朱楚霞，肖鈴娣，胡朝陽，曾黎明，劉世強，周 勇

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

【研究意義】黃瓜（Cucumis sativusL.）是中國種植和消費最廣泛的蔬菜作物之一。但是在黃瓜生長發(fā)育過程中經(jīng)常會遭受高鹽和干旱等非生物逆境、以及白粉病等生物逆境的脅迫，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，發(fā)掘黃瓜逆境脅迫相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因，不僅能揭示抗性的分子遺傳機制，也能加快黃瓜抗性育種進程?！厩叭搜芯窟M展】絲氨酸羧肽酶類（serine carboxypeptidase-like，SCPL）蛋白是在Pfam 中以PF00450為代表結(jié)構(gòu)域的一類蛋白質(zhì)，廣泛存在于高等植物，少量存在于低等植物、細(xì)菌、真菌中[1]。它們在結(jié)構(gòu)和功能上與絲氨酸羧肽酶（serine carboxypeptidase，SCP）比較相似，且同屬于SC羧肽酶中的S10家族，由具有獨特催化中心、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)高度保守的α/β 水解酶三級結(jié)構(gòu)組成[2-4]。在結(jié)構(gòu)上，SCPL 蛋白與SCP差別不大，均含有1個細(xì)胞內(nèi)分泌和轉(zhuǎn)運的信號肽、4個底物結(jié)合位點、多個N-糖基化位點以及與催化作用相關(guān)的進化保守區(qū)域[5-6]；而且這些區(qū)域一般處于SCPL/SCP 蛋白的中部，其氨基酸殘基比較保守，但是它們的N 端和C 端氨基酸殘基保守性較差。SCPL/SCP 蛋白含有2個特殊的結(jié)構(gòu)：一是由絲氨酸（由保守的Gly-X-Ser-X-Gly 序列環(huán)繞，其中Gly代表甘氨酸，Ser代表絲氨酸，X代表任意氨基酸）、天冬氨酸（Asp）和組氨酸（His）組成保守催化三聯(lián)體（Ser-Asp-His），能夠結(jié)合底物，構(gòu)成與底物結(jié)合的氫鍵網(wǎng)絡(luò)并進行電荷的傳遞；二是具有氧離子洞，可以穩(wěn)定底物-酶復(fù)合體的反應(yīng)中間體[5，7-8]。在功能上，SCPL/SCP蛋白普遍具有肽酶活性；而一些SCPL 蛋白卻有?；D(zhuǎn)移酶活性，可以利用O 型葡萄糖酯?；?-O-βglucose ester）作為底物進行?；磻?yīng)[3-4，9]。【本研究切入點】研究表明，SCPL 蛋白主要分布在植物的液泡、溶酶體等部位，在細(xì)胞伸長、種子發(fā)育等生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。如GS5（grain size 5）是水稻中一個控制籽粒大小和產(chǎn)量的正調(diào)控因子，其啟動子區(qū)域的2個關(guān)鍵單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）造成幼穗中GS5的差異表達(dá)，引起籽粒大小的差異[10-11]。提莫菲維小麥（Triticum timopheevi）中GS5的同源蛋白TtGS5-3A-G和TtGS5-3G-G可能通過與膜聯(lián)蛋白Annexin D1互作，從而調(diào)控籽粒的大小[12]。已有研究表明，SCPL 蛋白還參與很多次生代謝產(chǎn)物的合成，如葡萄糖聚酯、花青素、單寧酸、芥子堿等[13-16]，并在植物的生物與非生物逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用。如水稻OsBISCPL1基因在水楊酸和茉莉酸誘導(dǎo)下表達(dá)，其轉(zhuǎn)基因植株增強了對丁香假單胞假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）和蕓薹生鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）的抗性，并表現(xiàn)出一定的抗氧化脅迫性[17]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】SCPL基因在調(diào)控植物生物發(fā)育以及逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，但是目前還未見黃瓜中有關(guān)SCPL基因的研究報道。在本研究中，筆者應(yīng)用生物信息學(xué)方法，在黃瓜基因組數(shù)據(jù)中檢索了SCPL基因，分析這些基因的染色體定位、序列特征、進化關(guān)系、組織和脅迫表達(dá)譜等，研究結(jié)果將為進一步深入闡明黃瓜SCPL蛋白的功能提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 黃瓜SCPL家族成員的鑒定

利用PFAM 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）中登錄號PF00450 下載SCPL基因的隱形馬爾科夫模型（hidden markov model，HMM）文件，在HMMER v3.0 軟件中利用SCPL家族的HMM 配置文件對黃瓜Chinese Long v2版本蛋白數(shù)據(jù)庫（http://cucurbitgenomics.org/organism/2）進行掃描。同時以擬南芥SCPL蛋白作為查詢序列，在黃瓜Chinese Long v2 基因組網(wǎng)站進行BLAST。整合HMMER 和BLAST 結(jié)果，去掉長度低于200 aa 的蛋白序列后，剩下的候選蛋白利用PFAM 和SMART 網(wǎng)站（http://smart.embl-heidelberg.de/）進行驗證，最后具有PF00450特征結(jié)構(gòu)域的蛋白序列被鑒定為黃瓜SCPL基因家族成員。

1.2 黃瓜SCPL蛋白理化性質(zhì)分析

從黃瓜Chinese Long v2基因組數(shù)據(jù)庫中下載黃瓜SCPL基因的編碼蛋白序列，參考前人的文獻(xiàn)[18]，利用ExPASy 服務(wù)器中的ProtParam 工具（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測每個黃瓜SCPL 蛋白的氨基酸（amino acid，aa）數(shù)目、分子量（molecular weight，MW）、等電點（isoelectric point，pI）以及親疏水性均值（grand average of hydropathicity，GRAVY）；并利用Plant-mPLoc 程序（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）對黃瓜SCPL蛋白進行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.3 黃瓜SCPL家族成員系統(tǒng)發(fā)育及基因結(jié)構(gòu)分析

基于前人的文獻(xiàn)[19]，在TAIR（the arabidopsis information resource）數(shù)據(jù)庫（http://www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥SCPL基因家族成員的蛋白序列。將擬南芥和黃瓜SCPL 蛋白序列在MAFFT 網(wǎng)站（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）進行比對后，導(dǎo)入MEGA 7.0 中，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）對SCPL 蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，校驗參數(shù)Bootstrap 值設(shè)置為1 000。從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫中下載黃瓜SCPL基因的CDS 及gDNA 序列，利用Gene Structure Display Server（GSDS）軟件（http://gsds.gao-lab.org/）對SCPL基因結(jié)構(gòu)進行可視化分析。

1.4 基于轉(zhuǎn)錄組的黃瓜SCPL基因表達(dá)分析

參考前人的文獻(xiàn)[20]，從NCBI 的SRA 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=sra046916，登錄號：PRJNA80169）中下載黃瓜根、莖、葉、花、子房和卷須等組織的RNA-seq 數(shù)據(jù)，分析SCPL基因的組織表達(dá)模式。從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載黃瓜葉和根的鹽脅迫基因表達(dá)數(shù)據(jù)，分析黃瓜SCPL基因在鹽脅迫下的表達(dá)譜，登錄號分別為GSE116265 和PRJNA511946[21-22]。從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載SSL508-28（高抗白粉病且能穩(wěn)定遺傳的片段代換系）和D8（高感白粉病受體親本）在接種白粉病菌48 h 后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（登錄號：GSE81234）[23]，分析黃瓜SCPL基因在接種白粉病菌后的表達(dá)模式。參考筆者之前的方法，將基因表達(dá)數(shù)據(jù)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化為TPM（transcripts per kilobase million）值[24]。若TPM 值＜1.0，則認(rèn)為基因表達(dá)豐度太低。所有CsaSCPL基因表達(dá)數(shù)據(jù)均以log2（TPM+1）值顯示，利用TBtools 軟件繪制基因表達(dá)熱圖[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜SCPL家族的鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析

通過HMMER 軟件篩選及功能域驗證，從黃瓜基因組中鑒定出27 個SCPL家族基因，根據(jù)它們在染色體上的位置信息，將它們命名為CsaSCPL1～CsaSCPL27（表1）。這些基因分布在黃瓜所有7 條染色體上。其中，1 號和3 號染色體上含有數(shù)量最多的CsaSCPL基因（各6 個），4 號染色體上分布著5 個基因，7 號染色體上分布著4 個基因，而2 號、5 號和6 號染色體含有數(shù)量最少的CsaSCPL基因（各2 個）。

表1 黃瓜SCPL家族成員基本信息Tab.1 Basic information of the SCPL gene family in cucumber

通過對蛋白的理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜SCPL 蛋白分子量在24.40 ku（CsaSCPL14）～88.75 ku（CsaSCPL23）不等，等電點pI在5.01（CsaSCPL12）～9.20（CsaSCPL23）范圍內(nèi)分布。GRAVY值預(yù)測結(jié)果表明黃瓜SCPL蛋白幾乎全部為親水性蛋白（CsaSCPL14除外）。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示CsaSCPL 蛋白大多定位于液泡，少量定位于過氧化物酶體和胞外。

2.2 黃瓜SCPL家族成員系統(tǒng)進化分析

為揭示黃瓜SCPL基因的系統(tǒng)進化關(guān)系，選取擬南芥和黃瓜的全部SCPL 蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖1 所示。根據(jù)進化樹的分支，CsaSCPL 和AtSCPL 家族成員在系統(tǒng)發(fā)育上可以分為3 組：SCPL-I、SCPL-II、SCPL-III。其中黃瓜CsaSCPL 成員在SCPL-I 中數(shù)量最多，有17 個；在SCPL-II 和SCPLIII中成員數(shù)量較少，各有5個。

圖1 黃瓜與擬南芥SCPL家族成員系統(tǒng)進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of SCPL family members from cucumber and Arabidopsis

2.3 黃瓜SCPL蛋白保守基序分析

利用MEME在線軟件構(gòu)建了黃瓜保守基序的結(jié)構(gòu)特征圖（圖2），結(jié)果表明CsaSCPL 蛋白均含有典型的保守基序Motif 1。其中，絕大多數(shù)SCPL-I 中的CsaSCPL 蛋白都含有Motif 1-10（CsaSCPL1、CsaSCPL12、CsaSCPL13、CsaSCPL14除外），且Motif的相對位置也較為保守。與SCPL-I相比，SCPL-II與SCPLIII 中的大部分CsaSCPL 蛋白都含有種類較少的保守基序。如CsaSCPL6 缺少Motif 1～4，CsaSCPL17 缺少Motif 2、Motif 9、Motif 10。結(jié)合進化樹可以發(fā)現(xiàn)，CsaSCPL 蛋白的保守基序特征與進化樹基本保持一致。另外值得注意的是，CsaSCPL21（SCPL-I）和CsaSCPL18（SCPL-II）分別出現(xiàn)了Motif 6和Motif 8的復(fù)制，且復(fù)制均出現(xiàn)在其對應(yīng)蛋白的N端（圖2）。

圖2 黃瓜SCPL家族成員系統(tǒng)進化及蛋白質(zhì)保守基序分析Fig.2 Phylogenetic relationship and conserved motif analysis of SCPL family members in cucumber

2.4 黃瓜SCPL基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析

本研究分析了CsaSCPL基因外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3 所示。除CsaSCPL20以外，其它CsaSCPL基因都含有3～13個數(shù)量不等的內(nèi)含子。結(jié)合進化樹，SCPL-II組和SCPL-III組中的CsaSCPL成員（CsaSCPL20除外）普遍含有數(shù)量較多的內(nèi)含子（8～13 個），而SCPL-I 組中的CsaSCPL成員含有內(nèi)含子的數(shù)量為3～9個。此外，親緣關(guān)系近的CsaSCPL基因普遍具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，只是內(nèi)含子的長度有一些變化。這些結(jié)果進一步支持了CsaSCPL基因的分類。

圖3 黃瓜SCPL家族成員系統(tǒng)進化及基因結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Phylogenetic relationship and gene structure analysis of SCPL family members in cucumber

2.5 黃瓜SCPL基因在不同組織中的表達(dá)模式

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載CsaSCPL各成員在不同組織中的表達(dá)情況，利用TBtools軟件熱圖工具展示結(jié)果并取對數(shù)，結(jié)果如圖4所示。CsaSCPL1和CsaSCPL10分別在葉和根中特異表達(dá)，表明它們在葉和根的發(fā)育過程中具有重要的作用。此外，CsaSCPL2、CsaSCPL4、CsaSCPL5、CsaSCPL9、CsaSCPL15、CsaSCPL16、CsaSCPL18、CsaSCPL22和CsaSCPL26在雌花和雄花上的表達(dá)差異顯著，暗示它們可能參與花的發(fā)育。此外，CsaSCPL2、CsaSCPL4、CsaSCPL5、CsaSCPL11、CsaSCPL19、CsaSCPL26和CsaSCPL27在子房發(fā)育的不同階段有明顯的差異，表明它們可能參與黃瓜子房的發(fā)育。

圖4 黃瓜CsaSCPL基因組織表達(dá)譜Fig.4 Tissue expression profiles of cucumber CsaSCPL genes

2.6 黃瓜SCPL基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式

結(jié)合前人的鹽脅迫表達(dá)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[21-22]，獲得了黃瓜SCPL基因在鹽脅迫下的表達(dá)量數(shù)據(jù)（圖5）。結(jié)果顯示，在鹽脅迫處理的葉片中，CsaSCPL2、CsaSCPL11和CsaSCPL19的表達(dá)量明顯上升，而CsaSCPL1的表達(dá)量則明顯下降，其余基因的表達(dá)量沒有明顯的差異。在鹽脅迫處理的根中，CsaSCPL11的表達(dá)量明顯上升，而CsaSCPL2、CsaSCPL16和CsaSCPL18的表達(dá)量明顯下降。這些結(jié)果表明這些CsaSCPL基因可能參與黃瓜鹽脅迫響應(yīng)。

圖5 黃瓜SCPL家族基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式Fig.5 Expression profiles of cucumber CsaSCPL genes under salt stress

2.7 黃瓜SCPL基因在白粉病脅迫下的表達(dá)分析

為了揭示CsaSCPL基因在黃瓜抗白粉病中的功能，本研究利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析了黃瓜SCPL家族基因在D8和SSL508-28接種白粉病菌前后的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，在D8（高感白粉病受體親本）接種白粉病菌后，CsaSCPL2、CsaSCPL4、CsaSCPL9、CsaSCPL11、CsaSCPL15、CsaSCPL24、CsaSCPL27的表達(dá)量明顯上升，而CsaSCPL1的表達(dá)量則明顯下降（圖6）。而在SSL508-28（高抗白粉病且能穩(wěn)定遺傳的片段代換系）接種白粉病菌后，CsaSCPL15的表達(dá)量明顯上升，其余基因表達(dá)量沒有明顯的變化（圖6）。

圖6 黃瓜SCPL家族基因在D8和SSL508-28中白粉病菌響應(yīng)分析Fig.6 Expression profiles of cucumber CsaSCPL genes in response to powdery mildew infection in D8 and SSL508-28

3 結(jié)論與討論

SCPL 蛋白是一類大的蛋白質(zhì)水解酶家族，目前已從多個物種中分離到SCPL基因及其蛋白，發(fā)現(xiàn)它們在種子萌發(fā)、細(xì)胞程序性死亡、次生代謝產(chǎn)物的合成以及抵抗逆境脅迫等過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用生物信息學(xué)的方法，在全基因組水平上對黃瓜SCPL基因家族進行了鑒定，一共得到27 個CsaSCPL基因，它們不均等地分布在黃瓜的7 條染色體上（表1）。SCPL基因在不同物種內(nèi)包含的家族成員數(shù)目差異較大，如擬南芥[19]、水稻[26]、楊樹[8]、茶樹[27]、小麥[28]中分別鑒定到54、71、57、47、210 個SCPL基因，而且這些物種中SCPL基因的數(shù)量并不取決于其基因組的大小。因此，SCPL基因數(shù)量的變化可能主要與基因復(fù)制事件有關(guān)。本研究中黃瓜具有相對數(shù)目明顯偏少的CsaSCPL基因，這可能是由于黃瓜在進化過程中發(fā)生了相對較少的染色體復(fù)制事件[29-30]。之前在黃瓜GRAS[31]、IQD/SUN[32]等基因家族中的研究也表明較少的染色體復(fù)制事件是導(dǎo)致這些家族成員偏少的主要原因。理化性質(zhì)分析結(jié)果表明CsaSCPL 蛋白的酸堿性差異明顯，有19 個CsaSCPL 蛋白的pI 值呈酸性，占比70%（表1）。之前的研究結(jié)果也表明：在楊樹、茶樹、小麥等物種中酸性SCPL蛋白的占比分別為73%[8]、77%[27]、80%[28]。因此，與其它物種一樣，大部分的CsaSCPL蛋白也需要在酸性條件下才能激活催化三聯(lián)體（Ser-Asp-His）從而發(fā)揮水解功能。此外，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，CsaSCPL蛋白主要定位于液泡，少量定位于過氧化物酶體和胞外，表明CsaSCPL蛋白主要在液泡中發(fā)揮作用。但是之前的研究表明茶樹的大多數(shù)SCPL 蛋白定位于細(xì)胞膜與溶酶體[27]，表明黃瓜與茶樹的SCPL蛋白可能存在功能上的差異。筆者同時對黃瓜和擬南芥中的SCPL蛋白進行系統(tǒng)進化發(fā)育分析，結(jié)果表明它們在系統(tǒng)發(fā)育上可以分為3組，分別為SCPL-I、SCPL-II和SCPL-III（圖1），其中SCPL-I 的成員數(shù)量明顯多于SCPL-II 和SCPL-III，而且親緣關(guān)系接近的CsaSCPL 成員的保守基序分布和基因結(jié)構(gòu)也非常相似（圖2、3），這與先前對其它物種SCPL 家族的報道一致，如擬南芥[19]、楊樹[8]、茶樹[27]、小麥[28]等。

之前的研究表明，一些植物SCPL家族基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性。如擬南芥At2g23000、At1g33540、At5g42230和At1g43780分別僅在衰老的葉片、根、花和幼苗中表達(dá)；而At1g73310、At3g10450、At2g23010、At2g22970、At4g12910雖然在根、莖、葉、花以及角果等組織中都有表達(dá)，但是它們分別在根、衰老的葉片、幼苗、花、角果中具有最高的表達(dá)量[33]。茶樹CsSCPL2-IA、CsSCPL3-IA、CsSCPL22-IA、CsSCPL23-IA只在頂芽、幼葉和莖中表達(dá)[27]。水稻GS5基因在綠色組織中的表達(dá)量高于莖稈、根、幼穗、胚乳等非綠色組織；而在非綠色組織中，GS5的表達(dá)量在長度為1-11 cm的幼穗中最高[10]。本研究檢測了黃瓜SCPL基因的組織表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)CsaSCPL基因的表達(dá)量也具有組織特異性。如分析CsaSCPL基因在花中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)CsaSCPL16和CsaSCPL22僅在雄花中表達(dá)，而CsaSCPL2、CsaSCPL5、CsaSCPL15、CsaSCPL18和CsaSCPL26僅在雌花中表達(dá)（圖4），表明它們在黃瓜花發(fā)育過程中具有重要的作用。之前的研究表明：相比野生型植株，過表達(dá)NtSCP1的轉(zhuǎn)基因煙草植株中花的長度變短了18%～28%[34]。一些CsaSCPL基因則在不同發(fā)育時期的子房中有明顯的差異表達(dá)（圖4），表明它們可能參與了黃瓜果實發(fā)育過程。之前的結(jié)果也表明水稻GS5及其同源基因TtGS5-3A-G和TtGS5-3G-G均參與籽粒大小的調(diào)控[10-12]。過表達(dá)玉米ZmGS5可增加轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的千粒重，表明ZmGS5也可能在籽粒發(fā)育過程中具有重要作用[35]。此外，一些親緣關(guān)系接近的CsaSCPL基因也表現(xiàn)出明顯不同的組織表達(dá)模式。如CsaSCPL1/15、CsaSCPL10/11、CsaSCPL18/19這些基因?qū)υ谟H緣關(guān)系上具有較高同源性（圖1），但是它們的組織表達(dá)模式卻具有很大的差別（圖4）。類似的結(jié)果也在其它物種中檢測到。如楊樹PtSCPL02/33、PtSCPL03/34、PtSCPL15/51、PtSCPL25/53、PtSCPL42/46等基因?qū)憩F(xiàn)出明顯不同的組織表達(dá)模式，但是它們卻擁有相同的保守基序分布和基因結(jié)構(gòu)，表明它們在楊樹不同組織中發(fā)揮相同或相似的功能[8]。

為了解黃瓜SCPL基因家族對逆境的脅迫反應(yīng)，筆者借助轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析了CsaSCPL基因在鹽脅迫和白粉病菌侵染條件下表達(dá)量的變化。結(jié)果表明一些CsaSCPL基因的表達(dá)量在鹽脅迫處理下發(fā)生明顯的變化（圖5），表明它們可能調(diào)控黃瓜植株的耐鹽性。最近的研究也表明，在鹽和旱處理條件下小麥TaSCPL184-6D和TaSCPL68-3A的表達(dá)量明顯上升，而TaSCPL63-3A和TaSCPL7-1A的表達(dá)量則明顯下降；同時在擬南芥中過表達(dá)小麥TaSCPL184-6D基因顯著提升了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱和耐鹽能力[28]。此外，有8 個CsaSCPL基因的表達(dá)量在白粉病菌侵染條件下發(fā)生明顯變化（圖6）。值得注意的是，CsaSCPL15的表達(dá)量在D8 和SSL508-28 接種白粉病菌后均明顯上升，而且其在抗性株系SSL508-28中的表達(dá)量明顯高于敏感株系D8（圖6），表明CsaSCPL15在黃瓜抵御白粉病侵染過程中發(fā)揮重要功能。