張建梅，黃衛(wèi)平，金素鈺，鄒 桐，黃 林，鄭玉才

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041；2.四川省涼山彝族自治州畜牧科學研究所，四川 西昌 615042)

線粒體DNA(mtDNA)是重要的核外遺傳物質，遵循嚴格的母系遺傳，具有分子結構簡單、突變率高、進化速率快、幾乎不發(fā)生重組等特征[1]，能保存群體多數(shù)中性突變[2].mtDNA的D-loop區(qū)的序列和長度變異最大，進化速度是其他區(qū)域的5～10倍，在進化中積累了較多的突變，如堿基替換、插入或缺失及串聯(lián)重復序[3-4].因此，mtDNA的D-loop區(qū)是研究畜禽群體間的遺傳分化的理想分子標記[5].

有關豬mtDNA研究所需的基因組DNA一般是從血液中提取[6-8]，乳中體細胞數(shù)量低于血液中的白細胞濃度，但仍可用于提取DNA.崔艷華等[9]用高鹽法從50 mL牦牛乳中提取DNA；王一凡等[10]建立了用試劑盒從10 mL牛奶中提取DNA方法；Liu等[11]用丙酮和SDS-苯酚法從13 mL牛乳中提取DNA.綜上所述，目前從乳中提取DNA的方法各異，但都存在耗時長、試劑價格高、樣本需要量大和試劑污染等問題.本實驗從四川省涼山州的大約克豬乳中用Chelex-100法提取基因組DNA，并用PCR方法擴增其mtDNA D-loop區(qū)部分序列，測序后分析該區(qū)域序列多態(tài)性，以豐富該豬品種群體遺傳多樣性的研究資料.

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗中健康的大約克豬(n＝30)來自四川省涼山州某種豬場，個體間無親緣關系.每頭豬肌肉注射10 IU催產(chǎn)素后，分別手工擠奶采集乳樣約5 mL.乳樣冰凍后用冰瓶帶回實驗室，保存于-80℃，用于基因組DNA的提取.

1.2 基因組DNA的提取

采用Chelex-100的方法[12]從每頭試驗豬全乳中提取基因組DNA，其中乳樣參照羅卉卉等的方法[13]，取樣體積為20 μL.提取的基因組DNA保存于-20℃.

1.3 引物設計、PCR擴增和測序

擴增大約克豬mtDNA D-loop區(qū)的引物序列及PCR程序參照Zhang等的報道[14]，引物序列:F:5‘-CCAAAAACAAAGCAGAGTGTAC-3‘；R:5‘-CGTTATGAGCTACCGTTATA-3‘，預 期 擴 增 片 段 長431bp，引物使用前稀釋至10 μmol/L.

PCR擴增體系為25 μL:3μL基因組DNA，上下游引物各1 μL，Golden Star T6 Super PCR Mix 20 μL.用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后，將條帶單一、明亮的PCR產(chǎn)物送生物技術有限公司進行反向測序.

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序結果用DNAMAN軟件排列同源序列，并進行人工核對校正.通過與GenBank中豬mtDNA Dloop序列(登錄號AF034253)比對，用DnaSP 5.0軟件統(tǒng)計單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)和平均核苷酸差異度(K)等，并進行Tajima’s D檢測.

用Mega 7.0分析所獲序列的單倍型數(shù)、平均堿基組成、多態(tài)位點數(shù)及采用鄰接法(NJ)構建大約克豬與GenBank中下載的30個豬品種mtDNA D-loop序列(表1)進化樹，分析大約克豬與國內外其他豬品種的進化關系.

表1 本研究使用的GenBank數(shù)據(jù)庫中豬的mtDNA信息Table 1 Information of pig mtDNA in GenBank used in this study

2 結果

2.1 大約克豬mtDNA D-loop區(qū)的擴增

從乳中提取的大約克豬基因組DNA用PCR擴增，產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)其中19個樣本的擴增產(chǎn)物條帶明亮，其他11個樣本經(jīng)45個循環(huán)的PCR擴增后，也獲得了明亮的條帶.獲得的PCR產(chǎn)物約430 bp，與預期的產(chǎn)物大小相符，且特異性良好、亮度較高，可用于后續(xù)的PCR產(chǎn)物直接測序(圖1).

圖1 大約克豬mtDNA D-loop區(qū)PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳注:1～8為不同個體的PCR擴增產(chǎn)物；M為DL-2000MarkerFig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products amplifying mtDNA D-loop of Yorkshire pigs Notes:1 to 8 are PCR products of different individuals；M.DL-2000 Marker

2.2 PCR產(chǎn)物測序結果

實驗獲得的PCR產(chǎn)物直接測序圖清晰，30個樣本的擴增序列去除引物及兩端不準確區(qū)域后，有效序列為364 bp(圖2)，說明本實驗有效擴增出大約克豬的mtDNA D-loop區(qū)部分序列.

圖2 大約克豬mtDNA D-loop部分區(qū)測序峰圖Fig.2 Sequencing map of partial mtDNA D-loop of a Yorkshire pig

2.3 大約克豬mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性

對本次實驗所測30個大約克豬mtDNA D-loop區(qū)序列(364 bp)進行了比對，界定了Hap1～Hap7共7種單倍型(表2)，其中特有單倍型為3種(Hap1、Hap6、Hap7)，共享單倍型為4種(Hap2、Hap3、Hap4、Hap5)，Hap3所占比例最高；發(fā)現(xiàn)了11個多態(tài)位點，其中簡約信息位點9個，單一多態(tài)位點2個，表現(xiàn)出較豐富的多態(tài)性；mtDNA D-loop序列中4種堿基T、C、A和G的平均含量分別為25.0%、25.7%、37.6%和11.7%，其中A＋T含量(62.6%)明顯高于C＋G含量(37.4%)，符合mtDNA D-loop區(qū)富含A/T堿基的特征.

表2 大約克豬7種單倍型mtDNA D-loop區(qū)變異位點Table 2 Mutations in mtDNA D-loop region in 7 haplotypes of Yorkshire pigs

在本研究中，1頭豬mtDNA D-loop為Hap1單倍型，其中存在11個堿基(CTTATAAAACA)組成的重復序列，重復1次(圖3).30個大約克豬mtDNA D-loop區(qū)單倍型多樣度(Hd)為0.618，核苷酸多樣度(Pi)為0.00860，平均核苷酸差異度(K)為3.103.對大約克豬mtDNA D-loop區(qū)序列進行中性檢測，其Tajima’s D值為0.37882，差異不顯著(P＞0.10).

圖3 大約克豬mtDNA D-loop的Hap1單倍型中11 bp重復序列注:1～12為不同個體的序列Fig.3 A 11 bp repeat in Hap1 haplotype of mtDNA D-loop of Yorkshire pigs Notes:1 to 12 are sequences of different individual

2.4 大約克豬mtDNA D-loop區(qū)單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹構建

本研究利用Mega 7.0軟件采用鄰接法(NJ)以豬獾(HM106329)和河馬(AP003425)的mtDNA Dloop序列為外群，構建大約克豬與國內外30個豬品種的mtDNA D-loop序列分子系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4).所測樣本分為2個明顯相對獨立的支系:第一支以國外豬品種為主，東北野豬、DLY三元豬、漢普郡豬、杜洛克豬和皮特蘭豬聚為一類；第二支以中國地方品豬種為代表的亞洲類群聚為一類.其中大約克豬有3個單倍型(Hap4、Hap6、Hap7)與中國地方豬品種隆林豬、陸川豬、民豬和屯昌豬聚在一起.

圖4 試驗大約克豬7個單倍型和國內外30個豬品種基于mtDNA D-loop部分序列構建的NJ分子進化樹Fig.4 NJ molecular evolutionary tree constructed based on mtDNA D-loop partial sequences of 7 haplotypes of the experimental Yorkshire pigs and 30 domestic and foreign pig breeds

3 討論

本研究建立了從大約克豬乳中快速提取基因組DNA擴增mtDNA D-loop區(qū)的方法.在30個樣品中，有19個樣本的擴增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測顯示擴增條帶明亮，另外11個樣本的擴增條帶亮度較低.這可能與個體差異有關，不同樣品提取的基因組DNA含量或質量不同.張軍偉[15]比較從荷斯坦牛乳樣和血樣中提取基因組DNA效果，發(fā)現(xiàn)以乳樣或血樣提取的DNA為模板，PCR擴增效果一樣，只是不同個體的乳樣提取的基因組DNA濃度相差較大.本研究對11個PCR條帶亮度較低的，將PCR循環(huán)數(shù)增加到45個循環(huán)后，發(fā)現(xiàn)條帶亮度得到明顯改善，PCR產(chǎn)物可滿足直接測序的要求.雖然在生產(chǎn)實踐中從組織和血液中提取DNA是一項比較成熟的技術，但會對動物產(chǎn)生應激反應而產(chǎn)生一些弊端.本研究建立了從大約克豬乳中提取基因組DNA擴增mtDNA D-loop區(qū)的方法，具有取樣方便、程序簡單、成本低等優(yōu)點.但也存在一些不足，例如，提取的基因組DNA濃度不穩(wěn)定，PCR擴增時需根據(jù)實際情況對循環(huán)數(shù)進行調整，且該方法僅適合泌乳動物.Amills等從乳中提取基因組DNA擴增基因時，也對不同基因使用的PCR循環(huán)數(shù)進行過調整[12].

本實驗中對30頭大約克豬mtDNA D-loop區(qū)進行分析，單倍型多樣度(Hd)及核苷酸多樣度(Pi)分別為0.618和0.00860，顯示出其母系遺傳多樣性較為豐富.張冰等[16]研究的大約克豬Hd和Pi分別為0.762和0.00763，與本實驗結果一致，說明該群體大約克豬遺傳多樣性較高.通過mtDNA序列構建發(fā)育樹為大約克豬的選育提供參考.本實驗構建的NJ樹顯示，以中國地方豬品種和國外豬品種為代表的幾個豬品種分別聚為兩個獨立的分支，并且東北野豬沒有與國內豬品種聚為一類，而是與歐洲豬品種親緣關系較近，這可能與東北地理位置有關，種群間存在基因交流[17]，這與前人研究結果一致[18-20].