胞因子受體結(jié)合(Cytokine receptor binding)、細胞因子活性(Cytokine activity)、泛素蛋白連接酶結(jié)合(Ubiquitin protein ligase binding)、類泛素蛋白連接酶結(jié)合(Ubiquitin-like protein ligase binding)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase II transcription factor binding)等生物過程，發(fā)揮抗高尿酸血癥作用.

圖4 菊苣抗高尿酸血癥靶點GO富集分析A.柱狀圖；B.點狀圖Fig.4 GO analysis of targets for chicoryin treating hyperuricemiaA.Barplot；B.Dotplot

2.5.2 靶點的KEGG通路富集分析結(jié)果

采用R語言進行靶點的KEGG分析，共得到信號通路127條，取前20條作圖，見圖5.其中菊苣發(fā)揮作用涉及信號通路包括IL17信號通路(IL17 signaling pathway)和糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等.

圖5 菊苣抗高尿酸血癥靶點KEGG通路富集分析A.柱狀圖；B.點狀圖Fig.5 KEGG pathway analysis of targets for chicoryin treating hyperuricemiaA.Barplot；B.Dotplot

2.6 分子對接結(jié)果

采用AutoDockVina，以關(guān)鍵靶蛋白TP53、IL6、JUN、CASP3和TNF作受體，菊苣的10個有靶點的活性成分作配體進行分子對接，親和力的大小以結(jié)合能來判斷，結(jié)合能為負值說明活性成分與靶點有親和力，結(jié)果見表3.

表3 菊苣中主要活性成分與選取的蛋白靶點的結(jié)合能值(kJ·mol-1)Table 3 The binding energies of main active components in Cichorium intybus with selected protein targets(kJ·mol-1)

活性成分與靶點蛋白的結(jié)合能越低，則活性成分與靶點親和力越大.由上表分子對接結(jié)果可知，TP53、IL6、JUN、CASP3、TNF等關(guān)鍵靶蛋白與菊苣有效成分結(jié)合能均小于-22.0 kJ·mol-1，分子對接結(jié)果說明關(guān)鍵靶蛋白菊苣主要活性成分都具有較好的親和力，與TP53、IL6、TNF親和力最大的活性成分為木犀草素，與JUN和CASP3親和力最大的活性成分為β-谷甾醇.如圖6所示，表明木犀草素與受體蛋白的結(jié)合具有較高的穩(wěn)定性.

圖6 木犀草素與疾病相關(guān)靶點的分子對接模式Fig.6 Molecular docking patterns of luteolin and disease-related targets

3 討論

菊苣是一種常見的中藥，其降尿酸作用在大量實驗中有明顯表現(xiàn)，且在多篇文獻中頻頻提及.目前臨床上常用的降尿酸藥物很多會造成肝臟受損，副作用較大，但如果通過腸道途徑排泄，便可避免藥物經(jīng)過肝臟.用菊苣從腸道環(huán)境著手治療，可以發(fā)揮好的療效.研究顯示，菊苣對于減少尿酸有顯著作用作用.菊苣藥用價值較好，可長期食用，對于人體有多種好處.然而菊苣成分復(fù)雜，具有中藥多成分、多靶點、多通路的特點，因此菊苣抗高尿酸血癥的作用機制值得深入研究.

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，最終得到菊苣主要活性成分10個，其抗高尿酸血癥潛在作用靶點39個，GO條目77條，KEGG通路127條.首先對菊苣化學成分及作用靶點進行了研究，根據(jù)菊苣“藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，菊苣具有多成分、多靶點的特點.構(gòu)建菊苣抗高尿酸血癥的PPI網(wǎng)絡(luò)，其中TP53、IL6、JUN、CASP3和TNF等靶點處于核心位置，說明有效成分可能通過這些靶蛋白對治療高尿酸血癥發(fā)揮作用.IL6屬于一種白細胞介素，TNF-α是一種促炎因子.有研究顯示，高尿酸血癥患者IL6、TNF-α等水平異常增高[13].體內(nèi)尿酸排泄的主要方式是通過腸道和腎臟，大部分尿酸通過腎臟途徑排泄[14].若高尿酸血癥患者體內(nèi)尿酸水平過高，會導(dǎo)致尿酸鹽在腎臟堆積，刺激腎小管上皮細胞并放大局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致促炎細胞因子TNF-α等的釋放增加.高濃度刺激與炎癥又會誘發(fā)腎實質(zhì)細胞氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)與腎功能損傷加重[15].黃嘌呤脫氫酶主要存在于肝臟中，是體內(nèi)合成尿酸的關(guān)鍵酶，可將黃嘌呤、次黃嘌呤氧化生成尿酸[16]，為調(diào)節(jié)尿酸生成的重要靶點.PTGS2又稱環(huán)氧合酶2(COX-2)，有研究顯示選擇性的COX-2抑制劑可顯著降低尿酸[17].Li S[18]等研究發(fā)現(xiàn)，COX-2參與尿酸誘導(dǎo)的系膜細胞增殖，從而導(dǎo)致腎小球的損傷.Yang B[19]等人通過使用miR-214模擬物和特定的COX-2抑制劑(NS398)來確認這些分子在介導(dǎo)尿酸誘導(dǎo)的小鼠主動脈內(nèi)皮細胞凋亡或COX-2/PGE2級聯(lián)激活中的作用，發(fā)現(xiàn)COX-2的抑制顯著改善了MAEC中尿酸誘導(dǎo)的細胞凋亡反應(yīng)和PGE2的產(chǎn)生.由此可見，通過抑制PTGS2靶點可實現(xiàn)降尿酸作用.以上驗證了菊苣有效成分抗高尿酸血癥具有多靶點的特點.

根據(jù)GO富集和KEGG富集分析結(jié)果，菊苣涉及細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性等生物過程及兩條重要的信號通路抗高尿酸血癥.抑制炎癥反應(yīng)對治療高尿酸血癥有重要作用.IL17信號通路是近年提出的重要炎癥信號通路.IL17是一種新的促炎性細胞因子，以二聚體形式分泌，存在于患者軟骨細胞、滑液和半月板中.IL17通過引導(dǎo)分泌前炎癥因子和活化中性粒細胞可產(chǎn)生局部組織的炎癥反應(yīng)[20].實驗研究表明，IL17與其受體結(jié)合并激活下游途徑，可誘導(dǎo)促炎細胞因子的表達而引起炎癥反應(yīng)，如IL6和TNF-α誘導(dǎo)的炎癥[21-22].細胞因子受體結(jié)合過程涉及TNF、IL6等靶點，通過與炎癥因子受體結(jié)合，抑制炎癥因子產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而促進尿酸在腸道和腎臟中的排泄，對高尿酸血癥的治療發(fā)揮作用.如TNF-α在炎癥過程中起著關(guān)鍵作用，這是導(dǎo)致腎小管間質(zhì)和腎小球損傷的重要病理機制之一[23]，與高尿酸血癥有密切聯(lián)系.由此推測，IL17信號通路可能與高尿酸血癥的形成有密切聯(lián)系.此外還涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路.晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是還原糖與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的非酶促合成產(chǎn)物.AGEs與晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合，可在各種細胞和器官中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[24].有研究發(fā)現(xiàn)，當尿酸刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細胞時，RAGE和高遷移率族蛋白1(HMGB1)的mRNA的表達增加，HMGB1與RAGE結(jié)合活化NF-κB信號，促進促炎性細胞因子IL6、TNF-α、粘附分子細胞間細胞粘附分子-1(ICAM-1)和血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)的釋放.且高尿酸血癥患者血清RAGE水平與血清尿酸呈正相關(guān)[25].可見，菊苣成分可通過AGE-RAGE信號通路抑制促炎細胞因子的表達，發(fā)揮對高尿酸血癥的治療作用.上述印證了菊苣有效成分抗高尿酸血癥具有多通路的特點.

由分子對接結(jié)果可知，菊苣中主要活性成分與預(yù)測得到的重要靶點有較好的結(jié)合活性，表明這些成分可能是菊苣抗高尿酸血癥的潛在藥效物質(zhì).已證明木犀草素可以降低TNF-α的水平，其可能是通過涉及TNF、IL6等靶點的細胞因子受體結(jié)合通路而實現(xiàn)，且其已被證實能夠調(diào)控尿酸轉(zhuǎn)運蛋白及其mRNA的表達[26].此外還有研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可降低尿酸轉(zhuǎn)運蛋白1(mURAT1)水平，抑制XOD的活性，從而增加尿酸的排泄以治療高尿酸血癥，還可預(yù)防晚期痛風和高尿酸血癥引起的腎功能不全等疾病[27].在弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠實驗中可通過抑制TNF-α、IL-6減少炎癥細胞的浸潤和滑膜增生[28].可見，木犀草素可通過細胞因子受體結(jié)合通路、IL-17等多種通路有效抑制促炎因子，發(fā)揮治療高尿酸血癥的作用.此外，山萵苣苦素、菊苣萜苷等成分在菊苣中含量豐富且具有多種藥理活性.因此，菊苣抗高尿酸血癥更多機制有待研究.

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接技術(shù)對菊苣抗高尿酸血癥的潛在作用機制進行了活性成分、作用靶點和生物過程的分析，并得出菊苣抗高尿酸血癥具有多成分、多靶點、多通路的特點.研究結(jié)果提示菊苣有10種重要有效成分，可能作用于TP53、IL6、TNF-α等多種靶點，通過調(diào)控多種生物過程來實現(xiàn)抗高尿酸血癥的作用.這表明菊苣可能通過這些有效成分成為治療高尿酸血癥的潛在藥物.菊苣抗高尿酸血癥的成分、靶點及通路豐富，有些雖未在本實驗結(jié)果中體現(xiàn)，但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)也有較強作用.本研究為進一步深入探討其作用機制提供了資料參考，相關(guān)靶點和通路的精確度還需要實驗的進一步驗證.