陳夫山，王高敏，吳 越，魯 鵬，吉 喆,*

1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266011 2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西清潔化制漿造紙與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530004

引 言

隨著工業(yè)的迅猛發(fā)展，能源緊缺和環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重，利用木質(zhì)纖維生物質(zhì)開發(fā)清潔高效的可再生能源、大宗化學(xué)品和功能材料已成為當(dāng)前許多國(guó)家的重要發(fā)展戰(zhàn)略和研究熱點(diǎn)。而細(xì)胞壁中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和少量組分相互交聯(lián)構(gòu)成了天然抗降解屏障，嚴(yán)重阻礙化學(xué)藥液和微生物的入侵及降解，限制了木質(zhì)纖維原料的高效轉(zhuǎn)化。因此，對(duì)木質(zhì)纖維原料進(jìn)行預(yù)處理，破除細(xì)胞壁的天然屏障，是實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)低成本轉(zhuǎn)化的必要前提。在預(yù)處理過程中，木質(zhì)纖維細(xì)胞壁的超微結(jié)構(gòu)和主要組分的局部化學(xué)變化，是影響底物轉(zhuǎn)化效率的重要因素。因此，全面了解木質(zhì)纖維細(xì)胞壁的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)特性及其在轉(zhuǎn)化過程中的解構(gòu)機(jī)理是高效利用農(nóng)林生物質(zhì)的基礎(chǔ)。拉曼光譜作為一種對(duì)樣品制備無特殊要求、靈敏度極高的原位分析手段，能快速、無損的對(duì)樣品進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析。尤其與顯微技術(shù)相結(jié)合，能同時(shí)獲得木質(zhì)纖維細(xì)胞壁主要組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)與微區(qū)分布信息，實(shí)現(xiàn)組分動(dòng)態(tài)變化的可視化研究。目前已經(jīng)成為研究木質(zhì)纖維細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的有力工具，并取得一系列重要的研究成果。本文在簡(jiǎn)述拉曼光譜成像原理的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)介紹了生物質(zhì)預(yù)處理過程中拉曼光譜在木質(zhì)纖維細(xì)胞壁主要組分結(jié)構(gòu)解析、纖維素和木質(zhì)素局部化學(xué)動(dòng)態(tài)變化等方面的研究進(jìn)展，為木質(zhì)纖維生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化利用中細(xì)胞壁微觀結(jié)構(gòu)的原位分析提供了借鑒。

1 拉曼光譜成像原理

拉曼光譜是當(dāng)分子受到激發(fā)光的照射后，分子與入射光子碰撞發(fā)生能級(jí)躍遷，進(jìn)而產(chǎn)生的一種非彈性散射光譜。由于分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)不同，拉曼光譜的譜線數(shù)目、位移大小和特征峰強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生改變。通過分析拉曼特征峰的高度、寬度、面積、頻移和形狀，可以獲得樣品中元素、成分、分子取向、結(jié)晶狀態(tài)以及應(yīng)力、應(yīng)變狀態(tài)等重要信息。

隨著研究技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，拉曼光譜還可以與顯微技術(shù)相結(jié)合，以達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行同步結(jié)構(gòu)分析和空間定位的目的，該技術(shù)即為共聚焦顯微拉曼成像(CRM)。CRM成像時(shí)，顯微鏡會(huì)將激發(fā)光聚焦在數(shù)微米的樣品表面，設(shè)定采集時(shí)間和掃描步距，通過精準(zhǔn)的馬達(dá)帶動(dòng)定位平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行光柵掃描，在特定的樣品范圍內(nèi)就會(huì)獲得一系列拉曼光譜。CRM則會(huì)以被研究區(qū)域的拉曼特征譜峰為基礎(chǔ)，基于特定拉曼峰的位移、強(qiáng)度和半峰寬等信息繪制成一幅偽彩色圖像，實(shí)現(xiàn)樣品的微區(qū)成分和空間分布分析。CRM成像的本質(zhì)是一種基于指紋譜學(xué)數(shù)據(jù)分析的物質(zhì)結(jié)構(gòu)和組分成像技術(shù)，該技術(shù)可進(jìn)一步結(jié)合數(shù)學(xué)分析算法，實(shí)現(xiàn)樣品微區(qū)分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、結(jié)晶度和應(yīng)變應(yīng)力等更深層次的信息的挖掘。

2 木質(zhì)纖維細(xì)胞壁主要組分拉曼信號(hào)歸屬

木質(zhì)纖維細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。纖維素是由β-D-吡喃型葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接的線型高分子化合物，具有結(jié)晶型和無定型兩種結(jié)構(gòu)(表1)。根據(jù)已有報(bào)道，纖維素的三個(gè)典型特征峰位于380，1 098和2 890 cm-1，分別對(duì)應(yīng)吡喃環(huán)CCC的對(duì)稱彎曲振動(dòng)、糖苷鍵COC伸縮振動(dòng)、主鏈葡萄糖環(huán)和側(cè)鏈亞甲基上的CH及CH2的伸縮振動(dòng)[1]。歸屬于纖維素分子的拉曼特征峰的強(qiáng)度多數(shù)與入射激光偏振方向有關(guān)，在1 098 cm-1處尤為顯著。因此，采用偏振入射光掃描，可以同時(shí)測(cè)定纖維素的空間分布和分子取向特征。

表1 細(xì)胞壁主要組分拉曼特征峰歸屬Table 1 Assignment of Raman bands for the main components in cell walls

半纖維素是由木糖、甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖等多種糖基單元構(gòu)成的帶有支鏈的異質(zhì)性多糖。由于半纖維素和纖維素的化學(xué)鍵型類似，因此二者的特征峰多數(shù)相互重疊，難以區(qū)分。但已有研究證實(shí)，半纖維素的HCC、HCO伸縮振動(dòng)在890 cm-1處信號(hào)顯著，可以作為半纖維素的典型拉曼特征峰。此外，Hemmelsbach等對(duì)亞麻纖維的拉曼光譜進(jìn)行了詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)475～515和800～870 cm-1譜帶可以用于識(shí)別半纖維素木聚糖[2]。

木質(zhì)素是由苯基丙烷結(jié)構(gòu)單元通過碳碳鍵和醚鍵連接構(gòu)成的三維空間網(wǎng)狀芳香族化合物。木質(zhì)素的典型拉曼特征峰位于1 600和1 660 cm-1，分別歸屬于芳香環(huán)骨架的彎曲振動(dòng)和與苯環(huán)共軛的酮羰基伸縮振動(dòng)，來源于松柏醇/紫丁香醇或松柏醛/紫丁香醛結(jié)構(gòu)單元[3]。

3 預(yù)處理過程中細(xì)胞壁主要組分分布變化研究

木質(zhì)纖維細(xì)胞壁是以纖維素微纖絲為骨架，半纖維素和木質(zhì)素為膠黏劑的多層同心圓環(huán)結(jié)構(gòu)，由外到內(nèi)依次分為細(xì)胞角隅(cell corner，CC)、復(fù)合胞間層(compound middle lamellar,CML)、初生壁(primary wall,PW)和次生壁(secondary wall,SW：包括S1，S2 和S3)。學(xué)者們[4]借助CRM研究發(fā)現(xiàn)纖維素和木質(zhì)素在細(xì)胞壁中的分布呈不均一性，木質(zhì)素的濃度分布規(guī)律為：CC>CML>S2，而纖維素的分布特征與木質(zhì)素恰好相反。

由于細(xì)胞壁復(fù)雜的超微結(jié)構(gòu)和組分分布不均一，形成了天然的抗降解屏障阻礙了生物質(zhì)各組分的高效利用，因此需要選擇經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)保的預(yù)處理方法對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理以實(shí)現(xiàn)組分清潔分離和高效轉(zhuǎn)化。而全面解析預(yù)處理過程中細(xì)胞壁微觀結(jié)構(gòu)和主要組分微區(qū)分布變化，是解譯生物質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制的重要課題。CRM的迅猛發(fā)展，為研究學(xué)者從細(xì)胞及亞細(xì)胞水平探究預(yù)處理誘導(dǎo)細(xì)胞壁主要組分動(dòng)態(tài)溶解機(jī)制提供了有效路徑，并在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化領(lǐng)域取得了一系列重要的研究成果。

3.1 稀酸預(yù)處理

稀酸預(yù)處理主要通過溶解半纖維素和少量木質(zhì)素來打破細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，從而增加纖維素的酶水解效率。在預(yù)處理過程中組分的降解和新聚合物的生成，導(dǎo)致拉曼特征峰發(fā)生偏移或重疊，難以準(zhǔn)確歸屬，Jin等[5]通過模型物參比確認(rèn)1 330和1 272 cm-1特征峰分別對(duì)應(yīng)G型和S型木質(zhì)素，結(jié)合拉曼信號(hào)強(qiáng)度變化和積分成像，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)了酸性亞氯酸鈉預(yù)處理過程中不同分子結(jié)構(gòu)木質(zhì)素的溶出機(jī)制。在奇崗表皮和髓心組織稀酸預(yù)處理過程中，Ji等[6]通過對(duì)比2 886，1 599和1 173 cm-1拉曼信號(hào)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)髓心中木質(zhì)素和羥基肉桂酸的溶出能力較外皮更強(qiáng)，且兩組分溶出速率呈正相關(guān)，拉曼成像進(jìn)一步證實(shí)木質(zhì)素會(huì)凝聚為球狀顆粒在細(xì)胞壁內(nèi)發(fā)生遷移、重分布，影響纖維素酶水解效率。這些研究多采用二維成像技術(shù)，為更精準(zhǔn)地呈現(xiàn)稀酸預(yù)處理過程中楊木細(xì)胞壁三維結(jié)構(gòu)變化，Zoghlami等[7]在拉曼成像分析中引入了3D分割技術(shù)，為研究細(xì)胞壁主要組分連接鍵的斷裂和溶出機(jī)制提供了新的方法。

3.2 水熱預(yù)處理

水熱預(yù)處理一般在130～220 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行，在反應(yīng)過程中不添加任何化學(xué)試劑和催化劑就可以有效脫除半纖維素。由于絕大多數(shù)的半纖維素特征峰與纖維素重疊，所以很難利用CRM直接定位半纖維素的分布，因此已有報(bào)道多數(shù)利用2 889 cm-1碳水化合物信號(hào)峰，結(jié)合化學(xué)或免疫標(biāo)記技術(shù)間接探究半纖維素的微區(qū)分布特征。但是，Ma等[8]利用CRM對(duì)874～934 cm-1積分成像得到了楊木半纖維素動(dòng)態(tài)分布圖，分析發(fā)現(xiàn)水熱預(yù)處理過程中CML和S2層的聚木糖率先溶出，而聚甘露糖卻相對(duì)穩(wěn)定；延長(zhǎng)預(yù)處理至40 min，CC，CML和S2層中木質(zhì)素的溶出率分別為22.5%，45.9%和71.0%，表明木質(zhì)素由細(xì)胞壁各亞層的脫除速率呈不均一性。

3.3 堿性預(yù)處理

堿性預(yù)處理主要通過斷裂木質(zhì)素和半纖維素之間的化學(xué)鍵，脫除大量木質(zhì)素和部分半纖維素以增大纖維素底物的可及性，進(jìn)而提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率的方法。在稻桿的NaOH預(yù)處理過程中，Li等[9]利用主成分分析法對(duì)CRM全光譜數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)了指紋譜帶的定性定量分類，又結(jié)合全約束最小二乘法(FCLS)對(duì)光譜進(jìn)行解混分析，得到了主要組分的分布成像，與單光譜成像技術(shù)相比，該方法從定性、定量和定位等多角度更精準(zhǔn)地揭示了堿預(yù)處理提高稻稈厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)率的機(jī)理。Huang等[10]利用CRM研究了水熱和稀堿兩段預(yù)處理過程中竹材纖維的變化，發(fā)現(xiàn)纖維素、木質(zhì)素和羥基肉桂酸在不同類型細(xì)胞壁的不同形態(tài)學(xué)區(qū)域的溶出速率呈不均一性，三者協(xié)同影響纖維素的酶水解效率。

3.4 其他

除酸性、堿性處理外，CRM也被廣泛應(yīng)用于有機(jī)溶劑、離子液體、低共熔體系預(yù)處理過程的監(jiān)測(cè)。Li等[11]用γ-戊內(nèi)酯/水/酸體系對(duì)桉樹進(jìn)行預(yù)處理，通過化學(xué)組分拉曼分布變化研究，證實(shí)提高H2SO4濃度可以促進(jìn)CML中木質(zhì)素和半纖維素的脫除。Li等[12]在微波輔助低共熔溶劑降解生物質(zhì)細(xì)胞壁過程中，分析各形態(tài)學(xué)區(qū)域的拉曼信號(hào)發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素的溶出速率為：SW>CML>CC。綜上所述，利用CRM可以快速、原位獲取預(yù)處理過程中細(xì)胞壁各形態(tài)學(xué)區(qū)域的組分(纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和羥基肉桂酸)分布特征，從細(xì)胞及亞細(xì)胞水平揭示預(yù)處理解構(gòu)細(xì)胞壁的機(jī)制。

4 拉曼光譜的分析方法

木質(zhì)纖維細(xì)胞壁是由多種高分子聚合物構(gòu)成的一種多層納米復(fù)合材料。通過共聚焦拉曼掃描可獲得海量光譜數(shù)據(jù)，而傳統(tǒng)的光譜分析方法主要根據(jù)研究人員經(jīng)驗(yàn)，抽取特定空間區(qū)域的平均光譜后，進(jìn)行單光譜成像或僅選擇需要的特征峰進(jìn)行分析。該方法存在以下顯著缺陷：(1)數(shù)據(jù)處理結(jié)果人為誤差較大，且費(fèi)力費(fèi)時(shí)；(2)大量有效信息被遺漏；(3)分析結(jié)果精準(zhǔn)性、可重復(fù)性差。因此，結(jié)合生物質(zhì)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建海量光譜數(shù)據(jù)全自動(dòng)分類分析方法至關(guān)重要。本文主要介紹了主成分聚類分析法和頂點(diǎn)成分分析法。

4.1 主成分聚類分析法

主成分分析法是一種統(tǒng)計(jì)方法，可以在盡可能保留原有信息的基礎(chǔ)上將高維空間的樣本映射到低維的主成分空間中，使數(shù)據(jù)矩陣簡(jiǎn)化，降低維數(shù)，被降低維數(shù)后的數(shù)據(jù)又可以進(jìn)行聚類分析，將研究對(duì)象按照諸多特性的相似程度進(jìn)行逐漸聚合，最終按照類別的綜合性質(zhì)歸類，從而完成聚類分析的過程。陳勝等[13]利用主成分分析法對(duì)馬尾松多種組分進(jìn)行了分類識(shí)別，其中木質(zhì)素(1 597 cm-1)和碳水化合物(2 890 cm-1)兩大主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率高達(dá)94.61%。通過聚類分析可以將拉曼光譜分為四類，分別對(duì)應(yīng)細(xì)胞壁的CC，CML，SW和細(xì)胞腔(CL)，經(jīng)算數(shù)平均后可以得到細(xì)胞壁各形態(tài)學(xué)區(qū)域的平均拉曼光譜(圖1)。并利用該方法分析了楊木稀酸和離子液體預(yù)處理過程中主要組分的分布變化[14]，這比傳統(tǒng)的手動(dòng)選定細(xì)胞區(qū)域獲得少量光譜平均數(shù)據(jù)的方法更加準(zhǔn)確。主成分聚類分析法可以壓縮數(shù)據(jù)、準(zhǔn)確提取出不同形態(tài)區(qū)域的平均拉曼光譜，并揭示細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分之間的內(nèi)在聯(lián)系，為進(jìn)一步地精細(xì)區(qū)分不同細(xì)胞壁層之間的化學(xué)差異奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖1 未處理和稀酸預(yù)處理馬尾松細(xì)胞壁拉曼光譜主成分得分圖(a，d)；聚類分析結(jié)果(b，e)；各壁層平均拉曼光譜(c，f)Fig.1 PCA scores plot of Raman spectra of Pinus cell wall untreated and pretreated by dilute acid (a,d);The cluster results (b,e);Average Raman spectra of each layers before preprocessing(c,f)

4.2 頂點(diǎn)成分分析法

頂點(diǎn)成分分析是一種多元曲線分解方法，它以交互的方式將數(shù)據(jù)投影到所識(shí)別的正交子空間中，通過反復(fù)迭代從存在混合像元的高光譜圖像中提取出場(chǎng)景的基本組成成分，即提取端元。它具有光譜分析全自動(dòng)以及端元提取速度快的優(yōu)點(diǎn)，是目前分析木質(zhì)纖維細(xì)胞壁拉曼光譜的有效方法之一。Notburga Gierlinger[15]在分析云杉細(xì)胞壁的拉曼譜圖時(shí)，根據(jù)細(xì)胞壁各層中主要成分分子結(jié)構(gòu)的差異性，采用頂點(diǎn)成分分析算法將細(xì)胞壁分為四個(gè)端元，分別對(duì)應(yīng)：CC和CML、S3和紋孔膜、S2、CL[圖2(a)]，每個(gè)端元的豐度圖均詳細(xì)呈現(xiàn)了主要組分的空間分布特征[圖2(b—e)]，通過提取四個(gè)端元的平均拉曼光譜可以進(jìn)一步獲取不同形態(tài)學(xué)區(qū)域中成分含量和分子結(jié)構(gòu)信息[圖2(f—g)]。該方法較傳統(tǒng)光譜分析法，開創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)S3和紋孔膜的微觀結(jié)構(gòu)特征明顯區(qū)別于S2和CML層：1)纖維素微纖絲與細(xì)胞軸趨于垂直，與S2層中較小的微纖絲角差異較大；(2)該層的木質(zhì)素特征峰由1 599 cm-1偏移至1 603 cm-1，說明S3和紋孔膜具有類似的木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu)，但與S2和CML層顯著不同。此外，作者借助頂點(diǎn)成分分析法解析拉曼光譜，進(jìn)一步證實(shí)S2層由于木質(zhì)化不均一性形成了連續(xù)薄層狀結(jié)構(gòu)。頂點(diǎn)成分分析法為深入解析拉曼光譜，研究木質(zhì)纖維細(xì)胞壁的精細(xì)結(jié)構(gòu)提供了新的途徑。

圖2 基于頂點(diǎn)成分分析的云杉橫切面(38 μm×38 μm)的拉曼端元圖像與光譜(1 800～300 cm-1)Fig.2 Raman images of spruce wood cross sections (38 μm×38 μm)based on VCA analysis with four endmembers using the wavenumber region from 1 800 to 300 cm-1

5 展 望

拉曼光譜顯微成像技術(shù)具有制樣簡(jiǎn)單、掃描快速、空間分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，目前已發(fā)展為木質(zhì)纖維細(xì)胞壁研究領(lǐng)域的重要工具，它可以在原位狀態(tài)下獲得細(xì)胞壁聚合物大分子的結(jié)構(gòu)組成、空間分布和分子取向等信息，尤其在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞壁微觀結(jié)構(gòu)變化的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，并取得了豐碩的研究成果。然而，拉曼光譜作為一種新興技術(shù)，還存在一定的局限性，比如大部分拉曼光譜儀采用背散射采集方式獲取拉曼信號(hào)，一般只能獲得樣品表面的信息，而且光譜信號(hào)噪聲大。此外，木質(zhì)纖維生物質(zhì)樣品大多具有自發(fā)熒光性，會(huì)干擾拉曼信號(hào)的采集從而降低光譜質(zhì)量與數(shù)據(jù)分析，因此需要借助多種光譜分析方法對(duì)拉曼光譜進(jìn)行深度剖析以提取更有價(jià)值的信息。近年來，拉曼光譜技術(shù)迅猛發(fā)展，與多種光譜和光譜成像技術(shù)相輔相成，在生物煉制、生物質(zhì)化工等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛能。