邱珊姍，鄧凌帆，劉苗苗，張建強(qiáng)，王顏波，劉齊元，王建革*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江西 南昌 330045；2.南昌工程學(xué)院 水利與生態(tài)工程學(xué)院，江西 南昌 330029；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045）

【研究意義】植物雜交育種重要的目的之一是充分利用雜種優(yōu)勢(shì)。作為促進(jìn)異交防止近交的繁育機(jī)制，自交不親和（self-incompatibility，SI）是開(kāi)花植物中廣泛存在的現(xiàn)象，但對(duì)于專(zhuān)性自交不親和植物來(lái)講，雖然后代均為雜交種，但由于親本雜合，很難獲得最大雜種優(yōu)勢(shì)。自交不親和與自交親和相互轉(zhuǎn)換在自交不親和植物中非常普遍[1-4]，如果專(zhuān)性自交不親和植物能夠從自交不親和轉(zhuǎn)變成自交親和，則可以通過(guò)自交育種途徑獲取最大雜種優(yōu)勢(shì)，從而為自交不親和物種育種開(kāi)辟新的途徑，因此，研究自交不親和機(jī)理對(duì)于專(zhuān)性自交不親和植物育種方式轉(zhuǎn)變具有重要意義。珍稀木蘭科（Magnoliaceae）植物華木蓮（Sinomanglietia glauca）為遲發(fā)性自交不親和（late-acting SI，LSI）物種，研究發(fā)現(xiàn)其存在孢子體自交不親和（sporophytic SI，SSI）決定基因S 位點(diǎn)受體激酶（S_locus receptor kinase，SRK）基因高度同源的基因。研究該基因在華木蓮自交不親和中的作用，不僅為揭示華木蓮自交不親和機(jī)理研究提供理論資料，對(duì)華木蓮育種方式改變也具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】基于表型遺傳控制模式，通常將植物自交不親和分為配子體自交不親和（gametophytic SI，GSI）及孢子體自交不親和（SSI）兩類(lèi)，后來(lái)，又分出了遲發(fā)性自交不親和（LSI）類(lèi)型[5-6]。研究表明，自交不親和由一個(gè)S位點(diǎn)控制，其上包含2個(gè)緊密連鎖的S基因：花粉S決定基因和雌蕊S 決定基因，它們以單倍型形式出現(xiàn)，連鎖被打破則會(huì)造成自交不親和向自交親和的轉(zhuǎn)換[2]。在具有配子體自交不親和特性的車(chē)前科（Plantaginaceae）、茄科（Solanaceae）和薔薇科（Rosaceae）植物中，雌蕊S 決定因子為柱頭S 核糖核酸酶（S-ribonuclease，S-RNase），花粉S 決定因子為花粉S 位點(diǎn)Fbox（S-locus F-box，SLF）或S 單倍型特有F-box（S-haplotype-specific F-box，SFB）。罌粟科（Papaveraceae）植物中自交不親和雖然也為配子體自交不親和，但雌蕊決定因子為柱頭乳頭細(xì)胞分泌蛋白（stigmaexpressed secreted protein，PrsS），花粉決定因子為花粉表達(dá)跨膜受體蛋白（pollen-expressed transmembrane protein，PrpS）[7]。十字花科（Brassicaceae）植物中自交不親和為孢子體自交不親和類(lèi)型，雌蕊決定因子為柱頭S位點(diǎn)受體激酶（SRK），花粉決定因子為花粉外殼S位點(diǎn)富半胱氨酸蛋白（S-locus cysteine-rich protein，SCR）或S 位點(diǎn)蛋白11（S-locus protein 11，SP11）[8]。相對(duì)于上述兩種自交不親和，遲發(fā)性自交不親和研究相對(duì)滯后，遺傳機(jī)制并不清楚。研究表明，遲發(fā)性自交不親和通常分布于同科或同屬物種中[6]，在木蘭科（Magnoliaceae），除華木蓮（S.glauca）外，白玉蘭（Magnolia denudata）自花授粉后花粉管生長(zhǎng)與異花花粉管生長(zhǎng)相同，但胚珠發(fā)育停滯在魚(yú)雷期，也表現(xiàn)遲發(fā)性自交不親和[9]。遲發(fā)性自交不親和在被子植物基部類(lèi)群中發(fā)現(xiàn)較多，這些物種在系統(tǒng)發(fā)生上聚集成簇，但詳細(xì)研究?jī)H限于基部類(lèi)群中的五味子科（Schisandraceae），不過(guò)木蘭分支自交不親和物種中尚未發(fā)現(xiàn)配子體自交不親和與孢子體自交不親和類(lèi)型[6]。值得關(guān)注的是，雖然遲發(fā)性自交不親和分子機(jī)制并不清楚，但在具有遲發(fā)性自交不親的特性的山茶科茶樹(shù)（Camellia sinensis）中發(fā)現(xiàn)了與孢子體自交不親和雌性決定基因SRK基因高度同源基因[10-11]。SRK同源基因是目前遲發(fā)性自交不親和中發(fā)現(xiàn)的唯一一類(lèi)與已知自交不親和基因高度同源的基因，這引發(fā)了以下問(wèn)題：1）SRK基因是否在遲發(fā)性自交不親和反應(yīng)中起作用？2）如果起作用，其功能是什么？在什么部位、在何時(shí)起作用？3）如果SRK基因在遲發(fā)性自交不親和中無(wú)作用，如此保守的SRK基因的功能是什么？華木蓮（S.glauca），又名落葉木蓮（Manglietia decidua），是木蘭科珍稀植物，形似木蓮，落葉特性上又與木蘭相似，進(jìn)化上處于木蓮屬和木蘭屬連接位置，在被子植物起源和演化方面具有重要科研價(jià)值[12-13]。華木蓮花果、干形均具觀(guān)賞價(jià)值，在園林應(yīng)用上也極具應(yīng)用前景。目前華木蓮分布在江西宜春明月山和湖南永順個(gè)別地區(qū)，分布區(qū)呈狹島狀，面積不足36 km2，被列入國(guó)家保護(hù)和拯救物種[13-14]。華木蓮生存競(jìng)爭(zhēng)力弱，種群天然更新能力差，扦插、組培均未成功，目前只能靠種子繁殖。細(xì)胞學(xué)和胚胎學(xué)研究表明，華木蓮大小孢子正常、胚胎發(fā)育也正常[15-16]。傳粉生物學(xué)表明，華木蓮雖然數(shù)量不多，且具自交不親和特性，但野生70 年生植株仍有單株產(chǎn)果約45 kg、產(chǎn)籽45 000 粒的能力,人工繁育表明，經(jīng)過(guò)低溫沙藏的種子萌發(fā)率在90%以上[17]。以上結(jié)果表明生殖保障并非是華木蓮瀕危的原因，瀕危原因在于生存競(jìng)爭(zhēng)力弱。華木蓮為專(zhuān)性自交不親和植物，如果能改變?nèi)A木蓮繁育方式，通過(guò)人工培育，充分利用雜種優(yōu)勢(shì)，提高華木蓮生存競(jìng)爭(zhēng)力，則將為華木蓮育種帶來(lái)新局面。華木蓮自花和異花花粉管生長(zhǎng)6 h并無(wú)差別，未授粉心皮在7 d 左右脫落，自花授粉心皮在15 d 左右脫落，表現(xiàn)遲發(fā)性自交不親和特征，轉(zhuǎn)錄組分析鑒定出了SRK高度同源基因SgSRK。為了揭示SgSRK基因在華木蓮遲發(fā)性自交不親和中的作用，本研究對(duì)該基因進(jìn)行了克隆和亞細(xì)胞定位研究，研究結(jié)果表明SgSRK基因具有典型的SRK結(jié)構(gòu)域和理化性質(zhì)，擁有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，具備磷酸化功能，亞細(xì)胞定位觀(guān)察支持該基因編碼蛋白定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。

【本研究切入點(diǎn)】鑒于到目前為止，SRK同源基因是目前遲發(fā)性自交不親和中發(fā)現(xiàn)的唯一一類(lèi)與已知自交不親和基因高度同源的基因，因此，研究華木蓮S(chǎng)RK同源基因在遲發(fā)性自交不親和中的作用成為揭示華木蓮自交不親和機(jī)制的著手點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】SgSRK克隆及亞細(xì)胞定位觀(guān)察可為研究該基因在華木蓮自交不親和中的功能及如何發(fā)揮功能的提供依據(jù)，進(jìn)而為揭示華木蓮自交不親和機(jī)理提供數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

華木蓮栽植于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園中?；ㄆ谌∈诜酆? h 自花授粉心皮用液氮固定，后置于-80 ℃貯存，用于總RNA提取。瞬時(shí)表達(dá)供試材料為煙草品種K326，將種子用蒸餾水沖洗后，置于培養(yǎng)皿中室溫催芽1～2 d，后置于人工氣候箱培養(yǎng)，條件為光/暗時(shí)間為16 h/8 h，光/暗溫度為24 ℃/18 ℃，濕度為85%條件下培養(yǎng)，60 d后至5～6片真葉展露后用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)。

1.2 華木蓮S(chǎng)gSRK 基因克隆

TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 和PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自TAKARA公司，pGME-T Easy 載體購(gòu)自PROMEGA 公司，大腸桿菌DH5α購(gòu)自擎科生物公司。RNA提取和反轉(zhuǎn)錄參照試劑盒程序進(jìn)行。以?xún)龃嫘钠椴牧咸崛】俁NA，然后用Oligo dT和隨機(jī)6-mer引物為反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，SgSRK基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物為：Forward primer：5′-ATGGCTTTTCACATTTCATTCC-3′，Reverse primer：5′-CTATCGAGCTTCCAGCTCA-3′。反應(yīng)體系為25 μL，包括2×T5 Super PCR Mix for PAGE 12.5 μL，正向引物1 μL，反引物各1μL，模板1 μL，Nuclease-Free Water 9.5 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃3 min 變性，然后98 ℃30 s，59.8 ℃30 s，72 ℃50 s，共40 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃2 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，目的產(chǎn)物用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收。將回收產(chǎn)物連接到pGME-T Easy 載體上，然后通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，用PCR 擴(kuò)增挑取陽(yáng)性克隆，送擎科公司測(cè)序。

1.3 序列生信分析

為了明確克隆基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，測(cè)序后序列編碼蛋白氨基酸組成用BioXM 2.6 進(jìn)行了推測(cè)；利用Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）對(duì)編碼蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析，hmmer（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer）驗(yàn)證，用ExPASy（https://web.expasy.org/protscale/）對(duì)編碼蛋白疏水性進(jìn)行了預(yù)測(cè)，用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對(duì)編碼蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行了推斷，用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)編碼蛋白信號(hào)肽進(jìn)行了確認(rèn)。最后用Cell-PLoc 對(duì)編碼蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了預(yù)測(cè)。

1.4 進(jìn)化分析

為了探討SgSRK基因與已知物種SRK基因間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，基于SRK 同源蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索已報(bào)道的不同物種SRK蛋白序列，去除不完整序列，同一物種蛋白取最長(zhǎng)序列。所得到的序列然后用hmmer（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer）加以鑒定，最后使用IQ-TREE 軟件基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap 1 000 次，進(jìn)化樹(shù)用Evolview（https://www.evolgenius.info/evolview）展示。

1.5 表達(dá)載體構(gòu)建

表達(dá)載體pCAMBIA1302和NcoI酶、KpnI酶和SpeI酶購(gòu)自擎科生物公司，程序參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。對(duì)含有目的基因片段的DH5α 用LB 液體培養(yǎng)基（Tryptone 10g/L，Yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L）培養(yǎng)6 h后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。對(duì)含目的片段pGME-T Easy 克隆載體用NcoI 酶切，回收目的片段，同時(shí)對(duì)表達(dá)載體pCAMBIA1302 也用NcoI 酶切，在表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)NcoI-SpeI 處切開(kāi)，然后將目的基因片段與之相連。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增，然后提取質(zhì)粒對(duì)構(gòu)建好的重組載體用KpnI/SpeI酶切驗(yàn)證連接正確性。

1.6 SgSRK基因亞細(xì)胞定位

感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化參照唯地公司程序進(jìn)行。提取含有目的基因片段的表達(dá)載體質(zhì)粒后，通過(guò)熱激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101 中，于28 ℃下振蕩培養(yǎng)2～3 h，然后于含卡那霉素和潮霉素抗性的LB 固體培養(yǎng)基上28 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)2～3 d，對(duì)生長(zhǎng)出的克隆用PCR 進(jìn)一步驗(yàn)證。挑選出的陽(yáng)性克隆用含卡那霉素和潮霉素抗性的LB 液體培養(yǎng)基上28 ℃下振蕩培養(yǎng)，菌液OD600=1.0時(shí)，通過(guò)注射法侵染煙草葉片，黑暗條件下放置12 h后置于正常條件下生長(zhǎng)36 h，用Olympus熒光顯微鏡檢測(cè)，共檢測(cè)6個(gè)葉片，每個(gè)葉片3個(gè)視野。

2 結(jié)果與分析

2.1 SgSRK基因克隆及序列分析

根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組結(jié)果設(shè)計(jì)引物，利用RACE 方法，克隆到的基因片段共計(jì)2 463 bp，命名為SgSRK（GenBank登錄號(hào)：MW139903），編碼蛋白820個(gè)氨基酸，分子量92.218 ku，等電點(diǎn)7.15（圖1）。

2.2 SgSRK結(jié)構(gòu)分析

SgSRK 結(jié)構(gòu)分析如圖2 所示。Pfam 分析表明，SgSRK 含有4 個(gè)結(jié)構(gòu)域：B_lectin（PF01453）、S_locus_glycop（PF00954）、PAN-2（PF08276）、Pkinase Tyr（PF07714）（圖2a）。B_lectin結(jié)構(gòu)域位于73～174 aa處，主要功能可能為結(jié)合單糖，結(jié)合D-甘露糖凝集素。S_locus_glycop結(jié)構(gòu)域，即S 位點(diǎn)糖蛋白結(jié)構(gòu)域，位于206～315 aa處。十字花科植物中，S位點(diǎn)糖蛋白及S位點(diǎn)受體激酶與多個(gè)S等位基因相互連鎖在一起，構(gòu)成S位點(diǎn)。PAN-2結(jié)構(gòu)域位于336～402 aa處，包含3個(gè)二硫鍵的保守核心，是觸發(fā)蛋白互作的關(guān)鍵。Pkinase Tyr結(jié)構(gòu)域位于505～774 aa 處，催化特異酪氨酸磷酸化反應(yīng)。酪氨酸激酶是一種能將磷酸基團(tuán)從ATP 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞蛋白的酶，導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，在許多細(xì)胞功能中，充當(dāng)開(kāi)關(guān)功能。ExPASy ProtScale 分析表明，編碼蛋白存在疏水區(qū)（圖2b），TMHMM 分析支持上述結(jié)果，蛋白跨膜區(qū)域位于430～452 aa 處（圖2c）。SignalP-5.0 分析表明，編碼蛋白存在一個(gè)信號(hào)肽，切點(diǎn)在23～24 aa 處（圖2d）。Cell-PLoc 2.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析表明，其定位于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中。

圖2 SgSRK結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Structure analysis of SgSRK

上述分析表明，SgSRK 具有胞外域，跨膜域、激酶域，存在信號(hào)肽，具有磷酸化功能，是一個(gè)跨膜蛋白，與孢子體自交不親和雌性決定因子SRK結(jié)構(gòu)特征一致。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI 上搜索已報(bào)道存在自交不親和物種SRK 蛋白，加上SgSRK，最終得到18 個(gè)序列。經(jīng)過(guò)hmmer鑒定，所有序列不僅存在4個(gè)共同結(jié)構(gòu)域：B_lectin、S_locus_glycop、PAN_2、Pkinase Tyr，而且順序也一致。利用這18 個(gè)物種SRK 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，最佳模型為JTTDCMut+F+I+G4，構(gòu)建的發(fā)育樹(shù)如圖3 所示。根據(jù)系統(tǒng)樹(shù)，基部類(lèi)群、木蘭分支、單子葉植物、真雙子葉植物類(lèi)群各自然分開(kāi)。基部類(lèi)群無(wú)油樟（Amborella trichopoda）在最外側(cè)，其次是木蘭類(lèi)華木蓮，接著是單子葉植物菠蘿（Ananas comosus）。在真雙子葉植物中，所有十字花科SRK聚為一支，同屬物種聚在一起。木蘭分支的華木蓮S(chǎng)gSRK與基部類(lèi)群無(wú)油樟SRK距離較近，處于單子葉和真雙子葉植物外，距離真雙子葉超薔薇類(lèi)頂端的十字花科SRK較遠(yuǎn)。雖然是基因樹(shù)，但SRK基因樹(shù)大致與物種進(jìn)化地位相應(yīng)。

圖3 SRK系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of SRK

2.4 華木蓮S(chǎng)gSRK基因的表達(dá)載體構(gòu)建

構(gòu)建的表達(dá)重組載體如圖4a 所示。表達(dá)載體pCAMBIA1302 具有35S 強(qiáng)啟動(dòng)子和GFP 熒光蛋白基因，并攜帶卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因。從克隆載體回收的SgSRK基因，連接在表達(dá)載體的NcoI-SpeI 多克隆位點(diǎn)。重組載體構(gòu)建后，插入位點(diǎn)處酶切識(shí)別位點(diǎn)變化，不能從插入點(diǎn)通過(guò)酶切回收SgSRK基因，但可通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得。對(duì)構(gòu)建好的載體用KpnI/SpeI 進(jìn)行酶切。圖譜中質(zhì)粒有開(kāi)環(huán)和閉環(huán)兩種形式，呈現(xiàn)兩條帶（圖4b）。用于侵染的農(nóng)桿菌菌株搖菌后進(jìn)行PCR 驗(yàn)證（圖4c），以保證含有目的基因片段。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，載體構(gòu)建成功。

圖4 a：含SgSRK的重組表達(dá)載體；b：重組表達(dá)載體酶切驗(yàn)證；c：重組表達(dá)載體PCR驗(yàn)證Fig.4 a：Recombinant expression vector containing SgSRK；b：Validation of recombinant expression vector by restriction enzyme digestion；c：Validation of recombinant expression vector by PCR

2.5 SgSRK基因的瞬時(shí)表達(dá)和亞細(xì)胞定位

為了驗(yàn)證GFP 蛋白和目的基因在煙草中表達(dá)情況，使用熒光顯微鏡觀(guān)察了含目的基因的農(nóng)桿菌浸染的煙草葉片。熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果如圖5所示。對(duì)煙草葉片直接注射含目的基因的農(nóng)桿菌，36 h后葉肉細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜處呈現(xiàn)較強(qiáng)熒光，表明外源基因可以在煙草中正常表達(dá)，SgSRK基因得到成功表達(dá)。對(duì)基因表達(dá)情況進(jìn)行進(jìn)一步觀(guān)察，可以發(fā)現(xiàn)綠色熒光在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均有分布，但細(xì)胞膜上信號(hào)明顯較強(qiáng)，表明SgSRK定位于細(xì)胞質(zhì)中和細(xì)胞膜上，但細(xì)胞膜上更多，與生信分析結(jié)果相符。

圖5 SgSRK的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of SgSRK

3 討論與結(jié)論

借助轉(zhuǎn)錄組生信分析，本研究從華木蓮中克隆出了SgSRK基因，其編碼820 個(gè)氨基酸。編碼蛋白具有B_lectin、S_locus_glycop、PAN-2、Pkinase Tyr等4 個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，存在一個(gè)信號(hào)肽，有跨膜結(jié)構(gòu)域，為跨膜蛋白，具備磷酸化功能。共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察證實(shí)該基因蛋白產(chǎn)物定位在細(xì)胞質(zhì)中和細(xì)胞膜上，因此SgSRK具有典型SRK特征。

SRK基因在遲發(fā)性自交不親和中的作用是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。從自交不親和特征來(lái)看，孢子體不親和與遲發(fā)性自交不親和是兩類(lèi)截然不同的類(lèi)型，孢子體不親和反應(yīng)表現(xiàn)為自花花粉不萌發(fā)或萌發(fā)但不能進(jìn)入柱頭，遲發(fā)性自交不親和則是自花花管粉可以穿過(guò)珠孔或完成受精，但仍然表現(xiàn)自交不親和[5-6]，這說(shuō)明這兩類(lèi)自交不親和的遺傳機(jī)制有所不同。到目前為止，許多植物具有孢子體自交不親和特性，但在分子水平深入研究局限于十字花科中，SRK基因?yàn)殒咦芋w自交不親和的雌性決定基因[6]。SRK定于于柱頭乳突細(xì)胞表面，為柱頭乳突細(xì)胞分泌的一種多態(tài)性Ser/Thr 受體激酶。當(dāng)自花花粉與柱頭接觸時(shí)，花粉中的SP11/SCR 與SRK 發(fā)生反應(yīng)，使SRK 構(gòu)象發(fā)生變化，磷酸化下游因子[2,8]，啟動(dòng)自交不親和反應(yīng)。因此，自花花粉并不能萌發(fā)形成花粉管或形成花粉管不能進(jìn)入花柱[2]。相對(duì)于配子體自交不親和和孢子體不親和，遲發(fā)性自交不親和研究較為落后，遺傳機(jī)制尚不清楚。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是在許多表現(xiàn)遲發(fā)性自交不親和的植物中發(fā)現(xiàn)了SRK基因。表現(xiàn)遲發(fā)性自交不親和特征茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組研究中也發(fā)現(xiàn)存在SRK基因[10-11]，同樣，在華木蓮中也發(fā)現(xiàn)了SRK同源基因SgSRK。這自然就會(huì)引發(fā)一個(gè)問(wèn)題，這些SRK同源基因在遲發(fā)性自交不親和中會(huì)起作用嗎？

現(xiàn)在有一點(diǎn)非常明確，這些基因也與SRK在孢子體自交不親和中的作用不同，因?yàn)橹辽偎⑽醋柚够ǚ勖劝l(fā)，因此，這些SRK同源基因很可能在遲發(fā)性自交不親和不起作用或作用不同。在孢子體不親和植物中，一個(gè)S位點(diǎn)包含2個(gè)相互連鎖的雌性決定基因SRK和花粉決定基因SCR，如果連鎖被打破，則會(huì)發(fā)生自交不親和向自交親和的轉(zhuǎn)換。目前遲發(fā)性自交和植物中尚未發(fā)現(xiàn)與孢子體自交不親和花粉決定因子SCR同源的基因，這也許可以作為SRK同源基因在遲發(fā)性自交不親和反應(yīng)中不參與或作用不同的一種解釋。如果這些基因在遲發(fā)性自交不親和中起作用，它的功能是什么？在何時(shí)起作用？如果起作用的話(huà)，它們?cè)谶t發(fā)性自交不親和中可能不是決定基因，應(yīng)該還有其它基因參與自交不親和反應(yīng)。

即使SRK同源基因不參與遲發(fā)性自交不親和反應(yīng)，它們的作用也值得探討，因?yàn)檫@些SRK同源基因是目前在遲發(fā)性自交不親和研究中唯一一類(lèi)與已知自交不親和基因高度同源的基因，也可能成為研究遲發(fā)性自交不親和的切入點(diǎn)。不同物種SRK 比較表明，這些基因具有保守的結(jié)構(gòu)域。這些物種涉及被子植物基部類(lèi)群的無(wú)油樟，也有單子葉植物菠蘿，也有多種真雙子葉植物，這些植物在進(jìn)化上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，SRK同源基因的保守性說(shuō)明它們受到了強(qiáng)烈的自然選擇作用。雖然同源基因功能不一定相同，但從另一方面說(shuō)明這些基因的功能應(yīng)該比較重要，所以才受到選擇作用。

基因過(guò)表達(dá)是驗(yàn)證基因功能的主要手段之一，克隆目的基因和構(gòu)建表達(dá)載體是必須的前提。通過(guò)基因瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)觀(guān)察基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位可以給基因的初步作用提供指引。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SgSRK 具有典型SRK 結(jié)構(gòu)域，它具有信號(hào)肽，跨膜區(qū)，是一個(gè)可以接受胞外信號(hào)的跨膜蛋白。激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察結(jié)果表明，它定于于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持SgSRK與SRK相似，但最終華木蓮S(chǎng)gSRK基因在自交不親和中的作用需要進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因證實(shí)。

SgSRK基因具有SRK基因典型特征。

致謝：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院王義華教授，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院邊建民教授，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院羅時(shí)文教授，南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳麗敏博士，中國(guó)林科院林研所張冰玉研究員對(duì)研究給予了幫助，謹(jǐn)致謝意！