孫菲陽

（深圳北理莫斯科大學(xué)，廣東 深圳 518172）

近年來，蠑螈肢體再生機制研究是再生醫(yī)學(xué)研究的熱點，人們發(fā)現(xiàn)了大量生物分子參與肢體再生過程。隨著基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進步，發(fā)現(xiàn)了大量與肢體再生相關(guān)的基因，闡明這些基因在肢體再生過程中的作用，將是肢體再生研究的重點。

信號接頭蛋白C-crk 參與了受體整合蛋白和酪氨酸激酶等多種分子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在人體組織中不表達或少量表達，而在乳腺癌等惡性膠質(zhì)瘤中的C-crk 在mRNA 與蛋白質(zhì)水平均是高表達。然而目前對蠑螈C-crk 基因的研究十分匱乏，因此本研究擬對東方蠑螈C-crk 基因的基本生物學(xué)信息進行分析，為其在生物學(xué)等方面的功能提供理論依據(jù)。

1 文獻綜述

隨著現(xiàn)代科學(xué)的進步，人類在應(yīng)對受傷的肢體中，從依賴假肢到嘗試新方法使肢體再生，并在此基礎(chǔ)上開拓了更專業(yè)的研究領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物的肢體無法持續(xù)再生主要是因為在進化過程中已演變出優(yōu)秀的人體免疫系統(tǒng)和愈合機制，細(xì)胞的再生與傷口愈合中都處于相互抵制狀態(tài)，但蠑螈卻具備強大的肢體再生能力。因此，深入地研究蠑螈肢體再生的作用機理，可為人類在再生醫(yī)學(xué)方面指點迷津，使斷肢再生成為可能。

C-crk 基因在癌細(xì)胞中過度表達，與癌癥進展密切相關(guān)。但C-crk 基因在肢體再生中是否存在重要作用仍然未知，阻礙了研究。因此，本文擬對東方蠑螈C-crk基因的基本生物學(xué)信息進行分析，為蠑螈C-crk 基因的進一步研究提供依據(jù)。

1.1 東方蠑螈概述

東方蠑螈 (Cynops orientalis)，也稱中國火龍，是國家級珍稀保護動物，屬于兩棲綱，蠑螈屬[1]。主要分布在我國的江蘇、浙江、湖北等省份，背部與兩側(cè)分別呈現(xiàn)淡黑色，腹部則為橙紅色，是有尾的兩棲類脊椎動物[2]。

蠑螈肢體再生研究進展：德國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在蠑螈體內(nèi)有一種特殊酶能夠促進蠑螈肢體再生，科學(xué)家猜想，通過人為的合成這種酶，或許可幫助肢體傷殘及器官受傷的病人實現(xiàn)再生[3]。蠑螈的肢體結(jié)構(gòu)與人類肢體非常相似，因此闡明蠑螈肢體再生的細(xì)胞機制對人類肢體再生具有重要意義。

目前研究揭示，在蠑螈斷肢前從肢體肘部游離肢體神經(jīng)，結(jié)果斷肢后其肢體不能再生，這是由于阻止了傷口表皮與肢體神經(jīng)的正常相互作用，從而導(dǎo)致肢體再生失敗，也表明肢體神經(jīng)對蠑螈肢體成功再生至關(guān)重要[4]。另外一些研究也揭示，在斷肢后人為、機械的去除愈合的傷口表皮，則肢體再生失敗，可見傷口表皮對蠑螈肢體成功再生十分重要[5]。

1.2 C-crk 基因的概述

C-crk 是具有多功能的信號傳導(dǎo)接頭蛋白，是原癌基因 C-crk 編碼的產(chǎn)物[6]，crk 蛋白通過mRNA 的選擇性剪接，產(chǎn)生從結(jié)構(gòu)上劃分的兩種蛋白質(zhì):v-crk 和 crk i；crkii 和crkl,高度同源的SH2 和SH3 結(jié)構(gòu)域幾乎可以構(gòu)成所有的C-crk 蛋白[7]。在信號分子傳遞的過程中，C-crk 蛋白本身并不具備酶活性，一般可與上下游的信號分子作用的是SH2、SH3 結(jié)構(gòu)域，進行有序且特異性地信號傳導(dǎo)，參加腫瘤細(xì)胞的吸附、侵襲和增殖等信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。

C-crk 基因在癌癥中的研究進展：C-crk 廣泛參與腫瘤細(xì)胞的遷移、生長、凋亡等。正常情況下，C-crk在人體中不表達或少量表達。而在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等惡性的膠質(zhì)瘤中C-crk 在mRNA 與蛋白質(zhì)水平均是高表達[9]。

馮潤華等通過檢測368例胃癌患者癌組織中的C-crk表達水平發(fā)現(xiàn)，C-crk 在胃癌組織中表達明顯升高[10]。此外，李建芳等通過生物信息分析及熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)miR-126 特異性靶向調(diào)控C-crk 表達參與胃癌的進展[11]。

朱進等研究發(fā)現(xiàn)，C-crk 蛋白在患者乳腺癌組織中表達程度明顯高于良性乳腺瘤組織[12]。李敏等發(fā)現(xiàn)miR-126 可通過超聲微泡介導(dǎo)來調(diào)節(jié)C-crk 表達抑制乳腺癌細(xì)胞生長，為乳腺癌的治療提供了新的措施[13]。李文燕等研究發(fā)現(xiàn)C-crk 在卵巢癌細(xì)胞高表達可能直接促進卵巢癌細(xì)胞的惡性增殖[14]。

2 實驗部分

基于前期的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，獲得了東方蠑螈Ccrk(coC-crk)的完整CDS 區(qū)cDNA 序列，本實驗擬對coC-crk 基因的核酸序列、編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)等進行分析。

2.1 實驗工具

如表1 所示。

表1 軟件的名稱及功能

2.2 實驗方法

1.基于前期轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果，獲得coC-crk 基因的cDNA 序列。

2.coC-crk 基因的氨基酸序列及核苷酸序列分析：

打開DNAman 軟件，選擇“File”“new”，將cDNA 序列導(dǎo)入，點擊“Sequence”“l(fā)oad sequece”，選擇“From Selection”然后點擊“protein”，選擇“transl ation”，點擊選項“Frame1”。

3.coC-crk 基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析:

進入NCBI 網(wǎng)頁，選擇“Domains &Structures”，點擊“Conserved Domain Database (CDD)”，選擇“CD Search”。

4.coC-crk 基因編碼的氨基酸序列的基本理化性質(zhì)分析：

打開 Protparam 網(wǎng)站，將氨基酸序列導(dǎo)入，選擇“Compute parameters”。

5.分析預(yù)測coC-crk 蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)：

打開SOPMA 網(wǎng)站，從Secondary structure prediction項目欄中選擇“SOPMA”，點擊“SUBMIT”。

打開Swiss-Model 網(wǎng)站，點擊“Start Modelling”，將氨基酸序列導(dǎo)入，點擊“Search For Templates”“Build Models”。

6.獲得不同物種C-crk 蛋白質(zhì)的氨基酸序列：

打開NCBI 網(wǎng)站，選擇“Protein”，輸入C-crk、Search，點擊FASTA，選擇“Send to”，勾選“Show GI”，點擊“Create file”，下載不同物種的氨基酸序列。

7.coC-crk 蛋白與其他物種C-crk 蛋白質(zhì)氨基酸序列比對分析：

打開DNAman 軟件，選擇“Sequence”“Alignment”，選擇“Multiple Sequence Alignment”，點擊“File”，選擇“Full Alignment”“Input”點擊“NO”，選擇“Run in background”和“show progress”，點擊“下一步”，選擇默認(rèn)數(shù)值，完成操作。

3 實驗結(jié)果

3.1 coC-crk 基因序列分析

通過DNAman 軟件分析發(fā)現(xiàn)，coC-crk 完整CDS區(qū)基因大小為567 bp，編碼188 個氨基酸。

3.2 coC-crk 結(jié)構(gòu)域分析

使用NCBI Conserved Domain 在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)coC-crk 包含兩個結(jié)構(gòu)域，分別是SH2 結(jié)構(gòu)域（5-107氨基酸）和SH3 結(jié)構(gòu)域（119-173 氨基酸）。

3.3 coC-crk 的理化性質(zhì)分析

通過Protparam 分析發(fā)現(xiàn)，coC-crk 的分子量為215 09.99 Da，等電點為5.16。

3.4 coC-crk 二級及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

分析發(fā)現(xiàn)，coC-crk 的β-折疊占6.38%，延伸鏈占19.68%，α-螺旋占 18.62%，55.32%為無規(guī)則卷曲。以2eyy.1A（同原性為81.72%）為模板，對coC-crk 進行同源建模，PyMOL Viewer 顯示coC-crk 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 東方蠑螈C-crk 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3.5 coC-crk 氨基酸序列比對

利用NCBI 下載不同物種的C-crk 序列，通過DNA man 軟件進行多序列比對。發(fā)現(xiàn)除Lepeophtheirus_salmonis 和Mytilus_coruscus 外，其余物種C-crk 的SH2結(jié)構(gòu)域氨基酸序列高度保守，本次所選物種的c-crk 蛋白質(zhì)序列SH3 結(jié)構(gòu)域高度保守。

4 結(jié)論

C-crk 是細(xì)胞信號傳導(dǎo)的重要基因，研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中C-crk 的mRNA 及其蛋白表達程度很高，表明其與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)。本研究基于前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果獲得coC-crk 基因的CDS 區(qū)cDNA 序列，通過生物信息學(xué)軟件對其分析。

本研究采用多種軟件對coC-crk 基因CDS 區(qū)核酸序列、編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)、多序列比對進行分析，闡明了coC-crk 基因的基本生物學(xué)信息，為其生物學(xué)功能研究提供理論依據(jù)。