王洪伸,林涌鵬,尹萌辰,常君麗,李欣怡,李永津，陳博來(lái)

(1. 廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)博士后科研流動(dòng)站，上海 201203；3.廣東省中醫(yī)院博士后科研工作站，廣東 廣州 510120；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 201203)

骨肉瘤是一種起源于骨間葉細(xì)胞的原發(fā)性惡性骨腫瘤，其血行轉(zhuǎn)移發(fā)生早且發(fā)生率高，進(jìn)展迅速。該病臨床治療以化學(xué)治療、外科手術(shù)、骨重建等方法為主，目前患者5年總體生存率由過(guò)去的20%左右提高到55%～75%[1-2]，但化療藥物毒副作用大、耐藥性高，因此迫切需要發(fā)現(xiàn)新型低毒高效的抗癌藥物[3-4]。DNA損傷修復(fù)是維持細(xì)胞活性的重要機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞DNA損傷后不能及時(shí)修復(fù)，損傷積累可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性升高、細(xì)胞增殖和分化失控[5]。因此，通過(guò)誘導(dǎo)骨肉瘤DNA損傷，或抑制骨肉瘤DNA修復(fù)，或開(kāi)發(fā)針對(duì)性靶向DNA損傷修復(fù)酶抑制劑，對(duì)骨腫瘤治療具有重要意義[6]。中藥重樓性微寒，味苦，有小毒，歸肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于癰瘡、咽喉腫痛、毒蛇咬傷等癥?，F(xiàn)代研究表明重樓具有較強(qiáng)抗腫瘤作用，其中重樓皂苷Ⅰ是皂苷類主要成分之一，對(duì)鼻咽癌[7]、肝癌[8]、肺癌細(xì)胞[9]、胃癌[10]等均有抑制作用，但對(duì)骨肉瘤細(xì)胞作用報(bào)道較少。本研究在團(tuán)隊(duì)前期基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索了重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)DNA損傷及潛在分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1細(xì)胞株和培養(yǎng) 人骨肉瘤MG63細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。將MG63細(xì)胞接種于含有10%FBS、100 μg/mL鏈霉素、100 IU/mL青霉素的MEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)下培養(yǎng)擴(kuò)增，每2～3 d使用含有0.25%EDTA的胰酶消化細(xì)胞傳代。

1.2主要藥物、試劑及儀器 重樓皂苷Ⅰ購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)有限公司(CAS No.50773-41-6，純度98%)；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，臺(tái)盼藍(lán)染色液、TUNEL試劑盒、DAPI、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、BeyoECL Plus顯色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司,正常熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自德國(guó)Biofroxx公司，低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Amersco公司,溴化乙錠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,三羥甲基胺基甲烷、鹽酸(HCl)、氫氧化鈉(NaOH)、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、堿性電泳緩沖液(pH=13)購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán),PBS來(lái)自瑞典Medicago公司,Bcl-2抗體、Bax抗體、PARP抗體來(lái)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，β-actin抗體來(lái)自美國(guó)Sigma公司，PVDF膜來(lái)自NEN Life Science公司,Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒來(lái)自美國(guó)Thermo公司,6孔、12孔、24孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板來(lái)自美國(guó)康寧公司,離心機(jī)、酶標(biāo)儀、Scientific Forma SeriesⅡ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，EMLBSLR顯微鏡購(gòu)自日本Leica公司，BH-20光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3細(xì)胞存活率檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為PBS對(duì)照組、0.625 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組、1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組，每組3個(gè)復(fù)孔。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG63細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，以濃度2×104/孔接種到24孔板(500 μL)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后每組相應(yīng)加入PBS、0.625 μmol/L重樓皂苷Ⅰ、1.25 μmol/L重樓皂苷Ⅰ孵育72 h，0.25%胰蛋白酶消化離心，吹散細(xì)胞后取懸浮細(xì)胞液30 μL與0.2%臺(tái)盼藍(lán)染液30 μL混合均勻，染色5 min，取20 μL加入Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，包括總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)、死亡細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞存活率。

1.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為PBS對(duì)照組、0.625 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組。將MG63細(xì)胞以1.5×105/孔(500 μL)接種至12孔板中培養(yǎng)24 h，檢視單層細(xì)胞融合度達(dá)到90%，用無(wú)菌PBS清洗2次。每孔添加800 μL無(wú)血清MEM培養(yǎng)基饑餓處理12 h。用無(wú)菌的200 μL槍頭在單層培養(yǎng)細(xì)胞劃痕，加入0.625 μmol/L重樓皂苷培養(yǎng)基培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h，每隔24 h在同一視野拍照，如細(xì)胞漂浮較多影響觀察更換無(wú)培養(yǎng)基。結(jié)束后使用Image J 軟件對(duì)照片分析，將500pix定義為1 cm，測(cè)量間隙距離，每張照片測(cè)量15次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為PBS對(duì)照組、0.625 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組、1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組，另設(shè)非染色細(xì)胞組、Annexin V-FITC染色細(xì)胞組、PI染色細(xì)胞組用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償，每組3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞以濃度1.5×105/mL，800 μL接種到12孔板培養(yǎng)2 h后將每孔培養(yǎng)基棄除，無(wú)血清MEM培養(yǎng)基饑餓處理12 h，每組加入PBS和相應(yīng)濃度重樓皂苷Ⅰ干預(yù)24 h，收集細(xì)胞。依照碧云天生物技術(shù)研究Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1063)說(shuō)明書(shū)操作步驟，BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.6細(xì)胞DNA損傷TUNEL法檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為PBS對(duì)照組、0.625 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組、1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG63細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化重懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/孔接種于48孔板(500 μL)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每組相應(yīng)加入PBS、0.625 μmol/L重樓皂苷Ⅰ、1.25 μmol/L重樓皂苷Ⅰ孵育48 h后收集樣品，按照碧云天試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算TUNEL/DPAI熒光值。

1.7細(xì)胞DNA損傷彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 分組同“1.6”，彗星實(shí)驗(yàn)采用三層凝膠結(jié)構(gòu)，第一層為正常熔點(diǎn)瓊脂糖，第二層為低熔點(diǎn)瓊脂糖和細(xì)胞核懸浮液的混合層，第三層為低熔點(diǎn)瓊脂糖，制備好玻片后，分別移去每組細(xì)胞蓋玻片，將載玻片浸入新配置的細(xì)胞裂解液中，4 ℃裂解90 min，然后將載玻片置于另一器皿中，倒入新配置的堿性電泳緩沖液，沒(méi)過(guò)膠面，堿解旋20 min；繼續(xù)進(jìn)行單細(xì)胞電泳：將載玻片轉(zhuǎn)移到電泳槽中，通過(guò)調(diào)節(jié)電泳液高低，使電壓、電流穩(wěn)定在25 V、300 mA，電泳10～15 min結(jié)束后，每片載玻片上滴加100 μL 30 μg/mL的溴化乙錠溶液，避光染色10 min后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。對(duì)每張玻片所載細(xì)胞利用Comet Assay Software Pect (CASP 1.2.3 beta 1) 慧星分析軟件分析結(jié)果照片計(jì)算尾部和總慧星熒光百分比(TailDNA%)。根據(jù)TailDNA%將細(xì)胞DNA損傷程度分為5級(jí)，比較各組損傷分級(jí)。0級(jí)：無(wú)損傷(正常細(xì)胞)，TailDNA%<5%；1級(jí)：低度損傷，TailDNA% 5%～20%；2級(jí)：中度損傷，TailDNA% 20%～40%；3級(jí)：重度損傷，TailDNA% 40%～90%；4級(jí)：完全損傷，TailDNA%>95%。

1.8損傷相關(guān)蛋白Western blot法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG63細(xì)胞,分別接種至6孔板，分別予1.25 μmol/L重樓皂苷Ⅰ處理0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、3 h、6 h后收集蛋白樣品，加入400 μL RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心(離心半徑8.4 cm)10 min，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品中加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，沸水煮10 min，蛋白變性。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉2 h，將Bax、Bcl-2、Cleaved PARP一抗稀釋(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶5 000)，TBST洗滌，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，檢測(cè)Bax、Bcl-2、Cleaved PARP蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1MG63細(xì)胞存活率比較 PBS對(duì)照組、0.625 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組和1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組細(xì)胞存活率分別為(97.51±0.51)%、(68.84±1.80)%、(34.33±2.23)%，0.625 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組和1.25 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組細(xì)胞存活率均明顯低于PBS對(duì)照組(P均<0.05)，且1.25 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組明顯低于0.625 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組(P<0.05)。

2.2MG63細(xì)胞遷移能力比較 PBS對(duì)照組和0.625 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組劃痕初始寬度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)(P>0.05)，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)0.625 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組的劃痕寬度均大于PBS對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)圖1及表1。

圖1 2組MG63細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞遷移情況(×100)

表1 2組MG63細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞遷移能力比較

2.3MG63細(xì)胞凋亡率比較 PBS對(duì)照組、0.625μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組和1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組細(xì)胞凋亡率分別為(2.56±0.20)%、(19.58±3.09)%、(66.08±4.02)%，0.625 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組和1.25 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組均明顯高于PBS對(duì)照組(P均<0.05)，且1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組明顯高于0.625 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組MG63細(xì)胞凋亡流式圖

2.4MG63細(xì)胞TUNEL/DPAI熒光值比較 PBS對(duì)照組、0.625 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組和1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組TUNEL/DPAI熒光值分別為0.03±0.01，0.15±0.01，0.28±0.01，0.625 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組和1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組均明顯高于PBS對(duì)照組(P均<0.05)，且1.25 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組明顯高于0.625 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 TUNEL法檢測(cè)各組MG63細(xì)胞 DNA損傷情況(×100)

2.5MG63細(xì)胞DNA損傷率比較 PBS對(duì)照組、0.625 μmol/L重樓皂苷Ⅰ組和1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組細(xì)胞TailDNA%分別為(1.87±0.78)%、(14.12±4.75)%、(28.9±8.78)%，損傷分級(jí)分別為0級(jí)、1級(jí)、2級(jí)，0.625 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組和1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組細(xì)胞DNA損傷率均明顯高于PBS對(duì)照組(P均<0.05)，且1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組明顯高于0.625 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ組(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組MG63細(xì)胞DNA損傷情況(×100)

2.6凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ培養(yǎng)0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、3 h、6 h后，Bax、Cleaved PARP蛋白表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低。見(jiàn)圖5。

圖5 1.25 μmol/L 重樓皂苷Ⅰ培養(yǎng)不同時(shí)間后MG-63細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

古代中醫(yī)文獻(xiàn)中，骨肉瘤屬于“骨瘤”“骨疽”“石疽”“石癰”等范疇?！鹅`樞·刺節(jié)真邪》曰：“有所結(jié)，深中骨，氣因于骨，骨與氣并，日以益大，則為骨瘤?！薄锻饪茦幸吩疲骸叭魝I氣，不能榮骨而為腫者，其自骨腫起，按之堅(jiān)硬，名曰骨瘤?！薄夺t(yī)宗金鑒》云“癰疽原是火毒生，經(jīng)絡(luò)阻塞氣血凝”，并謂“繭唇”(唇癌)乃“脾胃積火”積聚而成?！笆s”由“憂思恚怒，氣郁血逆，與火凝結(jié)而成”?！豆沤襻t(yī)統(tǒng)》亦指出：“氣血日虧，相火漸熾，幾何不致噎膈?！迸R床發(fā)現(xiàn)瘀熱火毒與腫瘤常并存，轉(zhuǎn)移性腫瘤中、晚期常伴有病灶局部青紫、瘀斑、瘀點(diǎn)、灼熱、五心煩熱、口渴尿赤、便秘、舌質(zhì)暗苔黃膩等瘀熱證候。上海中醫(yī)藥大學(xué)骨傷科名家施杞教授凝練總結(jié)腫瘤患者晚期“氣虛血瘀、瘀阻化熱”的病因病機(jī)特點(diǎn)，提出“益氣化瘀、清熱解毒”治療原則，精心研制抗腫瘤國(guó)家新藥—芪珍膠囊(珍珠、黃芪、三七、大青葉、重樓)，能夠有效抑制腫瘤進(jìn)展，緩解癥狀。本研究從DNA損傷角度研究了其中重樓有效組分重樓皂苷Ⅰ對(duì)骨肉瘤的抑制作用，進(jìn)一步探索傳統(tǒng)藥物抗腫瘤效應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。

本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ能夠抑制多種骨肉瘤細(xì)胞活性并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制包括抑制NF-κB和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)通路活性、上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(C-Myc、cyclin B1、cyclin D1)表達(dá)和促凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Cleaved PARP)表達(dá)、下調(diào)抗凋亡Bcl-2基因表達(dá)等[11-12]。此外重樓皂苷能夠抑制肺腺癌細(xì)胞A549、NCI-H1299增殖，下調(diào)cyclin B表達(dá)[13]，可抑制胃癌細(xì)胞PDK1/Akt/mTOR信號(hào)通路活性[14]，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞線粒體紊亂而使細(xì)胞凋亡[15]。重樓皂苷Ⅰ抗腫瘤作用機(jī)制廣泛，涉及細(xì)胞增殖、凋亡、生長(zhǎng)、分化等多個(gè)細(xì)胞進(jìn)程，但其造成DNA損傷的具體結(jié)構(gòu)和靶點(diǎn)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，重樓皂苷Ⅰ能促進(jìn)MG63細(xì)胞凋亡，可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷，PARP作為凋亡標(biāo)志酶可能參與其中關(guān)鍵過(guò)程，但仍需進(jìn)一步深入探索。

綜上所述，DNA損傷可引起細(xì)胞周期阻滯、凋亡、衰老、自噬等，是抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的重要策略。重樓皂苷Ⅰ能誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞DNA鏈斷裂，抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制可能與DNA-PKcs相關(guān)，或與組蛋白甲基化修飾有關(guān)，如何對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾具有靶向功能、或與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用提高復(fù)發(fā)/難治性骨肉瘤的療效尚需深入探討。此外，DNA損傷在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡同時(shí)，也可能導(dǎo)致正常細(xì)胞異常增殖或癌變，在研究中需要注意。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。