陳雪蓉，徐 林，湯 承，岳 華

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041；2.四川省甘孜藏族自治州動物疫病預防控制中心，四川 康定 626000)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染豬引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將它列為必須及時申報的動物傳染病[1]，也是國內外動物防疫的重點疫病之一[2-3].對于非洲豬瘟的病原學檢測，目前常用的方法是PCR檢測.能否提取高質量的核酸直接關系PCR檢測試驗的成敗.有研究發(fā)現(xiàn)，不同病毒核酸提取試劑盒直接影響病毒核酸的提取效率，從而影響檢測效率[4].在動物疫病監(jiān)測上，有研究針對甲型H1N1流感病毒[5]、豬圓環(huán)病毒2型[6]、H5N1禽流感病毒[7]、新城疫病毒[8]、布魯氏菌[9]、豬丹毒桿菌[10]、豬偽狂病毒[11]等采用不同核酸提取試劑盒或不同核酸提取方法進行核酸提取的比較研究，結果表明，不同核酸提取試劑盒或不同核酸提取方法提取的核酸可直接影響PCR的檢測效果.針對不同類型的樣品選取核酸提取效率高、純度好、穩(wěn)定性好、耗時短、操作簡便的核酸提取試劑非常重要.本研究針對市售的5種病毒核酸提取試劑開展不同樣本中ASFV核酸提取效果比較研究，從提取濃度、純度、效率、時間、操作簡便性等方面進行評價，探索不同樣品最高效的ASFV核酸提取方法.

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

ASFV陽性樣本(口腔棉拭子、全血、脾臟、淋巴結、腎臟)經實時熒光定量PCR方法檢測為陽性，并測序證實，由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室(四川省ASF定點檢測實驗室)提供，用于ASFV核酸提取效果的比較.

1.2 主要試劑

Premix Ex Taq(Probe qPCR)購于寶生物工程(大連)股份有限公司；DNA Marker購于TaKaRa公司；DNA經典提取(試劑C:酚-氯仿)；DNA專提試劑(試劑B:Viral DNA Kit核酸提取試劑盒由QMEGA BIO-TEK公司生產提供)；DNA/RNA同提試劑(試劑A:DNA∕RNA Extraction Kit由洛陽萊普生信息科技有限公司生產提供)；試劑D:TIANamp Virus DNA∕RNA Kit由天根生化科技(北京)有限公司生產提供；試劑E:PetNAD核酸萃取試劑盒由金瑞鴻捷(廈門)生物科技有限公司生產提供.

1.3 主要儀器

各量程移液器購于德國Eppendorf公司；核酸蛋白分析儀購于日本島津公司；高速冷凍離心機購于湘儀離心機儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購于上海天能科技有限公司；熒光定量PCR儀購于杭州博日公司；cubee小型高速離心機購于中國廈門金瑞鴻捷公司.

1.4 引物、探針的合成

本研究采用的PCR方法為中華人民共和國農業(yè)農村部公告第172號:豬用生物制品及相關豬源原輔材料中非洲豬瘟病毒核酸檢測方法[12]，擴增的目的片段長度為63 bp，引物序列:F:5‘-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3‘，R:5‘-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3‘.探針序列:5‘-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3‘.引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.5 樣本的處理

本研究采用的樣本處理方法為中華人民共和國農業(yè)農村部公告第172號:豬用生物制品及相關豬源原輔材料中非洲豬瘟病毒核酸檢測方法[12].

豬組織 每種組織分別取樣和處理.取不少于2.0 g組織，研磨后用5倍體積滅菌PBS懸浮，70℃滅活30 min，4℃下以2000～3000 r/min離心10 min，取上清液進行核酸提取.

棉拭子 取棉拭子放于3.5 mL滅菌PBS振蕩渦旋，取上清液進行核酸提取.

全血 直接取全血進行核酸提取.

1.6 核酸的提取

A、B、D和E四種方法均采用柱純化提取核酸，C為酚-氯仿提取方法，按照試劑盒說明書手動提取核酸，初始樣本量均為200 μL，對單個樣本進行三次平行核酸提取，最后均獲得50 μL總DNA，-20℃保存?zhèn)溆?

1.7 核酸提取完整性的瓊脂糖凝膠電泳檢測

5種核酸提取試劑分別對口腔棉拭子、全血、淋巴結、脾臟和腎臟5種ASFV陽性樣本三個平行提取的總DNA進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，比較其DNA的完整性.

1.8 核酸濃度及純度的檢測

使用核酸蛋白分析儀測定提取的核酸濃度以及純度，比較5種不同試劑盒所提取的5種樣本中總核酸的濃度和純度.

1.9 ASFV DNA的實時熒光定量PCR檢測

采用的PCR方法為中華人民共和國農業(yè)農村部公告第172號:豬用生物制品及相關豬源原輔材料中非洲豬瘟病毒核酸檢測方法[12]，按照以下程序進行實時熒光定量PCR檢測:50℃2 min，95℃5 min，95℃15 s，58℃退火延伸1 min，45個循環(huán)(熒光信號收集在此階段每次循環(huán)的退火延伸時進行)，對5種核酸提取試劑盒提取的5種樣本的ASFVDNA進行三次重復檢測.

1.10 不同核酸提取試劑盒提取相同數(shù)量的樣本所需時間及儀器的比較

用5種核酸提取試劑提取5個樣本，每個樣本平行提取3份核酸，比較其所需時間及儀器.

1.11 數(shù)據處理

使用核酸蛋白分析儀測定DNA提取液總濃度和純度，純度以A260/A280＝1.8～1.9為較好純度[13]，采用農業(yè)農村部推薦的熒光定量PCR方法對所提樣本核酸進行擴增，CT值越小，則樣品病毒含量越高[14].所有試驗數(shù)據均采用SPSS軟件進行分析處理，試驗數(shù)據以“平均值±標準差”表示，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著.

2 結果

2.1 DNA片段完整性的測定

5種核酸提取試劑分別對5種不同類型的樣本3份平行提取的ASFV核酸電泳結果如圖1所示.從5種試劑對同一樣本的提取核酸完整性來看，B、C、D三種試劑對口腔棉拭子的核酸提取完整性較好，C試劑對全血的核酸提取完整性最好，B、C、D三種試劑對淋巴結的核酸提取完整性較好，D試劑對脾臟的核酸提取完整性最佳，A、B、C、D、E五種試劑對腎臟組織的核酸提取完整性均較好.

圖1 提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳注:M:DNA Marker；N:陰性對照Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted Note:M:DNA Marker，N:Negative control

2.2 核酸提取的濃度及純度的測定

結果如表1a～表1e所示:5種試劑對同一樣本的核酸提取濃度分析提取效果可見試劑D對脾臟、腎臟、淋巴結、棉拭子4種樣本的核酸提取濃度最高，試劑C對全血樣本的核酸提取濃度最高.5種試劑對同一樣本的DNA提取純度分析提取效果可見，對口腔棉拭子樣本，試劑B的提取純度最好；對于全血樣本，試劑B的提取純度最好；對于淋巴結樣本，試劑B的提取純度好；對于脾臟樣本，試劑B、C的提取純度最好；對于腎臟樣本，試劑B、C的提取純度最好.

表1 e DNA提取液濃度純度測定(腎臟)Table 1e Determination of concentration and purity of DNA extract(kidney)

表1 d DNA提取液濃度純度測定(脾臟)Table 1d Determination of concentration and purity of DNA extract(spleen)

表1 c DNA提取液濃度純度測定(淋巴結)Table 1c DNA extract concentration and purity determination(lymph nodes)

表1 b DNA提取液濃度純度測定(全血)Table 1b Determination of concentration and purity of DNA extract(whole blood)

表1 a DNA提取液濃度純度測定(口腔棉拭子)Table 1a Determination of the concentration and purity of DNA extracts(oral cotton swabs)

2.3 不同試劑提取樣本核酸RT-qPCR CT值的測定

結果如表2所示:在口腔棉拭子組織中，試劑C與A極顯著(p＜0.01)，與D顯著(p＜0.05)，從CT值來看，試劑B提取ASFV DNA樣本初始模板濃度最高.在全血組織中，C試劑與B、E試劑之間極顯著(p＜0.01)，與A試劑顯著(p＜0.05)，B試劑提取ASFV DNA樣本初始模板濃度最高.在淋巴結組織中，C試劑與A、B、D、E試劑均極顯著(p＜0.01)，C試劑提取ASFV DNA樣本初始模板濃度最高.在脾臟組織中，C試劑與A、D試劑極顯著(p＜0.01)，與E試劑顯著(p＜0.05)，C試劑提取ASFV DNA樣本初始模板濃度最高.在腎臟組織中，C試劑與A、D、E試劑間極顯著(p＜0.01)，C試劑提取ASFV DNA樣本初始模板濃度最高.

表2 樣本CT值Table 2 CT values of samples

2.4 不同核酸提取試劑盒提取相同數(shù)量的樣本所需時間及儀器的比較結果

如表3所示，在15個樣本的核酸提取中，試劑C提取所需時間最長，所需儀器較多，E核酸提取試劑提取時間最短、所需儀器最少及最便攜.

表3 5種核酸提取試劑提取相同數(shù)量的樣本所需時間及儀器Table 3 Time and equipment required for five nucleic acid extraction reagents to extract the same number of samples

3 討論

本研究比較經典酚氯仿法、兩種DNA提取試劑以及三種DNA/RNA同提試劑對ASFV常用檢測樣本(口腔棉拭子、全血、淋巴結、脾臟、腎臟)的核酸提取效果，從核酸片段完整性、核酸濃度及純度、實時熒光PCR定量檢測CT值及耗時便攜性五個方面進行分析.

3.1 不同試劑提取核酸質量的比較

對于病毒核酸檢測，除了檢測試劑盒的特異性、敏感性和重復性等因素對檢測結果影響較大外，病毒核酸的質量對其影響也非常大.提取總DNA的方法眾多，采用不同的提取試劑及方法獲得的核酸片段完整性、DNA含量和純度也不同[15-16].本研究中，DNA專提試劑B、C所提總核酸片段完整度較好，總濃度較高，DNA純度較好，其中試劑B更優(yōu)于試劑C，原因可能是因為C是傳統(tǒng)的酚氯仿法，而B是采用柱純化技術的DNA提取試劑盒，因此提取總濃度及DNA純度更好.在DNA/RNA同提試劑A、C、D中，D試劑所提核酸片段完整性好，且總濃度最高，但DNA純度最差.E試劑提取核酸片段較完整，濃度較A高，純度是A、D、E三種DNA/RNA同提試劑中最好的.A試劑在口腔棉拭子和全血樣本中提取核酸片段較差，總濃度最低，DNA純度較差.因此，建議DNA病毒核酸提取用DNA專提試劑，提取核酸質量更好，本研究也為今后的ASFV核酸提取提供了參考.

3.2 同一試劑對不同樣本中ASFV DNA的提取比較

2016年孫盛用五種不同的試劑分別提取腸道內容物和糞便DNA，得出不同試劑對同一樣本提取效果有顯著差異的結論[17].在本研究中不同試劑對ASFV同一樣本的提取效果差異顯著(p＜0.05).試劑B提取ASFV口腔棉拭子和全血樣本CT值較低，效果更好；試劑C提取ASFV淋巴結、脾臟、腎臟等生物組織樣本CT值較低，效果更好，試劑C為經典酚氯仿法，試劑B為商品化DNA提取試劑，都為DNA專提，提取ASFV效果更好.在本研究中，同為DNA/RNA同提試劑盒的A、D、E中，試劑E對口腔棉拭子、淋巴結、脾臟、腎臟等樣本中的ASFV DNA提取效果較好，但對全血樣本的效果比試劑A和D差.因此，針對ASFV DNA的提取，可根據不同樣本選擇合適的提取試劑，會提高檢測結果的準確性和科學性.

3.3 核酸提取的時間和便攜性

在核酸提取時效性方面，以E試劑操作步驟最簡便，所需儀器最便攜，耗時最短.C試劑提取時間最長，所需儀器較多，所用時間最長.B試劑操作步驟簡單，雖所需儀器較多，但耗時較短.因此，在今后工作中，各實驗室可根據試驗目的、樣品數(shù)量、提取核酸類型及實驗室自身條件等情況，合理選擇核酸提取試劑，為動物疫病檢測獲得更合理、準確的數(shù)據.