胡 偉 吳 慧 袁漢文 郜衛(wèi)華 陳敦學(xué) 郭利偉 許巧情

(1. 長(zhǎng)江大學(xué) 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心 湖北 荊州 434023；2. 湖南師范大學(xué) 省部共建淡水魚(yú)類(lèi)發(fā)育生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南 長(zhǎng)沙 410081；3. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 貴州 貴陽(yáng) 550025)

褪黑激素(melatonin)是一種廣泛分布于動(dòng)物、植物、細(xì)菌和真菌中的天然小分子物質(zhì)(Xu et al, 2017)。在哺乳動(dòng)物中，褪黑激素主要由下丘腦中的松果體在夜間分泌，在性腺、骨髓、視網(wǎng)膜、晶狀體、腎臟和肝 臟 等 組 織 中 也 有 發(fā) 現(xiàn) (Carpentieri et al, 2012;Acu?a-Castroviejo et al, 2014)。褪黑激素不僅具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、清除自由基的作用(Han et al, 2017)，還能通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌方式保護(hù)細(xì)胞抗氧化和炎癥損傷、改善胰島素抵抗(Heo et al, 2018)、調(diào)控生殖發(fā)育(Maitra et al, 2016)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝(Yang et al, 2017)和控制血壓(de Berardis et al, 2013)。褪黑激素還能參與維持神經(jīng)元的內(nèi)穩(wěn)態(tài)(Hermoso et al,2016)和保護(hù)機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能 (艾克拜爾·熱合曼等, 2018; Zhang et al, 2019)。

褪黑激素的功能主要通過(guò)與其高親和力的特異性褪黑激素受體(melatonin receptor, Mtnr1)結(jié)合，再進(jìn)一步啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與細(xì)胞內(nèi)各種生理過(guò)程。Mtnr1屬于G蛋白偶聯(lián)受體超級(jí)家族(Brydon et al,1999)，與其他G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)相似，包括7個(gè)跨膜域、1個(gè)G蛋白結(jié)合位點(diǎn)、多個(gè)磷酸化以及糖基化位點(diǎn)(Klosen et al, 2019)。另外，第 3跨膜域的下游含有NRY結(jié)構(gòu)域和C(C/Y) ICHS結(jié)構(gòu)域，第7跨膜域中存在 NPXXY 結(jié)構(gòu)域(Reppert et al, 1995b; Klosen et al, 2019)。Mtnr1在脊椎動(dòng)物中存在3種不同亞型，分別為 Mtnr1A (Mel 1a或 MT1)、Mtnr1B (Mel 1b或MT2)和 Mtnr1C (Mel 1c或GPR50) (Reppert et al,1995a)，而哺乳動(dòng)物中僅有前 2種亞型：Mtnr1A和Mtnr1B (Gaildrat et al, 2000)，僅在魚(yú)類(lèi)等低等脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)第 3種亞型 Mtnr1C (Dufourny et al, 2008)。此外，魚(yú)類(lèi)特有基因組加倍事件導(dǎo)致Mtnr1A和Mtnr1B存在多個(gè)不同亞型，如斑馬魚(yú)(Daniorerio)Mtnr1Aa和Mtnr1Ab(Reppert et al, 1995b)；虹鱒(Oncorhynchus mykiss) Mtnr1Aa、Mtnr1Ab和 Mtnr1B(Mazurais et al, 1999)；星點(diǎn)東方鲀(Takifugu niphobles)Mel1a1.4、Mel1a1.7 和 Mel1b (Ikegami et al, 2009b)；大彈涂魚(yú)(Boleophthalmus pectinirostris) Mel1a1.4、Mel1a1.7 和Mel1b (朱文博等, 2012; Hong et al,2014)；大西洋鮭(Salmo salar) Mtnr1Aaα、Mtnr1Aaβ、Mtnr1Ab、Mtnr1al和 Mtnr1B (Ciani et al, 2019)；金魚(yú)(Carassiusauratus)Mel1a1.4、Mel1a1.7 和 Mel1b(Ikegami et al, 2009a)。值得注意的是，Mtnr1廣泛參與機(jī)體神經(jīng)調(diào)節(jié)(Klosenet al, 2019)、節(jié)律同步(Ikegami et al, 2009b)、內(nèi)分泌激素合成(Ciani et al,2019)和生長(zhǎng)繁殖(Ikegami et al, 2009b; Hong et al,2014)等生理活動(dòng)。例如，敲除Mtnr1A基因后的小鼠表現(xiàn)出焦慮、類(lèi)似抑郁癥，增加了獎(jiǎng)勵(lì)和上癮傾向，降低了快速眼動(dòng)睡眠(Comaiet al, 2019)，生理節(jié)律(包括年生殖節(jié)律)也發(fā)生改變(Ng et al, 2017)。另外，Mtnr1在機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)過(guò)程發(fā)揮積極作用，如在人(Homosapiens)淋巴細(xì)胞(Jurkat)和單核細(xì)胞(U937)研究中發(fā)現(xiàn)，褪黑激素能通過(guò)Mtnr1增強(qiáng)其白細(xì)胞介素 IL-2和 IL-6分泌(García-Mauri?oet al,2000)，添加MtnrB抑制劑Luzindole后，不僅降低了人淋巴細(xì)胞中IL-2和 IL-2受體的分泌(Carrillo-Vico et al, 2004)，還增強(qiáng)了前列腺素E2對(duì)IL-2的抑制效果(Carrillo-Vico et al, 2005)。此外，褪黑激素能促進(jìn)野生型和MtnrA敲除型小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，而抑制MtnrA 蛋白后增殖現(xiàn)象消失(Drazen et al, 2001)。這些研究證實(shí)了Mtnr1參與哺乳動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)和免疫過(guò)程，但有關(guān)硬骨魚(yú)類(lèi)Mtnr1的研究仍處于起步階段。

草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，其2018年產(chǎn)量達(dá)到5.5萬(wàn)t (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等, 2019)。草魚(yú)疾病的暴發(fā)與其免疫調(diào)節(jié)能力密切相關(guān)，褪黑激素在機(jī)體免疫過(guò)程中具有重要作用，Mtnr1是褪黑激素發(fā)揮生理功能的關(guān)鍵受體分子，因此，解析Mtnr1基因在草魚(yú)免疫調(diào)節(jié)中的功能對(duì)草魚(yú)疾病的免疫防治具有重要意義。本研究以草魚(yú)為研究對(duì)象，克隆得到Mtnr1基因6種異構(gòu)性的全長(zhǎng)cDNA序列，通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)，研究不同亞型的序列和結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測(cè)6種亞型在不同組織/器官中的分布和表達(dá)模式，研究結(jié)果可為Mtnr1在脊椎動(dòng)物中的進(jìn)化補(bǔ)充數(shù)據(jù)，同時(shí)，可為后續(xù)深入研究其基因功能以及揭示Mtnr1在草魚(yú)免疫過(guò)程中的作用奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)草魚(yú)購(gòu)自湖北荊州水產(chǎn)市場(chǎng)，大小規(guī)格為(1.00±0.25) kg，暫養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)2周。水溫為(24±2)℃。飽食投喂 2次/d (09:00和 17:00)。暫養(yǎng)結(jié)束后，饑餓 24 h 取樣，用 MS-222 (10 mg/L)麻醉魚(yú)體，在冰上迅速取出其肝臟、心臟、鰓、腦、肌肉、前腸、中腸、后腸和腎臟9個(gè)組織，液氮速凍后，存于-80℃冰箱備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 采用Total RNA kit I提取試劑盒(Omega, 美國(guó))提取總 RNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳和超微量核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo Scientific, 美國(guó))檢測(cè) RNA 完整性和濃度。利用MonScript? RTⅢ Super Mix with dsDNase(two-step) (莫納, 蘇州)合成 cDNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，PCR產(chǎn)物保存于-20℃。

1.2.2 草魚(yú) Mtnr1基因全長(zhǎng) cDNA 克隆 利用斑馬魚(yú)、鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)、鯽魚(yú)(Carassius auratus)以及哺乳動(dòng)物人類(lèi)、褐家鼠(Rattus norvegicus)等已公布Mtnr1A、Mtnr1B和Mtnr1C基因序列，比對(duì)保守區(qū)域后設(shè)計(jì)引物(表 1)，進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。再基于獲得的部分cDNA序列，分別利用RACE技術(shù)，按照RACE試劑盒(TaKaRa)對(duì) Mtnr1的5′和3′端進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序正確后，通過(guò)DNAStar軟件拼接獲得完整的cDNA序列。

1.2.3 Mtnr1基因序列分析 利用 NCBI中 Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)分析獲得的 Mtnr1不同亞型 cDNA序列的正確性。通過(guò) NCBI網(wǎng)站的 ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查 找Mtnr1不同亞型的ORF框。使用ExPASy (http://web.expasy.org/translate/)翻譯Mtnr1不同亞型cDNA編碼蛋白序列。利用ProtParam在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)Mtnr1不同亞型的蛋白基本理化特性(https://web.expasy.org/ protparam/)。通過(guò)Tmpred在線(xiàn)軟件對(duì)Mtnr1不同亞型的跨膜域進(jìn)行預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/#opennewwindow)。并采用Singal4.1軟件預(yù)測(cè)其信號(hào)肽。采用Phyre2軟件對(duì) Mtnr1不同亞型蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。利用Cell-PLoc2.0在線(xiàn)軟件(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)預(yù)測(cè)Mtnr1的亞細(xì)胞定位。通過(guò)NetPhos和NetNGlyc軟件分別對(duì)蛋白磷酸化位點(diǎn)(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/)和糖基化位點(diǎn)(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)進(jìn)行分析。采用ClustalW軟件對(duì) Mtnr1不同亞型不同物種間進(jìn)行序列比對(duì)和一致性分析。最后利用MEGA 5.2軟件，以鄰接法(NJ)對(duì)Mtnr1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，設(shè)定bootstrap值為1000。

1.2.4 草魚(yú)Mtnr1基因的表達(dá)模式 隨機(jī)選取4條暫養(yǎng)后的草魚(yú)，分別提取9個(gè)不同組織(肝臟、心臟、鰓、腦、肌肉、前腸、中腸、后腸和腎臟)的總RNA，設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以總RNA為模板，按照MonScript? RTⅢ Super Mix with dsDNase (莫納，蘇州)說(shuō)明書(shū)合成cDNA，并將cDNA稀釋 10倍作為RT-qPCR模板，保存于-20℃?zhèn)溆?。Mtnr1基因的組織表達(dá)模式測(cè)定方法參考侯吉倫等(2019)：依據(jù)克隆獲得的草魚(yú)Mtnr1基因序列，利用Primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)Mtnr1基因RT-qPCR定量引物RT-F和RT-R，并以β-actin為內(nèi)參基因(表1)。根據(jù)說(shuō)明書(shū)設(shè)置定量反應(yīng)體系：SYBR?fast qPCR master mixⅡ20 μL，cDNA模板 4 μL，引物各 0.5 μL。RT-qPCR 反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，共 40個(gè)循環(huán)。利用 2-ΔΔCt方法(Livak et al, 2002)檢測(cè) Mtnr1不同亞型在不同組織中的表達(dá)模式。

表1 草魚(yú)褪黑激素受體Mtnr1基因克隆擴(kuò)增引物Tab.1 Amplification primers used for cloning Mtnr1 genes from C. idella

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，為確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)的Tukey法對(duì)Mtnr1不同亞型的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行兩兩比較，顯著性水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mtnr1基因亞型cDNA序列分析

利用DNAStar將克隆獲得的cDNA進(jìn)行拼接，并通過(guò)NCBI中的Blast對(duì)獲取的序列進(jìn)行正確性驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)克隆得到草魚(yú)6個(gè)Mtnr1 cDNA序列，分別為Mtnr1Aa、Mtnr1Ab、Mtnr1Alike、Mtnr1Ba、Mtnr1Bb和Mtnr1C，并將其提交至NCBI的GenBank，序列號(hào)分別為MT883605、MT883607、MT883608、MT883606、MT883609和MT883610，其全長(zhǎng)分別為2045、2036、2031、2799、2535和 2477 bp (表 2)。ProtParam軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，草魚(yú)Mtnr1基因編碼蛋白的氨基酸數(shù)、分子量和等電點(diǎn)分別見(jiàn)表2。Mtnr1Aa、Mtnr1Ab、Mtnr1Alike、Mtnr1Ba、Mtnr1Bb和 Mtnr1C基因編碼蛋白均由20種氨基酸組成，含量最高的氨基酸分別為纈氨酸(12.6%)、纈氨酸(11.3%)、亮氨酸(11.6%)、亮氨酸(13.0%)、亮氨酸(11.6%)和亮氨酸(12.5%)，含量最低的氨基酸分別為色氨酸(1.7%)、組氨酸(1.4%)、谷氨酰胺(1.5%)、組氨酸(1.1%)、組氨酸(1.2%)和組氨酸(1.4%)。帶正(負(fù))電氨基酸殘基數(shù)分別為 28(17)、18(32)、19(33)、17(35)、16(30)和 11(31)。原子組成分別為C1853H2853N461O475S18、C1877H2905N463O479S17、C1836H2845N463O458S15、C1820H2883N489O470S18、C1819H2825N463O463S13和C1839H2885N481O484S20。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)分別為35.19、35.32、30.93、38.67、35.74和 34.75，均屬于穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水性分別為0.560、0.560、0.556、0.490、0.675和0.502，均為親水性蛋白。脂肪酸指數(shù)分別為113.77、116.36、120.90、115.24、119.28和109.58。

表2 草魚(yú)褪黑激素受體Mtnr1 cDNA基本信息Tab.2 The information of Mtnr1 cDNA of C. idella

2.2 Mtnr1亞型蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用TMpred在線(xiàn)軟件對(duì)草魚(yú)Mtnr1的6種亞型蛋白跨膜域進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，草魚(yú)Mtnr1的6種亞型均存在7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，包括N端、跨膜區(qū)域、細(xì)胞膜內(nèi)和膜外區(qū)域以及C端，表明其為非胞內(nèi)蛋白。通過(guò)Cell-PLoc 2.0在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)Mtnr1的6種亞型編碼蛋白亞細(xì)胞定位，顯示均定位于細(xì)胞膜。通過(guò)SignalP4.1預(yù)測(cè)草魚(yú)Mtnr1的6種基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，均未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽序列，說(shuō)明6種亞型編碼蛋白均為非分泌型蛋白。利用 Phyre2在線(xiàn)軟件構(gòu)造草魚(yú)Mtnr1的6種模擬蛋白3D亞型與人Mtnr1A和Mtnr1B蛋白以及斑馬魚(yú)的6種模擬結(jié)構(gòu)對(duì)比，結(jié)果顯示，蛋白結(jié)構(gòu)較為相似(圖1)。此外，通過(guò)多重氨基酸序列比較可知，Mtnr1的6種亞型具有 NRY結(jié)構(gòu)域、CYICHS結(jié)構(gòu)域、NAXXY結(jié)構(gòu)域和G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。利用NetNGlyc 1.0和NetPhos 3.1預(yù)測(cè)功能位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種亞型受體的糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)數(shù)分別為Mtnr1Aa(Asn4、Asn9和 Asn117/22、Mtnr1Ab (Asn7、Asn13和Asn121)/28、Mtnr1Alike (Asn37和 Asn144)/17、Mtnr1Ba(Asn4、Asn10和Asn122)/24、Mtnr1Bb(Asn10和Asn121)/25和 Mtnr1C (Asn7、Asn25和 Asn121)/30。

圖1 草魚(yú)、斑馬魚(yú)和人的基于Mtnr1亞型氨基酸序列預(yù)測(cè)的蛋白3D結(jié)構(gòu)Fig.1 Protein structure prediction of C. idellus, Danio rerio and Homo sapiens based on sequences of Mtnr1

圖2 草魚(yú)不同Mtnr1亞型氨基酸序列多重比對(duì)分析結(jié)果Fig.2 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence of grass carp Mtnr1 subtypes

2.3 Mtnr1同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于ClustalW，對(duì)草魚(yú)Mtnr1的6種不同亞型編碼的氨基酸序列同已有物種的Mtnr1序列同源性進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)表3。6種亞型與其他魚(yú)對(duì)應(yīng)的亞型同源性很高，分別為93.1%～99.4%、84.8%～95.2%、82.8%～96.8%、90.1%～97.5%、79.7%～98.3%和90.6%～95.6%。另外，運(yùn)用MEGA 5.2軟件構(gòu)建草魚(yú)Mtnr1的6種亞型氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)，Bootstrap重復(fù)次數(shù)設(shè)為1000次迭代。結(jié)果表明，構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)與氨基酸的多重比較結(jié)果較一致。草魚(yú)Mtnr1的6種亞型均與其他魚(yú)類(lèi)的對(duì)應(yīng)亞型聚為一支，且與鯉魚(yú)、鯽魚(yú)和斑馬魚(yú)親緣關(guān)系最近。

圖3 采用MEGA 5.2軟件構(gòu)建的基于草魚(yú)Mtnr1氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on the protein sequences of Mtnr1 from C. idellus and other vertebrate species using the neighbor-joining (NJ) method in MGEA 5.2

表3 草魚(yú)Mtnr1氨基酸序列與其他物種對(duì)應(yīng)氨基酸序列的同源性Tab.3 Homologies of deduced amino acid sequences of six Mtnr1 isoforms gene of C. idellus and other species

2.4 草魚(yú)Mtnr1組織表達(dá)模式

采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了Mtnr1基因在草魚(yú)肝臟、心臟、鰓、腦、肌肉、前腸、中腸、后腸和腎臟9個(gè)組織的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Mtnr1的6種亞型在所檢測(cè)的組織中均有表達(dá)(圖4)。其中，Mtnr1Aa基因在腦組織中表達(dá)量最高(P＜0.05)，腎臟、鰓、中腸、心臟次之，而在肝臟組織中表達(dá)量最低(P＜0.05)。Mtnr1Ab基因在腦組織中表達(dá)量最高(P＜0.05)，然后依次為腎臟、肌肉、后腸、肝臟和心臟，在鰓、前腸及中腸中表達(dá)量最低(P＜0.05)，而鰓、前腸以及中腸之間表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。Mtnr1Alike基因在腎臟中表達(dá)量最高(P＜0.05)，然后依次為腦、前腸、后腸和中腸，而在肝臟中表達(dá)量最低(P＜0.05)。Mtnr1Ba基因 mRNA水平在腦中表達(dá)量最高，其次在腎臟、前腸和中腸表達(dá)量居中，隨后心臟、鰓、肌肉和后腸中表達(dá)量次之，且它們之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，在肝臟中表達(dá)量最低(P＜0.05)。Mtnr1Bb在腦中含量最高，其次為心臟，在其余組織中含量最低且它們之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。Mtnr1C基因表達(dá)量在腎臟組織中最高(P＜0.05)，其次為腦、中腸和心臟，在肝臟組織中含量為最低(P＜0.05)。此外，從對(duì)亞型表達(dá)熱圖可知(圖5)，6種亞型均在腦和腎臟組織中大量表達(dá)，其次為腸道組織，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在腦組織中Mtnr1Aa基因表達(dá)量最高(P＜0.05)，其次為Mtnr1Ba、Mtnr1C、Mtnr1Alike和 Mtnr1Bb，而 Mtnr1Ab基因表達(dá)量最低(P＜0.05) (圖5)。在腎臟組織中發(fā)現(xiàn)Mtnr1Ba表達(dá)量最高，其次為Mtnr1C、Mtnr1Alike、Mtnr1Aa和 Mtnr1Ab，而 Mtnr1Bb基因表達(dá)量最低(P＜0.05) (圖5)。另外，在前腸中發(fā)現(xiàn)Mtnr1Ba基因表達(dá)量最高(P＜0.05)，其次為 Mtnr1Alike、Mtnr1C、Mtnr1Aa和Mtnr1Bb，而Mtnr1Ab表達(dá)量最低(P＜0.05)。中腸中 Mtnr1Ba 基因表達(dá)量最高(P＜0.05)，其次為Mtnr1C、Mtnr1Alike、Mtnr1Aa和Mtnr1Bb，而Mtnr1Ab表達(dá)量最低(P＜0.05)。后腸中Mtnr1Ba和Mtnr1Alike基因表達(dá)量最高(P＜0.05)，且二者之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，其次為Mtnr1C、Mtnr1Aa和Mtnr1Ab，而 Mtnr1Bb表達(dá)量最低(P＜0.05) (圖 5)。

圖4 草魚(yú)Mtnr1基因6種亞型在不同組織中的表達(dá)模式Fig.4 Expression of 6 isoforms of Mtnr1 mRNA in different tissues of C. idellus

圖5 Mtnr1亞型的組織表達(dá)熱圖Fig.5 Heatmap of expression pattern of the Mtnr1 family mRNA in different tissues of C. idellus

3 討論

本研究成功克隆得到草魚(yú)Mntr1基因6個(gè)亞型的cDNA全長(zhǎng)序列，全長(zhǎng)序列長(zhǎng)度為2031～2799 bp，編碼的氨基酸個(gè)數(shù)為344～361，無(wú)信號(hào)肽序列，均屬于非分泌型蛋白。Mtnr1的6種亞型由7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(Ⅰ～Ⅶ)構(gòu)成，屬于典型的G 蛋白偶聯(lián)受體(Shiu et al,1998)。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，草魚(yú)Mtnr1存在NRY結(jié)構(gòu)域、CYICHS結(jié)構(gòu)域、NAXXY結(jié)構(gòu)域和 G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合位點(diǎn)以及多個(gè)糖基化和磷酸化位點(diǎn)，這與大西洋鮭和大彈涂魚(yú)的Mtnr1基因研究結(jié)果一致(Hong et al, 2014; Ciani et al, 2019; Klosen et al,2019)，暗示草魚(yú)Mtnr1在進(jìn)化中具有較高的保守性。另外，6種亞型的3D結(jié)構(gòu)與斑馬魚(yú)和人的Mntr1空間結(jié)構(gòu)相似，進(jìn)一步證實(shí)其進(jìn)化保守性。同時(shí)，同源性比較發(fā)現(xiàn)，草魚(yú) Mtnr1基因6種亞型(Mtnr1Aa、Mtnr1Ab、Mtnr1Alike、Mtnr1Ba、Mtnr1Bb和 Mtnr1C)與其他魚(yú)對(duì)應(yīng)的Mntr1亞型同源性很高，分別為93.1%～99.4%、84.8%～95.2%、82.8%～96.8%、90.1%～97.5%、79.7%～98.3%、和90.6%～95.6%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，草魚(yú)Mtnr1基因6種亞型與鯉魚(yú)、鯽魚(yú)和斑馬魚(yú)等鯉科(Cyprinidae)魚(yú)類(lèi)的各亞型聚為一支，表明草魚(yú)Mtnr1與鯉科魚(yú)類(lèi)親緣關(guān)系較近，這與它們的進(jìn)化地位一致。

Mtnr1的6種亞型基因在草魚(yú)腦、肝臟、心臟、鰓、肌肉、前腸、中腸、后腸和腎臟9個(gè)組織中均有表達(dá)，表明Mntr1可能廣泛參與機(jī)體各種生理活動(dòng)(Hong et al, 2014)。本研究發(fā)現(xiàn)，Mtnr1Aa、Mtnr1Ab、Mtnr1Ba和Mtnr1Bb 4種亞型集中在腦組織中表達(dá)，暗示其主要參與神經(jīng)調(diào)節(jié)相關(guān)的活動(dòng)(Klosen et al,2019)。這與大西洋鮭(Ciani et al, 2019)、星點(diǎn)東方鲀(Ikegami et al, 2009b)和金魚(yú)(Ikegami et al, 2009a)中的研究相似。如 Ikegami等(2009b)研究發(fā)現(xiàn)，Mel1a 1.4、Mel1a 1.7和Mel1b均在星點(diǎn)東方鲀腦組織、視網(wǎng)膜、腦垂體和外圍組織中表達(dá)，且在腦組織中表達(dá)量最高。另外，褪黑激素在生物鐘網(wǎng)絡(luò)中既是視交叉上核(suprachiasmatic nuclei, SCN)的時(shí)鐘輸出，又是內(nèi)部同步器，表明它的主要功能是充當(dāng)時(shí)鐘輸如“time giver” (Pevet et al, 2011)。而褪黑激素功能發(fā)揮依賴(lài)于Mtnr1的表達(dá)，Mtnr1在腦組織中的高表達(dá)，間接證實(shí)褪黑激素在草魚(yú)機(jī)體神經(jīng)調(diào)節(jié)過(guò)程中具有重要作用。

此外，本研究顯示，Mtnr1Ba基因在草魚(yú)前腸、中腸和后腸中均高表達(dá)，Mtnr1Alike在后腸中高表達(dá)，Mtnr1的表達(dá)呈現(xiàn)組織差異性。這與哺乳動(dòng)物和水禽類(lèi)中的研究類(lèi)似，如大鼠MT2在其結(jié)腸中mRNA水平最高，而 MT1基因在十二指腸內(nèi)表達(dá)量最高，在回腸和空腸中表達(dá)低(Stebelová et al, 2010)；MT1和 MT2在人胃腸道肌間神經(jīng)叢、腸上皮和胃腸血管中均有表達(dá)，且在大腸上皮表達(dá)量最高(S?derquist et al, 2015)；鴨腸道 2-125碘褪黑素結(jié)合位點(diǎn)密度大小依次為回腸、空腸＞十二指腸、結(jié)腸＞盲腸(Lee et al,1993)。另外，研究表明，Mtnr1介導(dǎo)褪黑激素作用腸道粘膜肌層和腸肌間神經(jīng)叢發(fā)揮免疫功能，抵抗各種病原微生物的侵襲(Esteban-Zubero et al, 2017)。本研究中，Mtnr1基因在腸道不同部位表達(dá)量存在差異，暗示Mtnr1在草魚(yú)腸道不同部位可能發(fā)揮不同的免疫功能，但尚需進(jìn)一步研究。

值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，除Mtnr1Alike和Mtnr1C亞型外，Mtnr1Aa、Mtnr1Ab和Mtnr1Ba也在腎臟中高表達(dá)，這與金魚(yú)中的研究結(jié)果類(lèi)似(Ikegami et al, 2009a)，而與歐洲鱸魚(yú)(Dicentrarchuslabrax)(Sauzet et al, 2008)鰓、星點(diǎn)東方鲀(Ikegami et al,2009b)神經(jīng)和垂體表達(dá)相異，究其原因可能是亞型基因表達(dá)存在物種和組織的特異性。腎臟作為魚(yú)體主要的免疫器官，免疫功能相關(guān)基因在該組織中呈現(xiàn)高表達(dá)(侯吉倫等, 2019)，在哺乳動(dòng)物小鼠的胸腺和腎臟免疫器官中已經(jīng)證實(shí)，Mtnr1mRNA表達(dá)量較高(Carrillo-Vicoet al, 2003)。本研究結(jié)果顯示，草魚(yú)Mntr1亞型mRNA在腎臟中表達(dá)量高，暗示 Mtnr1可能與免疫相關(guān)。而褪黑激素主要通過(guò)與高親和力的特異性Mntr1蛋白結(jié)合，隨后啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在靶細(xì)胞上介導(dǎo)各種生理活動(dòng)(Klosen et al, 2019)。另外，褪黑激素可以直接作用于機(jī)體的免疫活性過(guò)程，如Cuesta等(2008)研究發(fā)現(xiàn)，金頭鯛(Sparus aurata)注射褪黑激素后，血液中過(guò)氧化物酶、吞噬作用和活性氧中間體等活性以及干擾素-1β、主要組織相容性復(fù)合體、病毒相關(guān)效應(yīng)和淋巴標(biāo)記等基因表達(dá)顯著上升。同樣地，相對(duì)于對(duì)照組，注射褪黑激素后中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)血淋巴中超氧化物歧化酶活性顯著增加，丙二醛的含量顯著下調(diào)(She et al, 2019)。目前，盡管本研究Mntr1基因在腎臟中高表達(dá)，但僅推測(cè)Mntr1亞型介導(dǎo)了草魚(yú)的免疫反應(yīng)，而草魚(yú)受到病原或褪黑激素刺激后，Mntr1亞型的表達(dá)和免疫效應(yīng)情況并不清楚，需要后續(xù)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究首次在草魚(yú)組織中成功克隆得到Mntr1的6種亞型的cDNA序列，并對(duì)其序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，通過(guò)對(duì) 6種亞型在組織表達(dá)模式的研究，初步表明 Mtnr1Aa和 Mtnr1Ba基因與草魚(yú)神經(jīng)調(diào)節(jié)和免疫反應(yīng)有關(guān)，為今后深入研究Mtnr1Aa和Mtnr1Ba基因在草魚(yú)神經(jīng)調(diào)節(jié)和免疫功能方面提供了理論依據(jù)。