王小彬，種雪薇，劉 崗，耿煜然，劉富坤，于曉艷*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東 泰安271018；2.山東瀚林苑生態(tài)科技有限公司，山東 威海264500；3.泰安市城市管理局園林綠化處，山東 泰安271018；4.乳山市夏村鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，山東 威海264500)

冬青屬（Ilex）常綠樹種資源豐富，葉片四季常綠，樹型多姿優(yōu)美，果實(shí)艷麗光亮、經(jīng)冬不落，觀賞價(jià)值極高，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。目前，國(guó)外培育出的常綠冬青品種已達(dá)1000 余個(gè)，以綠籬、行道樹、景觀樹、模紋花壇、花境等多種方式廣泛應(yīng)用于道路、公園、庭院等園林綠地中[1]。但我國(guó)的常綠冬青引種栽培工作仍處于剛起步階段，且引種栽培地主要集中于江蘇及江蘇以南地區(qū)。冬季低溫是限制其繼續(xù)“北引”的關(guān)鍵因子。所以，建立科學(xué)的抗寒評(píng)價(jià)體系，從眾多的常綠冬青里篩選出可在北方高寒地區(qū)栽培的種或品種，對(duì)改善我國(guó)北方冬季園林景觀蕭條現(xiàn)狀具有重要意義。

近年來，常綠冬青的抗寒性評(píng)價(jià)引起了很多研究者的關(guān)注。曾雯等[2]、張紀(jì)林等[3]、崔鶯文等[4]、柴弋霞等[5]和胡曼筠等[6]已通過測(cè)定人工低溫處理的離體葉片生理生化指標(biāo)的方法對(duì)國(guó)內(nèi)外20 余種常綠冬青的抗寒性進(jìn)行了初步研究。但通過該方法只能得出供試冬青的相對(duì)抗寒性強(qiáng)弱順序，無(wú)法確定其田間實(shí)際抗寒表現(xiàn)。而且植物抗寒性由多個(gè)因素共同控制，生理生化指標(biāo)也易受環(huán)境和樣本影響而發(fā)生變化[7-8]。所以，要想更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)常綠冬青的抗寒性，還需要結(jié)合其它指標(biāo)進(jìn)行更全面的評(píng)價(jià)，并與田間實(shí)際抗寒表現(xiàn)進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證。

植物葉片對(duì)低溫脅迫極其敏感，可以通過改變組織結(jié)構(gòu)來適應(yīng)低溫環(huán)境。而且葉片組織結(jié)構(gòu)是生態(tài)環(huán)境和遺傳基因共同影響的結(jié)果，具有一定生態(tài)適應(yīng)性和穩(wěn)定性，因此可將其作為植物抗寒性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[9]。前人已經(jīng)就葉片組織結(jié)構(gòu)與抗寒性的關(guān)系開展了大量研究，發(fā)現(xiàn)柵海比、葉片組織緊密度等葉片組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)與植物抗寒性有極大相關(guān)性，但抗寒性評(píng)價(jià)的代表性指標(biāo)因植物種類不同而有較大差異[10-13]。到目前為止，尚未見常綠冬青葉片組織結(jié)構(gòu)與抗寒性關(guān)系的報(bào)道。

本研究以6 種常綠冬青為試材，調(diào)查其在山東泰安的田間凍害表現(xiàn)，并采用石蠟切片技術(shù)觀測(cè)11 項(xiàng)葉片組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)。以篩選出的葉片解剖結(jié)構(gòu)代表性指標(biāo)作為抗寒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，應(yīng)用隸屬函數(shù)法和聚類分析法對(duì)6 種冬青的抗寒性進(jìn)行評(píng)價(jià)和分類，并將抗寒性順序和分類結(jié)果與田間凍害調(diào)查結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。本研究從解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和田間凍害表現(xiàn)兩個(gè)層面對(duì)6 種常綠冬青開展抗寒性評(píng)價(jià)，可為常綠冬青屬植物抗寒性綜合評(píng)價(jià)及向北方高寒地區(qū)引種應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2019年4月初從南京引進(jìn)的6 種常綠冬青：‘陽(yáng)光’ 狹冠冬青 （Ilex × attenuata ‘Sunny Foster’）、‘米葉’冬青（Ilex crenata ‘Mariesii’）、‘史蒂芬’冬青（Ilex× ‘Nellie R.stevens’）、‘中國(guó)少女’冬青（Ilex sp.‘China Girl’）、‘博福德’冬青（Ilex corunta ‘burfordir’）、‘藍(lán)少女’冬青（Ilex merserae ‘Blue Girl’）。上述材料均為3年生扦插苗，每種60 株，定植于山東省泰安市岱岳區(qū)范鎮(zhèn)苗木基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間凍害調(diào)查

2020年12月—2021年4月，泰安地區(qū)最低氣溫為-18℃。2021年3月中旬，調(diào)查6 種冬青自然越冬后的葉片形態(tài)變化情況，并采用下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行凍害分級(jí)：1 級(jí)（抗寒性強(qiáng)）為冬季基本不受凍，僅葉片顏色稍變深，或少于20%的葉片受凍褐化，冬季觀賞價(jià)值與其他季節(jié)差異不大；2 級(jí)（抗寒性中等）為20%-50%葉片受凍褐化，冬季觀賞價(jià)值與其他季節(jié)相比明顯降低；3 級(jí)（抗寒性差）為50%以上葉片受凍褐化，冬季基本失去觀賞價(jià)值。每種冬青隨機(jī)選擇10 株長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，每株調(diào)查100 個(gè)葉片，計(jì)算受凍葉片百分?jǐn)?shù)，并拍照記錄越冬后受害情況。

1.2.3 葉片組織結(jié)構(gòu)觀測(cè)

2020年12月中旬，摘取6 種冬青無(wú)病害、長(zhǎng)勢(shì)良好且相對(duì)一致的一年生枝條上倒數(shù)第2—4 個(gè)葉片，每種6 片，F(xiàn)AA 固定液中固定48 h 后貯藏于70%酒精中備用。常規(guī)石蠟切片法制片，切片厚度5—8 μm，番紅-固綠染色，用Olympus BX51 顯微鏡檢片，并拍照。每種冬青觀察10 張切片，每張切片觀察3 個(gè)葉片橫切面視野和3 個(gè)主脈橫切面視野。用Digimizer 4.5.1 軟件測(cè)量葉片及其上下表皮、柵欄組織和海綿組織厚度，以及主脈木質(zhì)部和維管束面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2010 軟件和SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、相關(guān)性分析、差異顯著性檢驗(yàn)和聚類分析；運(yùn)用隸屬函數(shù)法計(jì)算6 種冬青抗寒性隸屬函數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間凍害表現(xiàn)

由表1 和圖1 可知，自然越冬后6 種冬青均有不同程度的凍害表現(xiàn)。其中，‘史蒂芬’冬青和‘中國(guó)少女’冬青沒有明顯凍害，只有4.9%和5.3%的葉片局部失綠變?yōu)楹稚^大多數(shù)葉片完好無(wú)損，冬季觀賞價(jià)值與其他季節(jié)差異不大，凍害級(jí)別為1 級(jí)，抗寒性強(qiáng)；‘博福德’冬青和‘陽(yáng)光’ 狹冠冬青有明顯凍害，30.4%和36.8%的葉片全部或局部失綠變?yōu)楹稚?，冬季觀賞價(jià)值與其他季節(jié)相比顯著降低，凍害級(jí)別為2 級(jí)，抗寒性中等；‘藍(lán)少女’冬青凍害嚴(yán)重，72.5%的葉片全部失綠變?yōu)楹稚?，‘米葉’冬青凍害更嚴(yán)重，86.3%的葉片全部失綠變?yōu)辄S色并干枯，冬季基本失去觀賞價(jià)值，凍害級(jí)別為3 級(jí)，抗寒性差。

圖1 6 種冬青的田間凍害表現(xiàn)Figure 1 Freezing damage responsein the field of six Ilex varieties

表1 越冬后6 種冬青的凍害級(jí)別Table 1 Freezing damage grades of six Ilex varieties after winter

2.2 葉片組織結(jié)構(gòu)比較

2.2.1 葉片厚度

由表2 和圖2 可知，6 種冬青的葉片厚度為111.44～332.56 μm，差異較大。其中‘史蒂芬’冬青最厚，‘米葉’冬青最薄，兩者相差1.99 倍。

2.2.2 表皮特征

由圖2 可以看出，6 種冬青葉片表皮均由單層細(xì)胞構(gòu)成，外覆角質(zhì)層，上下表皮細(xì)胞均為不規(guī)則的扁長(zhǎng)方形，排列緊密。由表3 可知，6種冬青的上表皮厚度和下表皮厚度差異均極顯著。其中，上表皮厚度為13.34～32.90 μm，‘陽(yáng)光’狹冠冬青最厚，‘米葉’冬青最??；下表皮厚度為7.55～22.67 μm，‘史蒂芬’ 冬青最厚，‘米葉’冬青最薄。

2.2.3 葉肉組織結(jié)構(gòu)特征

由圖2 可知，6 種冬青葉片的柵欄組織細(xì)胞為3～5 層。其中，第1～3 層細(xì)胞排列緊密，第4～5 層細(xì)胞排列相對(duì)疏松，與海綿組織區(qū)分不明顯。由表2 可知，6 種冬青的6 種葉肉組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)均存在極顯著差異： 柵欄組織厚度為22.45 ～86.72 μm，‘史蒂芬’ 冬青最大，‘米葉’冬青最??；海綿組織厚度為70.98 ～210.97 μm，‘中國(guó)少女’冬青最大，‘米葉’冬青最?。粬藕１葹?.22 ～0.42，‘史蒂芬’冬青最大，‘陽(yáng)光’狹冠冬青最?。唤M織結(jié)構(gòu)緊密度為0.15 ～0.26，‘史蒂芬’冬青最大，‘陽(yáng)光’狹冠冬青最?。唤M織結(jié)構(gòu)疏松度為0.52 ～0.84，‘米葉’冬青最大，‘史蒂芬’冬青最小。

圖2 種冬青的葉片橫切面Figure 2 Leaf transverse sections of six Ilex varieties

2.2.4 主脈維管束結(jié)構(gòu)特征

由圖3 可知，6 種冬青的主脈均屬外韌維管束，韌皮部均有大量晶細(xì)胞。由表2 可知，6 種冬青的葉片主脈木質(zhì)部面積和主脈維管束面積均存在極顯著差異： 主脈木質(zhì)部面積和主脈維管束面積分別為3368.69 ～20732.52 μm2和5663.57～45493.51 μm2，‘史蒂芬’冬青最大，‘藍(lán)少女’冬青最??；木維比為0.41 ～0.61，‘米葉’冬青最大，‘中國(guó)少女’冬青最小。

圖3 6 種冬青的葉片主脈橫切面Figure 3 Leaf midrib transverse sections of six Ilex varieties

表2 6 種冬青葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)Table 2 Anatomical structure indexes of six Ilex varieties

2.4 6 種冬青的抗寒性綜合評(píng)價(jià)

由圖4 可知，11 項(xiàng)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)可分為3 類：葉片厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度、主脈木質(zhì)部面積、主脈維管束面積、下表皮厚度和上表皮厚度為第1 類；柵海比和組織結(jié)構(gòu)緊密度為第2 類；組織結(jié)構(gòu)疏松度和木維比為第3 類。

圖4 11 項(xiàng)葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)的變量聚類分析Figure 4 Variable cluster analysis of 11 leaf structure indexes

由表2、表3 和表4 可知：第1 類中，葉片厚度的相關(guān)指數(shù)最大，可作為該類的代表性指標(biāo)；第2 類中，柵海比和組織結(jié)構(gòu)緊密度的相關(guān)指數(shù)相等，但前者變異系數(shù)較大（34.84%），故選擇柵海比作為該類的代表性指標(biāo)；第3 類中，組織結(jié)構(gòu)疏松度和木維比的相關(guān)指數(shù)相等，但前者變異系數(shù)較大（18.34%），故選擇組織結(jié)構(gòu)疏松度作為該類的代表性指標(biāo)。

表3 葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficient of leaf structure indexes

表4 各類中指標(biāo)相關(guān)指數(shù)及排序Table 4 Correlative indexes and order of parameters

將篩選出的3 項(xiàng)葉片抗寒性解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)（葉片厚度、柵海比、組織結(jié)構(gòu)疏松度）作為抗寒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，應(yīng)用隸屬函數(shù)法對(duì)6 種冬青的抗寒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)平均隸屬度大?。ū?），6 種冬青的抗寒性強(qiáng)弱依次為：‘史蒂芬’ 冬青＞‘中國(guó)少女’ 冬青＞‘博福德’ 冬青＞‘陽(yáng)光’ 狹冠冬青＞‘藍(lán)少女’冬青＞‘米葉’冬青。

表5 6 種冬青的抗寒性綜合評(píng)價(jià)Table 5 Comprehensive evaluation on cold resistance of six Ilex varieties

對(duì)6 種冬青的抗寒平均隸屬函數(shù)值進(jìn)行聚類分析（圖5），可將6 種冬青分為3類：‘史蒂芬’冬青和‘中國(guó)少女’冬青為第1 類，抗寒性強(qiáng)；‘博福德’冬青和‘陽(yáng)光’狹冠冬青為第2 類，抗寒性中等；‘藍(lán)少女’冬青和‘米葉’冬青為第3 類，抗寒性弱。這與田間凍害調(diào)查分類結(jié)果一致。

圖5 6 種冬青的抗寒性聚類分析Figure 5 Cluster analysis on cold resistance of six Ilex varieties

3 討論

抗寒性是植物長(zhǎng)期適應(yīng)寒冷環(huán)境而形成的一種遺傳特性，取決于植物的外部形態(tài)特征、解剖結(jié)構(gòu)特性、生理生化特點(diǎn)和外界環(huán)境條件等。葉片組織結(jié)構(gòu)是生態(tài)環(huán)境和遺傳基因共同影響的結(jié)果，具有一定生態(tài)適應(yīng)性和穩(wěn)定性，因此越來越多的研究者將其作為植物抗寒性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。但植物種類不同，抗寒性評(píng)價(jià)代表性指標(biāo)有較大差異。因此，先采用科學(xué)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法從多項(xiàng)葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)中篩選出代表性評(píng)價(jià)指標(biāo)，是科學(xué)評(píng)價(jià)植物抗寒性的重要前提[10-12]。

本研究采用變異系數(shù)、相關(guān)分析和聚類分析從11 項(xiàng)葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)中篩選出了葉片厚度、柵海比和組織結(jié)構(gòu)疏松度作為評(píng)價(jià)6 種冬青抗寒性的代表性指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：柵海比越大，組織結(jié)構(gòu)疏松度越小，冬青抗寒性越強(qiáng)，這與翅莢木[14]、柿[15]、樟樹[16]、含笑[10]、重樓[12]等植物的研究結(jié)果一致；葉片厚度越大，冬青抗寒性越強(qiáng)，這與核桃[17]、早實(shí)核桃[18]、桃[11]等植物的研究結(jié)果一致。但有的研究者認(rèn)為，與柵海比和組織結(jié)構(gòu)疏松度等復(fù)合結(jié)構(gòu)指標(biāo)相比，葉片總厚度和柵欄組織厚度等單一結(jié)構(gòu)指標(biāo)易受樣本或環(huán)境影響而改變，并不能準(zhǔn)確體現(xiàn)樣本間的抗寒遺傳差異[19]。所以，葉片厚度能否作為代表性指標(biāo)用于其他常綠冬青的抗寒性評(píng)價(jià)還需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

另外，譚殷殷等[20]和高馳等[12]發(fā)現(xiàn)，測(cè)定葉片組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)時(shí)的取材時(shí)期不同，篩選出的抗寒性評(píng)價(jià)代表性指標(biāo)也不同，導(dǎo)致同一植物在不同時(shí)期的抗寒性排序結(jié)果差異較大。目前尚未有常綠冬青葉片組織結(jié)構(gòu)與抗寒性關(guān)系的其它報(bào)道。本研究篩選指標(biāo)時(shí)雖已進(jìn)入越冬期，但僅限于12月份，且僅涉及到6 種常綠冬青。所以，要想篩選出更具代表性的常綠冬青抗寒性評(píng)價(jià)代表性指標(biāo)，還應(yīng)增加1月份和2月份的越冬期數(shù)據(jù)，并進(jìn)一步加大樣本數(shù)量。

植物抗寒性強(qiáng)弱并不單取決于某一類或某一個(gè)指標(biāo)，而是葉片組織結(jié)構(gòu)中多類指標(biāo)、多個(gè)指標(biāo)交互作用的結(jié)果。所以，本研究將篩選出的葉片厚度、柵海比和組織結(jié)構(gòu)疏松度3 個(gè)代表性葉片組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)結(jié)合起來作為抗寒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，應(yīng)用隸屬函數(shù)法和聚類分析法對(duì)6 種冬青的抗寒性進(jìn)行評(píng)價(jià)并分類，得出的抗寒性順序結(jié)果和分類結(jié)果與田間凍害調(diào)查得出的結(jié)果一致。這說明，將葉片厚度、柵海比和組織結(jié)構(gòu)疏松度作為代表性葉片組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)來評(píng)價(jià)6 種冬青的抗寒性具有較高可靠性。