曾偉基，茍偲鈺，曹潔茹，江天久*，畢衛(wèi)紅

1.暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心，水體富營養(yǎng)化與赤潮防治廣東省高校重點實驗室，廣東 廣州 510632 2.燕山大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院,燕山大學(xué)海洋科學(xué)與工程研究院，河北省特種光纖與光纖傳感重點實驗室，河北 秦皇島 066004

引 言

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisoning，PSP)主要指石房蛤毒素(saxitoxin，STX)及其衍生物，是一種神經(jīng)毒素[1]。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的麻痹性貝毒毒素已有 57種，主要由甲藻產(chǎn)生，如膝溝藻屬(Gonyaulax)、亞歷山大藻屬(Alexandrium)、裸甲藻屬(Gymnodinium)等。雙殼貝類濾食產(chǎn)毒甲藻后，PSP可在貝類體內(nèi)累積，人類誤食這類貝類可引起麻痹性貝類毒素中毒。近年來，我國沿海大部分海域頻發(fā)貝類毒素中毒事件[2]，不僅帶來十分嚴(yán)峻的食品安全問題，還給近海養(yǎng)殖和海產(chǎn)加工業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失[3]。

目前PSP的檢測方法有生物檢測法[4]、高效液相色譜法[5]等。這些方法已經(jīng)相對成熟，但仍然存在時效性差、成本高、需要專業(yè)人員操作等缺點。本課題組以前期建立的魚毒性藻類快速識別為基礎(chǔ)[6]，基于微藻的產(chǎn)毒特性與其生長周期[7]和培養(yǎng)條件如光照、溫度，鹽度[8-9]等環(huán)境因子密切相關(guān)，產(chǎn)麻痹性貝毒藻sxt基因與光合作用、碳循環(huán)等具有密切聯(lián)系[10-12]。其中小波函數(shù)特征譜作為原始熒光光譜在小波空間的投影能從多尺度細(xì)化浮游植物的熒光信息更好地凸顯目標(biāo)樣本的特征熒光值，Daubechies(db)小波系具有良好的正交性，雙正交性，緊支撐性且近似對稱等特點[13]，本文利用Db7小波函數(shù)提取實驗藻的特征峰，并通過fisher判別方法建立判別函數(shù)，實現(xiàn)對產(chǎn)麻痹性貝毒藻類快速識別的目的，為麻痹性貝類毒素的高效快速監(jiān)測和管理提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(Hitachi F4600，日本)，OLYMPUS CKX41倒置顯微鏡(OLYMPUS 公司)，光照氣候培養(yǎng)箱(上海一恒公司)，化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 藻種培養(yǎng)

實驗選取微藻微小亞歷山大藻(臺灣株)(Alexandriumminimum，AMSY)、塔瑪亞歷山大藻(大亞灣株)(Alexandriumtamarense，ATDY)、鏈狀裸甲藻(防城港株)(Gymnodiniumcatenatum，GCFC)、塔瑪亞歷山大藻(香港株)(Alexandriumtamarense，ATHK)、鏈狀亞歷山大藻(南海株)(Alexandriumcatenella，ACSY)等5株產(chǎn)麻痹性貝毒藻為實驗微藻和21種非PSTs產(chǎn)毒微藻為對照藻，所選對照藻種分屬甲藻門、綠藻門、硅藻門等7個門，其中，利馬原甲藻(Prorocentrum.lima，CCMP685，PLCZ)由暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院楊維東教授提供，鏈狀裸甲藻產(chǎn)毒株(GCFC01，GCFC)和不產(chǎn)毒藻株(GCH01，GCCZ)由國家海洋局第三海洋研究所顧海峰研究員提供，其他藻種由暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心藻種室提供。利用f/2改良配方配置培養(yǎng)液，人工光照培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)定溫度分別為16，22和28 ℃，光暗循環(huán)L∶D=12 h∶12 h培養(yǎng)實驗藻株。實驗共進(jìn)行兩個批次的培養(yǎng)，每組設(shè)三個平行樣。

1.3 毒素的提取與高效液相色譜檢測

將收集的藻液反復(fù)凍融后，用超聲破碎儀冰浴破碎藻細(xì)胞后低溫離心(4 ℃，7 200 g，10 min)后，取上清液，經(jīng)超濾離心管(10 000道爾頓)離心(4 ℃，7 200 g，10 min)，取超濾液用于毒素HPLC分析。麻痹性貝毒的 HPLC檢測分析參考Band-Schmidt等[15]等修改的HPLC柱后衍生法。

1.4 藻類三維熒光光譜的測量

測量條件：設(shè)置激發(fā)波長400～600 nm，發(fā)射波長650～750 nm，激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫均為10 nm，掃描速度30 000 nm·min-1，掃描間隔為5 nm，信號積分時間0.004 s。每隔一天定時取上述藻液進(jìn)行光譜三維光譜掃描測定。為了盡量避免熒光自吸現(xiàn)象，在掃描前用f/2培養(yǎng)液分別對培養(yǎng)藻液稀釋5，10，20，30，50，70和100倍，用三維熒光儀測定各密度的三維熒光光譜，確定適于三維熒光分析的藻細(xì)胞密度。

1.5 訓(xùn)練集和測試集樣品的選取

將不同溫度下各生長期隔天取得的藻液經(jīng)不同稀釋倍數(shù)后測得的藻類三維熒光光譜分為產(chǎn)毒藻類和非產(chǎn)毒藻類，每類隨機(jī)再分為等數(shù)量的兩組，一組為訓(xùn)練集，用于判別函數(shù)的構(gòu)建，另一組為測試集，用于對判別函數(shù)的識別率測定。

1.6 藻類的三維熒光光譜分析

將掃描所得的文件(格式為*FD3)轉(zhuǎn)化為TXT格式文件，活體藻類的熒光信息為一個二維矩陣(21×11)，對應(yīng)400～600 nm的激發(fā)波長和650～750 nm的發(fā)射波長。去瑞利散射采用Delaunay三角內(nèi)插值法。采用Matlab6.5及Spss17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行最大值歸一化處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對產(chǎn)毒藻生長及產(chǎn)毒影響

由圖1可知，5株產(chǎn)麻痹性貝毒藻類在溫度22 ℃時，生長速率和最大細(xì)胞密度普遍增加，這與Band-Schmidt等在墨西哥灣分離出的Gymnodiniumcatenatum在21和25 ℃生長速率最大的結(jié)果一致[15]。隨著溫度升高，亞歷山大藻單位藻細(xì)胞所產(chǎn)的PSP總量下降，在28 ℃條件下，4株藻在各個生長期單位藻細(xì)胞產(chǎn)PSP總量最低。低溫下，亞歷山大藻藻細(xì)胞的產(chǎn)毒總量升高，與已有的研究結(jié)果一致[14]。精氨酸是合成麻痹性貝類毒素的重要前體物質(zhì)，高溫使得精氨酸用于藻細(xì)胞的生長，所以合成PSP降低[13]?？赡苁且驗榈蜏卦寮?xì)胞的生長下降，細(xì)胞中精氨酸得到積累而用于PSP的合成。對于鏈狀裸甲藻(GCFC)而言，低溫以及高溫的PSP總量均高于22 ℃，這與墨西哥灣發(fā)現(xiàn)的Gymnodiniumcatenatum在16和33 ℃時單位細(xì)胞PSP總量最高，其中產(chǎn)生的C1、C2毒素降低，GTX5、GTX6毒素上升[15]與本實驗結(jié)果一致。說明不同屬的產(chǎn)PSP藻，在不同溫度條件下產(chǎn)毒類型及含量不同，有利于藻類生長的環(huán)境，有毒藻產(chǎn)PSP毒素能力降低。

圖1 溫度對五種產(chǎn)毒藻生長和產(chǎn)毒的影響(a):ATHK;(b):AMSY;(c):ATDY;(d):ACSY;(e):GCFCFig.1 The temperature effect on growth and toxin content of toxic microalgae(a):ATHK;(b):AMSY;(c):ATDY;(d):ACSY;(e):GCFC

2.2 基于Db7小波的浮游植物三維熒光光譜特征提取

微小亞歷山大藻(AMSY)三維熒光光譜進(jìn)行4層層化后得到各層尺度分量(Ca1—Ca4)，如圖2所示，第一層尺度分量受噪聲影響較明顯，難以有效地體現(xiàn)熒光特征，第二、三層分量能較好地避免噪聲干擾，但隨著分層次數(shù)的增加，信號頻率降低，光譜產(chǎn)生了失真。經(jīng)Fisher判別對比發(fā)現(xiàn)，第三層尺度分量(Ca3)判別正確率較高(表1和表2)，因此選擇Ca3-Ex和Ca3-Em的聯(lián)合光譜作為識別特征譜。

圖2 Db7小波對AMSY分解的聯(lián)合熒光光譜圖Fig.2 3D-fluorescence feature extraction of AMSY by Db7 wavelet

表1 Db7小波Ca3分量判別結(jié)果Table 1 The identification result of the algae species with Ca3 scale components of Db7

表2 Db7小波Ca2分量判別結(jié)果Table 2 The identification result of the algae species with Ca2 scale components of Db7

2.3 基于Ca3尺度分量不同溫度條件下產(chǎn)毒藻判別式的構(gòu)建

實驗分別測定了藻類(產(chǎn)毒藻和非產(chǎn)毒藻)在溫度16，22和28 ℃時對數(shù)期的三維熒光光譜特征。產(chǎn)毒藻類各溫度的Ca3三維熒光聯(lián)合光譜，如圖3所示，其中1～40數(shù)據(jù)點是Db7小波分析Ca3激發(fā)光譜(λex=650～750 nm)，41～80數(shù)據(jù)點為Ca3發(fā)射光譜(λem=400～600 nm),比較不同溫度條件下的聯(lián)合熒光光譜圖發(fā)現(xiàn)相對熒光的差異主要集中在Ex為400～425和450～545 nm；Em為715～750 nm，可用這幾段特征光譜表征不同溫度下產(chǎn)麻痹性貝類毒素藻的識別光譜，以此特征譜進(jìn)行Fisher判別。

圖3 不同溫度下對數(shù)期產(chǎn)麻痹性貝毒藻類Ca3聯(lián)合熒光光譜圖(a)：ATHK;(b)：AMSY;(c)：ATDY;(d)：ACSY;(e)：GCFCFig.3 The Ca3 alliance fluorescence spectrum of toxic algae species in exponential phase under different temperatures culture(a)：ATHK;(b)：AMSY;(c)：ATDY;(d)：ACSY;(e)：GCFC

建立的判別函數(shù)如下：

Y1=-130.949+78.758X1+242.195X2+354.102X3-872.739X4-291.105X5-169.714X6+187.348X7+90.945X8+27.478X9-29.249X10-125.974X11+509.928X12+124.248X13-6.539X14+15.802X15-103.205X16-287.275X17-21.752X18+47.053X19+751.713X20

(1a)

Y2=-124.088+167.417X1+137.332X2+212.889X3-725.046X4-217.466X5-132.201X6+149.668X7+90.248X8+39.348X9-55.137X10-157.135X11+490.261X12+201.836X13-30.616X14-2.786X15-170.228X16-189.410X17-28.050X18+54.651X19+707.183X20

(1b)

其中，X1—X20分別代表第1，2，6，11，12，13，15，16，18，20，21，22，23，24，30，33，39，42，60和80數(shù)據(jù)點，數(shù)據(jù)點由費(fèi)希爾線性判別函數(shù)選擇，Y1和Y2分別是麻痹性貝毒藻類和非麻痹性貝毒藻類的分類判別函數(shù)值。經(jīng)F檢驗(55，3047)，顯著水平<0.1，組間差異顯著。對式(1a,1b)進(jìn)行Wilk’s Lambda檢驗=0.283，說明判別組間存在顯著水平差異(p<0.05)，判別式具有統(tǒng)計意義。使用函數(shù)對共95份樣本進(jìn)行判別檢驗時，若Y1>Y2，則該藻有毒；若Y1

表3 藻類Db7小波Ca3分量判別結(jié)果Table 3 The identification result of algae species with Ca3 scale components of Db7 wavelet

3 結(jié) 論

甲藻是光合自養(yǎng)生物，光合作用對麻痹性貝類毒素藻產(chǎn)毒是必需的，光合作用中產(chǎn)生的高能中間產(chǎn)物，是PSP合成的前提。PSP產(chǎn)生的調(diào)節(jié)，與光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)，光合作用調(diào)控產(chǎn)PSP相關(guān)的酶及前體物質(zhì)[16-17]。通過對實驗室在不同溫度條件下培養(yǎng)的5株麻痹性貝毒產(chǎn)毒微藻和21種非麻痹性貝毒產(chǎn)毒微藻的三維熒光光譜進(jìn)行小波分解，選取Db7小波Ca3分量中的第1，2，6，11，12，13，15，16，18，20，21，22，23，24，30，33，39，42，60，80等20個數(shù)據(jù)點構(gòu)建判別函數(shù)，其對麻痹性貝毒藻類和非麻痹性貝毒藻類的判別率為93.3%和93.7%，對測試集綜合判別率為 93.5%，判別效果良好。限于實驗藻種的不足，本實驗選取的產(chǎn)毒藻種類較少，環(huán)境因素變量也較少，且只采用了單一的Db7小波分析方法，后續(xù)可以增加實驗藻種，設(shè)置不同的光照，營養(yǎng)鹽濃度等，擴(kuò)大獲取的數(shù)據(jù)量，有望構(gòu)建出更具代表性的判別模型。此外，隨著神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和圖像識別技術(shù)的發(fā)展，利用微藻的三維熒光光譜可開發(fā)出更為高效快速的產(chǎn)毒藻識別技術(shù)，為我國有毒有害赤潮的管理提供新的技術(shù)支持。