王祖華，劉 萍，楊瑞先，陳華軍

(洛陽理工學(xué)院環(huán)境工程與化學(xué)學(xué)院，洛陽 471023)

0 引 言

腐敗菌和致病菌廣泛存在于人們的日常生活中，它嚴(yán)重影響著人類的健康，為了防治有害微生物，人類研究出各種各樣的抗菌劑。隨著抗性菌株和超級細(xì)菌的出現(xiàn)，人類面臨的健康安全問題更加嚴(yán)峻。因此，制備出廣譜、高效、生物安全且無耐藥性的抗菌劑非常重要。

殼聚糖是一種天然高分子化合物，是天然生物抑菌劑的典型代表。它由甲殼素脫乙?；茫哂谢钚园被土u基，因此殼聚糖具有可降解性、生物相容性、成膜性和安全無毒等良好的生物學(xué)特性[1-3]，已應(yīng)用在美容[4-6]、醫(yī)藥、食品、紡織等多領(lǐng)域中[7-11]。但由于其抑菌有效時(shí)間不長，耐熱性不足，導(dǎo)致其應(yīng)用范圍受到了極大限制。而在有機(jī)材料殼聚糖中引入具有抑菌作用的金屬離子可彌補(bǔ)其耐熱性能不足和易洗脫的缺陷[12]。銀離子作為抗菌金屬離子具有廣譜抗菌性，殺菌效果好，且不易使微生物產(chǎn)生抗藥性。當(dāng)銀離子從抗菌劑中釋放后，它可以迅速與菌株蛋白酶上的巰基結(jié)合，使蛋白酶失活從而起到殺菌作用[13]，且銀離子不會對活的哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響[14]。但是由于銀離子易遷移至皮膚造成重金屬中毒，通常不能單獨(dú)使用，利用它與其他材料結(jié)合、固載，從而發(fā)揮其抑菌作用，蔡波等[15]通過自由基接枝共聚法制備出改性殼聚糖，后經(jīng)原位法合成殼聚糖基納米銀復(fù)合材料，該材料的抑菌性能良好。安靜等[16]采用微波輻射法和香草醛還原，制備載銀殼聚糖接枝香草醛復(fù)合膠乳，在紫外光下對大腸桿菌和枯草桿菌的抗菌效果要優(yōu)于可見光下的抗菌效果。可見，利用殼聚糖和銀離子所具有的不同特性，將銀與殼聚糖結(jié)合，既能增強(qiáng)殼聚糖的穩(wěn)定性，二者又能協(xié)同抑菌，提高復(fù)合材料的抑菌效果，這種復(fù)合抑菌劑逐漸引起了人們的重視，現(xiàn)已被用于各種不同的材料中，如醫(yī)用敷料、涂布液等[17-19]。然而，采用綠色化學(xué)工藝制備載銀殼聚糖，鮮有報(bào)道。

本研究通過綠色吸附法制備載銀殼聚糖，采用X射線衍射(XRD)、場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)和熱重分析(TG)分析其微觀結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為試驗(yàn)指示菌種，測定最大銀含量的載銀殼聚糖的抗菌性能，并確定其最小抑菌濃度(MIC)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

殼聚糖(純度99.99%)、硝酸銀(純度99.99%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。硫氰酸銨(NH4SCN，純度99.99%)、十二水硫酸亞鐵銨[NH4Fe(SO4)2，純度99.99%]購自天津科邦化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。指示菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli[ATCC 25922])，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus[ATCC 25923])

1.2 吸附等溫線和動力學(xué)研究

將準(zhǔn)確稱取的1.500 0 g殼聚糖放于錐形瓶中，并加入50 mL已知濃度的pH=7的硝酸銀水溶液。當(dāng)吸附溫度為298 K時(shí)，硝酸銀水溶液的濃度會隨吸附時(shí)間發(fā)生變化。混合物在25 ℃，150 r/min條件下振蕩約300 min，離心分離殼聚糖，以硫酸鐵銨為指示劑，用佛爾哈德法測定濾液中硝酸銀的濃度，用公式(1)計(jì)算殼聚糖的吸附容量。

(1)

式中：qe為平衡吸附量(mg/g)；c0為硝酸銀的初濃度(mg/L)；ce為硝酸銀的平衡濃度(mg/L)；V為硝酸銀溶液的體積(L)；m為殼聚糖的質(zhì)量(g)。相同條件下重復(fù)所有實(shí)驗(yàn)并計(jì)算平均值。通過硝酸銀溶液初始濃度的變化研究其對殼聚糖吸附容量的影響和達(dá)到吸附平衡時(shí)所需要的時(shí)間，并且研究硝酸銀對殼聚糖的吸附動力學(xué)。

1.3 載銀殼聚糖材料表征

采用X射線衍射儀(D8 Focus型X射線衍射儀，德國布魯克公司，掃描步長0.02°，掃描范圍2θ=10°～70°，持續(xù)時(shí)間0.5 s)和熱重分析儀(日本津島DTG-60H)測定載銀殼聚糖的組分與熱重，并運(yùn)用EVA軟件(布魯克公司)中的國際衍射數(shù)據(jù)中心(ICDD)分析所獲得的衍射圖譜。用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM，Sigma HD 德國蔡司)觀測載銀殼聚糖的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 抗菌活性試驗(yàn)

用革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)對吸附量最大的載銀殼聚糖進(jìn)行抗菌活性評價(jià)。最小抑菌濃度(MIC)的測定采用液體稀釋法。在培養(yǎng)基中加入載銀殼聚糖，使其濃度分別為50 μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL、80 μg/mL，在另外的培養(yǎng)基中加入殼聚糖，使其濃度為110 μg/mL，倒平板前使其均勻分散，以未添加二者的平板為空白對照。將指示菌株過夜培養(yǎng)，并稀釋為10-5、10-6、10-7，分別取100 μL稀釋菌液涂平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。不同稀釋度下不同樣品重復(fù)三次。對培養(yǎng)后的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算抑菌率C。

C=(A-B)/A×100%

(2)

式中：A為對照菌落數(shù)；B為樣品菌落數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 X射線衍射分析

有研究表明殼聚糖的晶體形態(tài)有兩種，分別為Form Ⅰ(2θ≈10°)和Form Ⅱ(2θ≈20°)[20]。通過載銀殼聚糖和殼聚糖的XRD圖譜(見圖1)可以看出在2θ=20.15°中出現(xiàn)的衍射峰對應(yīng)的是晶體形態(tài)Ⅱ。殼聚糖分子間和分子內(nèi)的氫鍵以及空間結(jié)構(gòu)的規(guī)整性都有利于結(jié)晶性的增加，而銀離子的引入使殼聚糖在20.15°衍射峰的相對強(qiáng)度明顯減弱，減弱的原因在于殼聚糖中氨基基團(tuán)與銀配位后，使分子內(nèi)結(jié)晶區(qū)減少從而降低了殼聚糖的結(jié)晶度[20]。

圖1 殼聚糖和載銀殼聚糖的XRD圖譜Fig.1 XRD patterns of chitosan and Ag-chitosan

2.2 FESEM分析

分別用場掃描電鏡(FESEM)和能量抑制能譜儀(EDS)對殼聚糖和載銀殼聚糖的微觀形貌和化學(xué)成分進(jìn)行分析。殼聚糖吸附銀離子后，殼聚糖的顆粒形貌并沒有發(fā)生變化(見圖2(a)、2(b))。EDS能譜儀分析表明，殼聚糖所吸附的銀離子在殼聚糖分子中的分布并非對稱均勻的。殼聚糖的外部元素組成包括碳、氮、氫、氧(見圖2(c))，載銀殼聚糖的外部元素由碳、氮、氫、氧和銀組成(見圖2(d))。通過對EDS的點(diǎn)分析(見圖3)進(jìn)一步驗(yàn)證了載銀殼聚糖的外部元素組成，包括碳、氮、氫、氧和銀。此外，由表1可以看出載銀殼聚糖的化學(xué)元素(碳、氮、氫、氧)成分比例與殼聚糖一致，說明載銀殼聚糖的制備并不改變殼聚糖本身的生物性能及其他理化性質(zhì)。

圖2 殼聚糖和殼聚糖的FESEM照片和EDS分析。(a)殼聚糖的FESEM照片;(b)載銀殼聚糖的FESEM照片;(c)殼聚糖的EDS表面分析;(d)載銀殼聚糖的EDS表面分析Fig.2 FESEM images and EDS analysis of chitosan and Ag-chitosan.(a)FESEM image of chitosan;(b)FESEM image of Ag-chitosan;(c)EDS surface analysis of chitosan;(d)EDS surface analysis of Ag-chitosan

圖3 載銀殼聚糖的EDS譜圖Fig.3 EDS spectrum of Ag-chitosan

表1 載銀殼聚糖與殼聚糖中各元素的含量Table 1 Concentration for elements in Ag-chitosan and chitosan

2.3 TG-DTA分析

通過載銀殼聚糖和殼聚糖的TG-DTA曲線(見圖4)可以看出，載銀殼聚糖的熱降解溫度稍高于殼聚糖。將取代基引入多糖結(jié)構(gòu)會一定程度地破壞殼聚糖的晶體結(jié)構(gòu)，在熱降解范圍內(nèi)載銀殼聚糖的TG曲線中出現(xiàn)了快速失重過程。這表明銀離子與分子內(nèi)的氧或氮配位后使載銀殼聚糖的熱性能更穩(wěn)定，從而使載銀殼聚糖相對于殼聚糖的熱穩(wěn)定性有一定的提高。

圖4 殼聚糖和載銀殼聚糖的TG曲線Fig.4 TG curves of chitosan and Ag-chitosan

2.4 等溫線和吸附機(jī)理分析

通過調(diào)整硝酸銀的濃度，研究其初始濃度對殼聚糖吸附性能的影響。將殼聚糖(30 g/L)和硝酸銀(其濃度范圍在6～26 g/L)混合均勻，25 ℃、150 r/min振蕩約300 min，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出：硝酸銀初始濃度為6 g/L到18 g/L時(shí)，在達(dá)到平衡時(shí)硝酸銀的吸附量增加較為明顯；當(dāng)硝酸銀初始濃度大于18 g/L時(shí)吸附量的增加較為緩慢。

圖5 硝酸銀濃度對吸附量和硝酸銀殘留濃度的影響Fig.5 Influence of silver nitrate concentration on adsorption quantity and residual concentration of silver nitrate

用于吸附系統(tǒng)的平衡建模模型：Langmuir模型(3)和Dubinin-Radushkevich模型(4)。

(3)

(4)

式中：qe為平衡吸附量(mg/g)；ce為平衡濃度(mL/L)；qm為飽和吸附量(mg/g)；b為吸附常數(shù)；R為氣體常數(shù)(8.314 kJ/mol·K)；T為溫度(K)；BD為每摩爾硝酸銀吸附到殼聚糖表面所需最大的吸附能。公式(4)的線性形式如下：

(5)

(6)

Langmuir模型的吸附等溫線如圖6(a)所示，結(jié)果表明殼聚糖對硝酸銀的吸附等溫線與Langmuir方程相一致，說明殼聚糖對硝酸銀的吸附原理為單層吸附。由公式(3)可得，其飽和吸附量為469.48 mg/g，表明殼聚糖容易吸附硝酸銀，比蔣衛(wèi)娟等[21]研究的載銀殼聚糖微球中256 mg/g的銀含量高出近1倍。在圖6(b)中殼聚糖對硝酸銀的吸附等溫線也與Dubinin-Radushkevich模型的線性圖相一致，E被估計(jì)為16.61 kJ/mol，說明殼聚糖對硝酸銀的吸附為化學(xué)吸附。根據(jù)公式(5)可知其飽和吸附量為478.09 mg/g，含銀量為32.34%，與公式(3)的計(jì)算結(jié)果較一致。吸附機(jī)理如圖7所示。

圖6 殼聚糖吸附銀離子的(a)Langmuir和(b)Dubinin-Radushkevich模型Fig.6 (a)Langmuir and (b)Dubinin-Radushkevich adsorption isotherms of Ag-chitosan

圖7 殼聚糖對硝酸銀的吸附機(jī)理Fig.7 Adsorption mechanisms of silver nitrate on chitosan

2.5 吸附動力學(xué)分析

當(dāng)硝酸銀濃度為12 000 mg/L，殼聚糖的含量為1.500 0 g/L時(shí)，殼聚糖吸附銀離子的量隨時(shí)間的不同而變化，其結(jié)果如圖8所示。由圖可以看出，在開始100 min內(nèi)處于快速吸附階段，之后吸附速率逐漸趨于平緩。

圖8 吸附時(shí)間對殼聚糖銀離子吸附量和硝酸銀殘留濃度的影響Fig.8 Influence of adsorption time on adsorption quantity of Ag+ ions on chitosan and residual concentration of silver nitrate

本文采用了顆粒內(nèi)擴(kuò)散方程(7)、準(zhǔn)一級吸附動力學(xué)方程(8)、準(zhǔn)二級吸附動力學(xué)方程(9)、修正偽一級動力學(xué)方程(10)、二級動力學(xué)方程(11)和二階反應(yīng)模型方程(12)來描述吸附過程。

qt=k·t0.5

(7)

ln(qm-qt)=lnqm-k1t

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

由圖9可以看出，殼聚糖吸附硝酸銀的動力學(xué)過程與準(zhǔn)二級吸附過程密切相關(guān)。準(zhǔn)二級吸附動力學(xué)模型是基于吸附速率受化學(xué)吸附控制的假設(shè)。通過動力學(xué)分析，表明化學(xué)吸附控制吸附過程，并與Dubinin-Radushkevich模型的分析結(jié)論一致。

圖9 殼聚糖對硝酸銀的吸附動力學(xué)。(a)顆粒內(nèi)擴(kuò)散方程;(b)準(zhǔn)一級吸附動力學(xué)方程;(c)準(zhǔn)二級吸附動力學(xué)方程;(d)修正偽一級動力學(xué)方程；(e)二級動力學(xué)方程;(f)二階反應(yīng)模型方程Fig.9 Adsorption kinetic of silver nitrate by chitosan.(a)Intraparticle diffusion equation;(b)pseudo-first-order rate constant of adsorption equation;(c)pseudo-second-order kinetics equation;(d)modified pseudo-first-order equation; (e)second-order kinetics equation;(f)second-order reaction model equation

2.6 抗菌活性分析

大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是最常見的導(dǎo)致院內(nèi)感染和術(shù)后傷口感染的生物。抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，載銀殼聚糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用。通過圖10可以看出添加殼聚糖的培養(yǎng)基中細(xì)菌菌落的數(shù)量明顯減少(見圖10(b)、(e))。對照組的大腸桿菌和黃金葡萄球菌初始數(shù)量濃度分別為5.68×107cfu/mL(見圖10(a))和6.50×107cfu/mL(見圖10(d))，而在添加載銀殼聚糖的培養(yǎng)基中細(xì)菌菌落數(shù)基本為零(見圖10(c)、圖10(f))。

圖10 殼聚糖、載銀殼聚糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性。(a)對大腸桿菌的空白對照;(b)殼聚糖對大腸桿菌的抗菌活性；(c)載銀殼聚糖對大腸桿菌的抗菌活性；(d)對金黃色葡萄球菌的空白對照;(e)殼聚糖對金黃色葡萄球菌的抗菌活性;(f)含載銀殼聚糖對金黃色葡萄球菌的抗菌活性Fig.10 Antibacterial activity of chitosan and Ag-chitosan against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. (a)Blank at Escherichia coli;(b)chitosan at Escherichia coli;(c)Ag-chitosan at Escherichia coli;(d)blank at Staphylococcus aureus;(e)chitosan at Staphylococcus aureus;(f)Ag-chitosan at Staphylococcus aureus

采用活細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定了殼聚糖和載銀殼聚糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性。由圖11可知，載銀殼聚糖添加量為50 μg/mL時(shí)對兩種菌的抑菌率達(dá)到了60%以上，當(dāng)添加量為80 μg/mL時(shí)其抑菌率均為99%以上，隨著載銀殼聚糖的含量的增加，對兩種菌的抑菌率也不斷上升，而殼聚糖添加量為110 μg/mL時(shí)其抑菌率只有40%左右，其抑菌率明顯低于載銀殼聚糖。由此表明，銀離子的加入極大地增強(qiáng)了殼聚糖的抑菌性，即載銀殼聚糖的抗菌性明顯優(yōu)于殼聚糖。此外，還可以看出載銀殼聚糖對兩種菌的抑制并沒有明顯的差異性，說明載銀殼聚糖抑制細(xì)菌并沒有選擇性，并且濃度為80 μg/mL時(shí)對兩種細(xì)菌的抑菌率均達(dá)到了99%以上，說明其最小抑菌濃度為80 μg/mL。與牛梅等[22]研究的載銀殼聚糖復(fù)合物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度相比降低4倍左右。

圖11 載銀殼聚糖和殼聚糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.11 Antibacterial effect of Ag-chitosan and chitosan against Escherichia coli and Staphylococcus aureus

在銀離子和殼聚糖結(jié)合的情況下，產(chǎn)生抑菌的機(jī)制有兩個(gè)方面：一是殼聚糖的抗菌活性是基于多陽離子(protonated氨基基團(tuán))與帶負(fù)電的細(xì)菌表面相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性喪失、細(xì)胞液滲漏，最終使細(xì)胞死亡[23-24]。另一方面，銀離子具有較強(qiáng)的抗菌性能，由于銀離子附著在細(xì)胞壁上，干擾了細(xì)胞壁的滲透性和細(xì)胞的呼吸作用[25-26]。

3 結(jié) 論

本研究以殼聚糖為載體用綠色的方法成功合成了銀含量為32.34%的載銀殼聚糖。由于銀離子的引入，破壞了殼聚糖的晶體結(jié)構(gòu)，提高了載銀殼聚糖的熱穩(wěn)定性和抗菌性質(zhì)。殼聚糖對硝酸銀的吸附等溫線符合Langmiur和Dubinin-Radushkevich方程，表明吸附機(jī)制是單層和化學(xué)吸附。在瓊脂平板內(nèi)殼聚糖表面銀離子的單層吸附有利于銀離子釋放，更易破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜。通過Langmiur方程計(jì)算qm的結(jié)果為478.09 mg/g，與運(yùn)用Dubinin-Radushkevich方程計(jì)算的結(jié)果相對一致，載銀殼聚糖中銀離子的最大含量為32.34%。其抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明隨著載銀殼聚糖的增加，對兩種菌的抑菌率也不斷上升，當(dāng)載銀殼聚糖含量達(dá)到80 μg/mL時(shí)其抑菌率達(dá)到99%以上，而對照純殼聚糖含量為110 μg/mL時(shí)其抑菌率只有40%左右，因此載銀殼聚糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌性能，其最小抑菌濃度80 μg/mL。