龐海月 ，吳黌坦 ，張書迪 ，黃立森 ，旦真次仁 ，陳芳芳 ，王貴弘 ，陳煜沛 *

（1.廈門醫(yī)學(xué)院天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建廈門361023；2.廈門醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與醫(yī)學(xué)技術(shù)系，福建廈門361023；3.林芝市科技局，西藏林芝350309）

隨著醫(yī)療健康事業(yè)的發(fā)展，越來越多的研究表明機(jī)體衰老跟體內(nèi)自由基增加造成的氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)有關(guān)，而植物、動物和微生物來源的天然活性產(chǎn)物是抗氧化物質(zhì)的重要來源［1］。我國的西藏地區(qū)植被資源豐富，有較多尚未開發(fā)的植物，其中千里光屬植物具有重要的藥用價(jià)值，多次被報(bào)道［2］。耳柄蒲兒根［Sinosenecio euosmus（Handel-Mazzetti）B. Nordenstam］屬于菊科蒲兒根屬二年或多年生草本植物，主要分布在我國的西藏、陜西、甘肅、四川、湖北以及云南等地；海拔2400～4000 米的高山草甸或山體的坡地上經(jīng)常見到，花期7 月到10 月。王彩芳等［3］2013年對河南產(chǎn)菊科千里光屬蒲兒根（S.oldhamianus）的花的成分做了初步研究，從中首次分離到了β-谷甾醇、棕櫚酸、澤蘭素、Euparone、金絲桃苷和咖啡酸。王春明［4］等人從千里光中分離得到了一個(gè)新的倍半萜，研究了其對人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910的細(xì)胞毒性、端粒酶活性、凋亡以及相關(guān)基因表達(dá)的影響。但對于耳柄蒲兒根萃取物抗氧化方面未做較深入的系統(tǒng)研究。據(jù)了解，西藏林芝地區(qū)民間常采集耳柄蒲兒根花蕾，碾碎，用清水熬煮成膏狀后，涂抹于面部，可有效改善皮膚色澤，修復(fù)紫外線曬傷。因此對其花蕾進(jìn)行抗氧化和美白方面的研究，期望將其開發(fā)成具有抗氧化以及美白等功效的天然化妝品提取物。

本次試驗(yàn)采用耳柄蒲兒根經(jīng)大孔樹脂富集的組分為研究對象，測定了其酚類物質(zhì)含量、總抗氧化能力、清除DPPH 自由基和清除NO 自由基能力，并利用對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞模型檢測其對細(xì)胞氧化損傷修復(fù)的能力。

1 儀器與試劑

1.1 試驗(yàn)儀器

FDU-1200 冷凍干燥機(jī)（EYELA 東京理化器械株式會社）；R-300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI 日本東京理化器械株式會社）；SpectraMax i3x 酶標(biāo)儀（美國MD Electronics 公司）；Secura 225D-1CN 電子天平（上海賽多利斯貿(mào)易有限公司）；BB150 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（中國賽默飛世爾科技有限公司）；DMI1 倒置顯微鏡（上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司）；AC2-4S1 生物安全柜（新加坡藝思高科技有限公司）；GR85DF全自動高壓滅菌鍋（廈門致微儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)藥材與試劑

耳柄蒲兒根采自林芝市米林縣；人肝腫瘤細(xì)胞株HepG2購買于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物細(xì)胞庫。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、L-抗壞血酸（Ascorbic Acid，VC）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT］，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸、對乙酰氨基酚（4-Acetamido-phenol，APAP），生工生物工程有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS法）和一氧化氮含量檢測試劑盒，碧云天生物科技有限公司。水溶性維生素E，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

2 方法

2.1 萃取物制備

準(zhǔn)確稱取100 g 耳柄蒲兒根粉，加入純水（液料比5：1），70℃水浴萃取，輔助超聲波1 h，過濾后經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)濃縮至褐色膏狀。經(jīng)純水重新溶解后，濾紙過濾，過濾液經(jīng)大孔樹脂AB8 吸附，保留50%乙醇溶劑洗脫液，冷凍干燥后得到耳柄蒲兒根萃取物（Sinosenecio euosmus（Handel-Mazzetti） B. Nordenstam extracts，SEE），4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 總酚含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線：沒食子酸水溶液，設(shè)置其濃度梯度為0.5、025、0.125、0.0625、0.03125、0 mg/mL。取2根試管，分別加入500μL 不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和 SEE，加入 500 μL 福林酚試劑，室溫靜置 5 min。依次加入500μL 10%Na2CO3溶液和350μL ddH2O，混和均勻，避光反應(yīng)1 h，測定760 nm 處各吸光值并計(jì)算總酚含量，單位為μg GAE/mg。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=31.31X+0.059 45（R2=0.994 2），方程中X為沒食子酸濃度，Y為OD值。

2.3 總抗氧化能力測定

依照ABTS試劑盒使用說明書，水溶性維生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)置濃度梯度為0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。取 96 孔板，加 200 μL ABTS 工作液，空白對照孔中加10μL蒸餾水；各檢測孔中加入10μL待測樣品或Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液。將加樣后的孔板混和均勻，室溫孵育2～6 min，用酶標(biāo)儀測定734 nm 處的吸光值。依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總抗氧化能力，總抗氧化能力的表示方法用水溶性維生素E等效抗氧化能力表示。

2.4 DPPH自由基清除能力的測定

待測樣品設(shè)置三個(gè)檢測濃度（0.1、0.01、0.001 mg/mL），陽性對照和空白對照分別設(shè)置為維生素C和無水乙醇。量取200μL 樣品液和對照溶液，加入等體積的0.1 mmol/L DPPH 溶液，混和均勻，室溫避光反應(yīng)30 min，測定517 nm 處吸光值，最后計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：OD0為不加樣品的空白組；OD1為扣除干擾色后的樣品組。

2.5 一氧化氮（NO）清除作用測定

將不同濃度（1.0、0.1、0.01、0.001 mg/mL）的樣品（2 μL）與98 μL 亞硝酸鈉（0.1 mM），以蒸餾水為空白對照，以維生素C為陽性對照，各組樣品分別在25℃下混合反應(yīng)30 min。然后添加100μL Griess 試劑（0.1%萘二胺二鹽酸鹽、5%磷酸和1%磺胺）檢測560 nm處的吸光值，并計(jì)算清除率。

式中：OD0為不加樣品的空白組；OD1為扣除干擾色后的樣品組。

2.6 對乙酰氨基酚誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞株炎癥損傷測定

接種對數(shù)期細(xì)胞100 μL（5×103個(gè)細(xì)胞）于96 孔板，培養(yǎng) 24 h 后，加入樣品（終濃度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2 mg/mL），補(bǔ)充培養(yǎng)液至每孔總體積為 200 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，加入 12 mmol/L APAP 繼續(xù)培養(yǎng)6 h。設(shè)置空白對照和空白調(diào)零組。培養(yǎng)結(jié)束后，在倒置顯微鏡下觀察各組檢測孔中細(xì)胞形態(tài)。之后于每孔加入10 μL 0.5 mg/mL MTT 培養(yǎng)5 h，除去培養(yǎng)液，加入200μL DMSO充分溶解，檢測490 nm處各孔的吸光值，計(jì)算細(xì)胞相對存活率。

式中：A0為未添加樣品的對照組；A1為添加樣品的實(shí)驗(yàn)組。

3 結(jié)果

3.1 SEE的總酚含量

在植物體中，酚類物質(zhì)有很多，含量多且最具代表性的是沒食子酸。以沒食子酸為主的酚類物質(zhì)在堿性溶液中將鎢鉬酸還原成藍(lán)色化合物，該化合物在760 nm 處有最高吸收峰。經(jīng)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y = 31.31X + 0.05945（R2=0.9942）計(jì)算得出SEE總酚含量為53.21μg GAE/mg。

3.2 SEE的總抗氧化能力

水溶性維生素E 是維生素E 類似物，具有和維生素E 相近的抗氧化能力。通常以水溶性維生素E為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測定其他抗氧化物質(zhì)相對抗氧化能力。本次測得標(biāo)準(zhǔn)方程：Y = 3.672X—0.01776（R2=0.9923），通過標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算SEE總抗氧化能力。結(jié)果表明，SEE的總抗氧化活性為（5.359±0.02）mmol/g。

3.3 SEE對DPPH 自由基的清除能力

采用DPPH 自由基清除試驗(yàn)評價(jià)耳柄蒲兒根萃取物的清除自由基的能力。試驗(yàn)結(jié)果表明，耳柄蒲兒根萃取物具有較好的清除自由基活性，半數(shù)抑制率濃度為（0.52± 0.02）mg/mL，略大于維生素C 的半數(shù)抑制率濃度（0.49±0.03）mg/mL。

3.4 SEE對一氧化氮（NO）的清除能力

采用NO 清除試驗(yàn)評價(jià)SEE 體外清除NO 自由基的能力。試驗(yàn)結(jié)果表明，耳柄蒲兒根萃取物體外清除NO的作用為1 mg/mL的SEE對NO自由基的相對清除率為6.68%。

3.5 SEE 對APAP 誘導(dǎo)的HepG2 人肝癌細(xì)胞株損傷作用測定

APAP 可造成肝癌細(xì)胞損傷，并隨著濃度升高而損傷加重，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞存活率降低。經(jīng)前期試驗(yàn)摸索，12 mmol/L APAP 處理?xiàng)l件下，HepG2人肝癌細(xì)胞存活率在62.6%。經(jīng)不同濃度SEE 處理后，HepG2 人肝癌細(xì)胞株存活率輕微升高，其中0.08 mg/mLSEE 處理組細(xì)胞存活率為77.0%。如下圖1（a，b）所示。

圖1 （a，b）耳柄蒲兒根萃取物（SEE）對APAP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞株氧化損傷的作用Fig.1 （a，b）The effect of SEE on 4-acetamidophenol-induced oxidative damage of HepG2 cell lines

4 討論與結(jié)論

經(jīng)大孔樹脂AB8 純化后獲得耳柄蒲兒根萃取物SEE，相較于其他植物來源，如玫瑰果及倫晚臍橙等［5-6］，總酚含量明顯較低。過去研究發(fā)現(xiàn)，從蒲兒根花中鑒定出β-谷甾醇、金絲桃苷及咖啡酸［7-9］等酚類物質(zhì)也都具有良好的抗氧化作用。從本試驗(yàn)結(jié)果可以得出，耳柄蒲兒根萃取物SEE 對于DPPH及ABTS 自由基具有較強(qiáng)的清除能力，但對于抗炎指標(biāo)NO的清除率卻明顯較低。

耳柄蒲兒根萃取物SEE在0.08 mg/mL時(shí)具有較好的提高細(xì)胞抵抗氧化損傷能力，且研究發(fā)現(xiàn)從蒲兒根花中的金絲桃苷及咖啡酸對于大鼠肝細(xì)胞損傷也具有一定的保護(hù)作用［10-11］，推測耳柄蒲兒根萃取物的修復(fù)細(xì)胞氧化損傷作用源自此類化合物的功效。

本研究中的耳柄蒲兒根萃取物雖然多酚類物質(zhì)含量低，卻有明顯修復(fù)細(xì)胞株氧化損傷的作用，顯示該研究為其之后開發(fā)成天然抗氧化物質(zhì)奠定了生化和細(xì)胞學(xué)水平上的理論基礎(chǔ)。