趙曉曉, 胡 昊, 趙雯思,3, 劉 萍, 譚敏佳,3*

(1. 南京中醫(yī)藥大學新中藥學院, 江蘇 南京 210023; 2. 中國科學院上海藥物研究所新藥研究國家重點實驗室, 上海 201203; 3. 中國科學院大學, 北京 100049)

蛋白質C端及其翻譯后修飾(PTMs,如脂質化、乙?；?、磷酸化等)參與多種生物學過程,如蛋白質定位、蛋白質相互作用、維持蛋白質穩(wěn)定性等[1-4]。蛋白質C端異常會引起代謝性疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等[5-8]多種疾病。因此,蛋白質C端的系統(tǒng)性表征對于生物學機制的解析具有重要意義。

盡管“鳥槍法”蛋白質組學在全蛋白質組分析方面有很大優(yōu)勢,但由于C端肽段占比少、離子化效率低,蛋白質C端的分析效率仍比較低。近年來,基于“鳥槍法”蛋白質組學發(fā)展形成的“蛋白質C端組學(C-terminomics)”技術使系統(tǒng)表征蛋白質C端成為可能。該技術主要有兩種策略:1)通過對蛋白質C端羧基進行選擇性標記并進行親和富集,直接捕獲蛋白質C端的正向富集策略[9-11]; 2)通過化學衍生化和多種分離技術去除蛋白N端和內部肽段,進一步洗脫獲得蛋白質C端的反向富集策略[12,13]。后者不僅可以富集普通C端肽段,還可同時富集蛋白質C端α-COOH上含有PTMs的C端肽段。尤其是利用基于聚合物的反向富集策略[14]進行蛋白質C端的研究,可以實現(xiàn)多個樣本平行操作,大大提高了樣本的制備通量,并且不需專門的儀器設備,在普通生化實驗室即可完成,應用范圍更加廣泛。

近年來,研究人員基于聚合物富集策略,發(fā)展了多種相關方法,通過不斷優(yōu)化,改善了C端肽段的鑒定深度[15-20]。Zhang等[18]通過胰蛋白酶(trypsin)切割精氨酸殘基C端(ArgC型酶切)的方式,獲得了369個蛋白質C端;Du等[16]通過重組賴氨酰肽鏈內切酶(LysC)切割賴氨酸殘基C端(LysC型酶切)的方式,獲得了781個蛋白質C端;在本課題組前期LAACTer策略研究[15]中,利用胰蛋白酶鏡像酶(LysargiNase)切割賴氨酸和精氨酸殘基N端(LysN/ArgN型酶切),獲得了834個蛋白質C端。這些方法使用不同的特異性酶切方式,因此理論上對C端肽段有著各自獨特的鑒定范圍,具有一定的互補性。而相比之下,基于精氨酸切割(Arg型酶切)的方法對C端肽段的鑒定深度仍有待提高。隨著蛋白質C端在疾病中的作用越來越受到關注,為了鑒定一些重要的蛋白質C端,基于Arg型酶切的蛋白質C端組學方法在鑒定深度上亟待進一步突破。

為解決這一問題,本研究對基于Arg型酶切方法進行了優(yōu)化和評估。建立了基于“V型”過濾裝置的“一鍋法”富集平臺,并對蛋白水平乙?；姆磻獥l件進行了系統(tǒng)性的優(yōu)化。提出了過量有機小分子可能是聚合物反向富集策略中干擾C端肽段鑒定的關鍵因素,針對性地優(yōu)化了基于固相萃取槍頭膜片過濾柱(StageTip)的樣品分離過程,并和已報道的研究結果進行了對比和評估;探索了使用不同酶切方式與不同肽段衍生化修飾的組合對蛋白質C端鑒定數(shù)目和種類的影響,旨在利用“LysargiNase酶切+肽段N端乙?；辈呗赃M一步擴大蛋白質C端的鑒定范圍。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

JY92-IIN細胞粉碎機購于寧波新芝科技股份有限公司;5424R高速離心機購于德國Eppendorf AG公司;SPD111V-230真空離心濃縮儀、Q-Exactive質譜、Orbitrap Fusion質譜、納升液相色譜EASY-nLC 1000購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

蛋白酶抑制劑購于瑞士Roche公司;N-羥基琥珀酰亞胺乙酸酯(Ac-NHS)和乙醇胺(EA)購于北京百靈威科技有限公司;LysargiNase和胰蛋白酶購于北京華利世科技有限公司;氯化鈣(CaCl2)、鹽酸胍(GnHCl)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N-(3-(二甲基氨基)丙基)-乙基二亞胺鹽酸(EDC)購于國藥集團化學試劑有限公司;4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、三氟乙酸(TFA)、聚丙烯基胺(PAA)、甲醛(HCHO)、甲酸銨(AF)均購于美國Sigma公司。Durashell C18填料購于天津博納艾杰爾科技有限公司;Empore C18固相萃取膜片購于美國3M公司;Amicon Ultra-0.5 filters(10 kDa 截止)超濾管和ZipTip C18脫鹽柱購于美國Millipore公司。

1.2 蛋白質提取與還原烷基化

將人HEK 293T細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中。向獲得的濕細胞沉淀中加入10倍體積裂解液(3 mol/L GnHCl、100 mmol/L HEPES、2%(質量分數(shù))蛋白酶抑制劑,pH 7.0),冰上靜置30 min后使用細胞破碎儀進行超聲處理,以15 000 r/min離心10 min,獲取上清。按照BCA方法進行蛋白質濃度定量。加入終濃度為5 mmol/L的DTT,于56 ℃反應30 min,最后加入終濃度為15 mmol/L的IAA,室溫避光反應30 min。

1.3 蛋白水平乙?；?/h3>

取100 μg還原烷基化后的樣本,用3 mol/L GnHCl和100 mmol/L HEPES，pH 7.0的緩沖液將樣本稀釋至1 μg/μL。然后加入終濃度為5 mmol/L的Ac-NHS(pH 7.0),室溫反應30 min,重復反應3次。再加入終濃度為500 mmol/L的氨水(NH3·H2O),室溫反應15 min。按蛋白質與酶的質量比為50∶1添加胰蛋白酶,調pH 8.0, 于37 ℃孵育16 h。樣品轉干后,取10 μg樣本用ZipTip C18脫鹽柱進行除鹽。每組樣本進行2次技術重復。

1.4 蛋白水平酰胺化

取300 μg還原烷基化后的樣本,置于0.5 mL超濾管中,加入緩沖液A(100 mmol/L HEPES、3 mol/L GnHCl, pH 7.0)至500 μL,在11 600 r/min的轉速下超濾至50 μL,重復兩次。使用緩沖液A調節(jié)樣本質量濃度至1 μg/μL,加入終濃度為5 mmol/L的Ac-NHS,室溫反應30 min,重復反應3次。再加入緩沖液B(1 mol/L EA、2 mol/L GnHCl、0.2 mol/L MES, pH 6.0)至500 μL,在11 600 r/min的轉速下超濾至50 μL。使用緩沖液B調節(jié)樣本質量濃度至1 μg/μL,加入終濃度為20 mmol/L的NHS和100 mmol/L的EDC,于37 ℃反應2 h。再次補加相同終濃度的EDC,反應2 h。

1.5 酶切消化

在上述樣本中加入胰蛋白酶酶切體系(20 mmol/L HEPES、0.4 mol/L GnHCl, pH 8.0)至500 μL,在11 600 r/min的轉速下超濾至50 μL,重復3次。使用酶切體系調節(jié)樣本質量濃度至1 μg/μL,按蛋白質與酶的質量比為50∶1添加胰蛋白酶,于37 ℃孵育16 h。再按蛋白質與酶的質量比為100∶1添加胰蛋白酶,于37 ℃孵育4 h。

在研究不同酶切方式和不同肽段衍生化修飾的組合對C端肽段鑒定數(shù)目和種類影響的實驗中,引入LysargiNase代替胰蛋白酶進行酶切消化,其酶切體系為20 mmol/L HEPES和10 mmol/L CaCl2, pH 8.0,其他條件與胰蛋白酶酶切處理方式相同。

1.6 肽段水平衍生化修飾與蛋白質C端富集

對胰蛋白酶酶切消化產生的肽段分別進行乙?；投谆磻?。LysargiNase酶切后的樣本進行同樣的修飾反應。對于乙酰化修飾,加入終濃度為5 mmol/L的Ac-NHS, pH 7.0,室溫反應30 min,重復反應3次;對于二甲基化修飾,加入終濃度為20 mmol/L的HCHO和10 mmol/L的NaBH3CN,調節(jié)pH 6.0,于37 ℃反應2 h,再次加入相同濃度的HCHO和NaBH3CN，反應2 h。每組樣本進行2次技術重復。

將反應完畢后的樣本在SPD111V-230真空離心濃縮儀中濃縮至150 μL,各自加入150 μL 2 mol/L PAA、50 μL乙腈以及終濃度為20 mmol/L的NHS和100 mmol/L的EDC,于37 ℃反應2 h,補加相同終濃度的EDC，反應2 h。在11 600 r/min的轉速下離心收集濾液,加入15%(v/v)乙腈水溶液至300 μL,相同轉速下離心收集濾液,重復兩次。將濾液合并轉干凍存。

1.7 基于StageTip的樣品分離

配制堿性溶液體系:溶液A為98%(v/v)乙腈水溶液(含5 mmol/L AF),溶液B為5 mmol/L AF水溶液(pH 10.0)。

堿性StageTip柱的制備:將Empore C18固相萃取膜片置于200 μL槍頭底部,稱取6 mg Durashell C18填料,用200 μL溶液B混勻,加入上述槍頭內,以1 000 r/min離心5 min,制成StageTip。然后加入200 μL溶液B,以1 000 r/min離心5 min洗滌StageTip柱,再加入溶液A-溶液B (1∶1, v/v)的混合液200 μL,以1 000 r/min離心5 min洗滌StageTip柱,最后加入200 μL溶液A,以1 000 r/min離心10 min洗滌StageTip柱。

基于StageTip柱的樣品分離:將胰蛋白酶酶切后進行二甲基化修飾的樣本用200 μL溶液A溶解后,加入堿性StageTip柱,以1 000 r/min離心10 min,使樣本充分結合在StageTip柱中的Durashell C18填料上。最后使用5%、10%、15%、20%、25%、30%和80%(v/v)的乙腈水溶液(均含0.1%TFA)各200 μL進行洗脫,將收集的濾液轉干后,用ZipTip C18脫鹽柱進行除鹽。

1.8 液相色譜-質譜分析

1.8.1乙?；瘍?yōu)化實驗

EASY-nLC 1000高效液相色譜串聯(lián)Q-Exactive用于乙?；瘍?yōu)化實驗中的質譜檢測。自制C18(粒徑3 μm,孔徑9 nm,美國Dikma Technologies公司)毛細管柱(100 mm×75 μm)。流動相A:2%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA);流動相B:90%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA);流速:300 nL/min。梯度洗脫程序:0～50 min, 5%B～28%B; 50～53 min, 28%B～48%B; 53～56 min, 48%B～80%B; 56～60 min, 80%B。將1.3節(jié)中除鹽轉干后的樣本溶于10 μL流動相A中, 以15 000 r/min高速離心,取4.2 μL上清進行上樣分析。

Q-Exactive質譜參數(shù)為:一級分辨率為70 000(m/z200);一級自動增益控制(AGC)為1×106;二級自動增益控制為1×106;最大注射時間為60 ms;掃描范圍為m/z350～1 300;電荷狀態(tài)2～5價;碰撞歸一化能量為30%;動態(tài)排除時間60 s;數(shù)據(jù)依賴采集模式為“TOPN”(N=16)。

1.8.2蛋白質C端富集實驗

EASY-nLC 1000高效液相色譜-串聯(lián)Orbitrap Fusion用于蛋白質C端富集實驗中的質譜檢測。流速300 nL/min。梯度洗脫程序:0～13 min, 5%B～7%B; 13～33 min, 7%B～10%B; 33～88 min, 10%B～25%B; 88～110 min, 25%B～45%B; 110～113 min, 45%B～80%B; 113～120 min, 80%B。將1.7節(jié)中除鹽轉干后的樣本溶于10 μL流動相A中,以15 000 r/min高速離心,取4.2 μL上清進行上樣分析。

Orbitrap Fusion質譜參數(shù)為:一級分辨率為120 000(m/z200);一級自動增益控制(AGC)為5×105;二級自動增益控制為7×103;最大注射時間為50 ms;掃描范圍為m/z300～1 300;電荷狀態(tài)1～6價;碰撞歸一化能量為32%;動態(tài)排除時間60 s;數(shù)據(jù)依賴采集模式為“TOP speed”(循環(huán)時間3 s)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

質譜產生的原始數(shù)據(jù)由可以調用Mascot 2.3.0搜索引擎的Proteome Discoverer 2.2按照UniProt(homosapiens)數(shù)據(jù)庫(版本2018.7, 95 128條序列)進行搜庫。

乙酰化優(yōu)化實驗中,統(tǒng)計乙?；瘶擞浶实乃褞靺?shù)設置:酶切方式為胰蛋白酶,最大漏切位點為3個,固定修飾為Cys還原烷基化,可變修飾為Lys/Ser/Thr/Tyr乙酰化、蛋白質N端乙?；?、Met氧化。統(tǒng)計蛋白質C端數(shù)目的搜庫參數(shù)設置如下:酶切方式ArgC,最大漏切位點為2個,固定修飾為Cys還原烷基化、Lys乙?；?可變修飾為蛋白質N端乙?；et氧化。其他參數(shù)均為一級離子質量偏差20 ppm(10-6),二級碎片離子的質量偏差0.02 Da。

蛋白質C端富集實驗中,搜庫參數(shù)設置如下:“胰蛋白酶酶切+二甲基化”策略酶切方式為ArgC, “LysargiNase酶切+二甲基化”策略酶切方式為ArgN,兩者的固定修飾均為Met還原烷基化、Asp/Glu乙醇胺修飾、Lys乙酰化、肽段N端二甲基化?！耙鹊鞍酌该盖?乙?；辈呗悦盖蟹绞綖锳rgC, “LysargiNase酶切+乙?；辈呗悦盖蟹绞綖锳rgN,兩者的固定修飾均為Met還原烷基化、Asp/Glu乙醇胺修飾、Lys乙?；?、肽段N端乙?；?。以上4種策略中,可變修飾均為蛋白質N端乙醇胺修飾、Met氧化,最大漏切位點為2個,肽段一級離子的質量偏差設為10 ppm,碎片離子的質量偏差設為0.02 Da。

數(shù)據(jù)篩選標準:肽譜匹配、肽段及蛋白水平錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.01,離子分數(shù)(ion score)≥20;乙?；瘶擞泴嶒炛?通過磷酸化修飾功能節(jié)點(ptmRS)≥0.75的標準篩選總肽譜匹配(peptide-spectrum matches, PSMs)計算標記效率。

2 結果與討論

2.1 基于“V型”過濾裝置的“一鍋法”樣品制備流程的建立

基于聚合物的蛋白質C端組學工作流程涉及多個化學衍生化步驟(見圖1a),過量的化學試劑能夠保證反應完全進行,但可能也會影響后續(xù)反應。為了避免反應之間的交叉干擾,通過對Zhang等[18]鑒定蛋白質C端實驗流程的改進,建立了“一鍋法”的富集平臺(見圖1b),即在還原烷基化后立即應用超濾輔助樣品制備方法(FASP[21])來取代猝滅步驟,從而避免過量的淬滅劑(如二硫蘇糖醇或半胱氨酸等)對下一步乙?；磻挠绊?。

圖 1 (a)基于聚合物的反向富集流程及(b)C端肽段的“一鍋法”富集平臺Fig. 1 (a) Workflow of polymer-based negative enrichment and (b) platform of one-pot enrichment of C-terminal peptides

圖 2 (a～d)氨基酸殘基上的乙酰化標記效率以及(e)PSMs與(f)蛋白質C端的鑒定數(shù)目Fig. 2 (a-d) Acetylation labeling efficiencies on amino acid residues and numbers of identified (e) peptide-spectrum matches (PSMs) and (f) protein C-terminiA: 10 mmol/L Ac-NHS, pH 8.0; B: 10 mmol/L Ac-NHS, pH 7.0; C: 5 mmol/L Ac-NHS, pH 7.0. The experiments in entry Ref. [18], [15], and [24] were performed according to the conditions of the original study.

為了提高樣本的制備效率,嘗試使用濾膜面積更大的“V型”過濾裝置代替原本的平底過濾裝置。當樣本體積較大(如500 μL),使用原本的平底過濾裝置,單次溶劑交換過程需要40～50 min,并且濃縮過程中產生的絮狀物或沉淀容易造成濾膜堵塞。而使用“V型”過濾裝置,單次溶劑交換過程僅需約10 min,從而將整個樣品制備時間縮短了4～5 h。并且濾膜位于裝置側壁,樣本制備過程中不易發(fā)生堵塞。對于200～400 μg的蛋白質組,兩種裝置可以提供相似的回收率[21,22]。因此,以下整個研究過程中使用基于“V型”過濾裝置的“一鍋法”樣品制備流程。

2.2 乙?；磻獥l件優(yōu)化

蛋白質水平賴氨酸乙?；磻潜狙芯恐匾牟襟E之一,絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基上的副反應會導致較高的樣品復雜度和錯誤鑒定率。為了降低副反應的發(fā)生并提高肽段的鑒定數(shù)目,考慮從以下幾個方面對乙?；磻獥l件進行系統(tǒng)性優(yōu)化:1)通過減少反應中Ac-NHS的用量以降低副反應的標記效率;2)根據(jù)以往的報道,蛋白水平乙酰化標記均是在pH 8.0的條件下進行,而堿性條件中組氨酸可能會促進相鄰的羥基與Ac-NHS發(fā)生反應[23],嘗試調節(jié)反應的pH值,以減少副反應的干擾;3)通過在乙?；瘶擞浐蠹尤虢K濃度為500 mmol/L的NH3·H2O進行淬滅反應,在堿性較強的條件下逆轉副反應的標記。基于以上思路,在進行乙?；磻獣r,分別加入終濃度為10 mmol/L的Ac-NHS(pH 8.0)(條件A)、終濃度為10 mmol/L的Ac-NHS(pH 7.0)(條件B)和終濃度為5 mmol/L的Ac-NHS(pH 7.0)(條件C)。結果表明,在條件B和條件C中,通過將反應pH調至7.0,并使用NH3·H2O進行淬滅反應,能夠在保持Lys較高標記效率(>98%)(見圖2a)的同時,大幅降低副反應的發(fā)生(<4%)(見圖2b～2d)。由于條件C的Ac-NHS用量相對較少,因此后續(xù)實驗選擇條件C作為乙?；揎椀臈l件。

此外,與以往報道[15,18,24]中將Ac-NHS作為乙?；揎椩噭┑姆桨高M行了比較(見圖2b～2d)。結果顯示,LAACTer方法[15]和Zhang等[18]方法中乙?；母狈磻獦擞浶示^高,尤其是Ser的標記效率高達8%～12%。Zhou等[24]方法中乙?；母狈磻獦擞浶瘦^低,但PSMs數(shù)目明顯減少(見圖2e)。并且使用條件C進行乙?；磻?種已報道的方案多鑒定到約15%的PSMs,比Zhou等[24]的方法多鑒定到約50%的蛋白質C端(見圖2f)。優(yōu)化后的條件能夠使副反應的標記效率降到最低,且不會影響肽段的鑒定。值得注意的是,這一優(yōu)化不僅有助于C端肽段的可靠鑒定,而且有助于其他Lys酰化的研究,如N端組學[25,26]、乙?；稽c占據(jù)率計算[27,28]、全局組蛋白修飾分析[29,30],以及使用胰蛋白酶進行ArgC型酶切的蛋白質組學研究[31,32]等。

2.3 樣品分離過程的優(yōu)化

為了提高富集樣本中蛋白質C端的鑒定深度,在乙?；瘍?yōu)化結果的基礎上,以300 μg蛋白質為起始量對基于StageTip樣品分離的過程進行了優(yōu)化。首先用200 μL含0.1% TFA的水溶液(pH 3.0)溶解富集后的樣本,加至含0.6 mg Durashell C18填料的酸性StageTip柱(以98%(v/v)乙腈水溶液A′和0.1% TFA水溶液B′代替溶液A、B制備的StageTip柱)進行蛋白質C端的鑒定實驗。利用200 μL 20%(v/v)乙腈水溶液(含0.1% TFA)將肽段從StageTip柱中洗脫,在兩次重復實驗中,C端肽段富集效率達80%和73%,平均鑒定出133條C端肽段,對應于113個蛋白質C端(見圖3a中TFA-0.6 w/o a-ion)。通過添加a離子進行搜庫(該方式已被證明可以提高C端肽段的鑒定數(shù)目[15,33]),蛋白質C端的鑒定數(shù)目有所增加(見圖3a中TFA-0.6),因此后續(xù)的數(shù)據(jù)分析中均考慮添加a離子進行搜庫,但對比LAACTer[15]和Du等[16]的報道,以此方法鑒定的蛋白質C端數(shù)目仍然較少。

考慮到肽段水平反應中積累了大量有機物(包括乙酰化試劑、有機緩沖劑及其他副產物),尤其是用于肽段與聚合物偶聯(lián)的EDC總量達10～20 mg,這些有機物對肽段的鑒定可能存在多方面的影響,如:1)在脫鹽和nano-LC分離過程中,與Durashell C18填料競爭性結合,從而導致樣本的嚴重損失;2)堿性EDC會對肽段信號產生壓制,從而影響檢測靈敏度;3)在數(shù)據(jù)依賴的采集模式中通過占據(jù)MS2的掃描時間,從而減少對肽段的掃描。因此,需要通過對樣品分離過程進行優(yōu)化以減輕這些非肽有機物造成的影響。

由于蛋白質C端的α-COOH被酰胺化修飾,推測在堿性環(huán)境中進行樣品分離,C端肽段去質子化而極性變小,可能與Durashell C18填料有更高的親和力,因此在洗脫的濾液中能夠鑒定到更多的C端肽段。結果表明,在1.7節(jié)描述的堿性環(huán)境下進行樣品分離,C端肽段的鑒定數(shù)目約比酸性環(huán)境增加了44%(見圖3a中AF-0.6與TFA-0.6),因此后續(xù)基于StageTip柱的樣本分離過程均在堿性環(huán)境條件下進行。

為了實現(xiàn)肽段和非肽類物質更好的分離,同時提升蛋白質C端的鑒定數(shù)目,進一步優(yōu)化了StageTip柱的Durashell C18填料用量。結果表明,相比于使用0.6 mg Durashell C18柱填料進行樣品分離,在使用6 mg柱填料時,蛋白C端的鑒定數(shù)目沒有明顯減少(見圖3a, AF-6),且填料柱體積相對較大,更利于進行將樣本洗脫為多個組分的實驗操作;而使用18 mg柱填料時,大量填料可能由于非特異性吸附作用引起樣品損失,蛋白質C端的鑒定數(shù)目約下降了43%(見圖3a, AF-18),不利于后續(xù)進一步的優(yōu)化實驗。

因此,通過使用含6 mg Durashell C18填料的StageTip柱,將樣本依次用5%、10%、15%、20%、25%、30%和80%(v/v)乙腈水溶液(均含0.1% TFA)各200 μL洗脫為7個組分,約93%的蛋白質C端僅在一個或兩個組分中鑒定到,表明將樣本洗脫為多個組分后,降低了樣品的復雜度,達到了比較好的分離效果,更加利于蛋白質C端的鑒定。兩次重復實驗中平均鑒定到616條C端肽段,對應547個蛋白質C端(見圖3b中7Fr),總數(shù)目約為酸性條件下的4倍。在兩次重復實驗中,約73%的蛋白質C端被鑒定到兩次,皮爾森相關系數(shù)達0.91,表明實驗的重復性較好。考慮到蛋白質C端數(shù)目約占總PSMs的1%(見圖2e和2f),以300 μg的蛋白質組為起始量進行樣品分離過程的優(yōu)化實驗,估計C端肽段僅約為1～3 μg,但將洗脫后的7個組分組合成4個組分(5%、10%+25%、15%+30%、20%+80%)后進行質譜分析,鑒定數(shù)目約下降了30%(見圖3b中4Fr),證明了富集后樣本的仍具有較高的復雜性及需要更高分離度的必要性。

圖 3 (a、b)不同條件下C端肽段和蛋白質C端的鑒定數(shù)目以及(c、d)不同策略之間的互補性分析Fig. 3 (a, b) Identification numbers of C-terminal peptides and (c, d) C-termini and complementary analysis of different strategiesa. TFA-0.6 w/o a-ion: 0.1% trifluoroacetic acid (TFA), 0.6 mg Durashell C18, without a-ion; TFA-6: 0.1% TFA, 0.6 mg Durashell C18, with a-ion; AF-0.6: 5 mmol/L ammonium formate (AF), 0.6 mg Durashell C18, with a-ion; AF-6: 5 mmol/L AF, 6 mg Durashell C18, with a-ion; AF-18: 5 mmol/L AF, 18 mg Durashell C18, with a-ion. b. 5%-80%: 5%-80% (v/v) acetonitrile aqueous solution (0.1% TFA); 7Fr: the above seven fractions; 4Fr: the seven fractions combined into four fractions (5%, 10%+25%, 15%+30%, 20%+80%); 7Fr*: only false discovery rate (FDR)<0.01 was required for seven fractions. c. overlap of C-termini identified in this study and LAACTer[15]; d. overlap of C-termini identified in this study and Du’s study[16].

綜上所述,通過將300 μg蛋白質組富集的樣品洗脫為7個組分,在兩次重復實驗中共鑒定出732條C端肽段,對應696個蛋白質C端,達到本課題組前期LAACTer方法[15]和Du等[16]的鑒定深度(分別鑒定到834和781個蛋白質C端)。

與LAACTer策略[15](切割Lys/Arg殘基N端,產生以Lys或Arg開頭且α-N端帶有乙酰化修飾的C端肽段)的研究結果相比,本研究的策略(切割Arg殘基C端,產生α-N端帶有二甲基化修飾的C端肽段)鑒定到的蛋白質C端種類新增約53%,且重疊部分低于20%,兩者總數(shù)目達1 200以上(見圖3c);與Du等[16]的策略(切割Lys殘基C端,產生α-N端帶有二甲基化修飾的C端肽段)相比,本研究鑒定到的蛋白質C端新增約77%,重疊部分低于7%,兩者總數(shù)目達1 380以上(見圖3d)。與Du等[16]的研究(先將蛋白質組進行樣品分離,再對每個組分進行富集)相比,本研究中的策略是先進行目的肽段富集再完成樣品分離,避免了樣品損失,大大簡化了操作流程。不同策略中使用不同的蛋白質水平衍生化修飾、酶切方式以及肽段N端衍生化方式,產生了含不同α-N末端結構的C段肽段,因此理論上不同策略對蛋白質C端的鑒定有著各自獨特的偏好性,兩兩之間的鑒定結果有所不同,這不僅實現(xiàn)了對蛋白質C端的深度鑒定,而且在鑒定范圍上具有獨特性,將為蛋白質C端機制的深入研究提供新的有力工具。

值得注意的是,696個蛋白質C端是經(jīng)過嚴格的數(shù)據(jù)篩選得到,即1)肽段水平FDR<0.01; 2)ion score≥20; 3)C端帶有乙醇胺修飾。若按Du等[16]所報道的FDR<0.01的置信標準,兩個重復實驗中平均鑒定到766個蛋白質C端,總數(shù)目可達933個(見圖3b, 7Fr*),這是基于聚合物富集C端肽段策略獲得的最大數(shù)據(jù)集之一[15-20]。

圖 4 不同蛋白酶和N端衍生化組合對鑒定蛋白質C端的互補性分析Fig. 4 Complementarity of different combinations of proteases and N-terminal modifications on C-terminal identificationa. identified number of C-termini by two repetitions under different strategies; b. overlap of totally identified C-termini; c. correlation of intensity between different experiments; d. comparison of ion scores for peptides commonly identified from indicated methods; e. the MS2 spectra of RLACGVIGAIQ identified by “LysargiNase+acetylation (Ac)”; f. the MS2 spectra of LACGVIGAIQ identified by “trypsin+dimethylation (Dime)”; g. the MS2 spectra of RTLLEQLDDDQ identified by “LysargiNase+Ac”; h. the MS2 spectra of TLLEQLDDDQ identified by “trypsin+Dime”; i. frequency of charge states of the C-terminal peptides; j. frequency of length of the C-terminal peptides; k. frequency of GRAVY score (hydrophilicity is represented by negative value and hydrophobicity is represented by positive value) of the C-terminal peptides; l. frequency of isoelectric point of the C-terminal peptides.

2.4 利用新型ArgN型酶切與肽段N端衍生化進一步擴大蛋白質C端鑒定范圍

LysargiNase是一種可以特異性切割Arg和Lys殘基N端的胰蛋白酶鏡像酶[34],可以在酶切所得的肽段N端留下兩種堿性氨基酸。LysargiNase與胰蛋白酶在全蛋白質組肽段的鑒定覆蓋范圍具有一定的互補性[34,35],但二者在鑒定Arg特異性酶切所產生的C端肽段上的互補性鮮有研究。同時,考慮到肽段N端的化學保護基會影響肽段的色譜保留和質譜檢測,推測C端肽段N端上不同的衍生化修飾在進行蛋白質C端鑒定時可能會存在一定的互補性。

因此,為了進一步擴大蛋白質C端鑒定范圍,本研究探索了兩種酶(LysargiNase和胰蛋白酶)和兩種肽段N端衍生化修飾的組合對C端肽段鑒定數(shù)目和種類的影響。在兩次重復實驗中,通過對未分級分離的C端肽段樣品進行單針質譜分析,即僅使用200 μL 20%(v/v)乙腈水溶液(含0.1% TFA)將富集后的樣品從StageTip柱洗脫。在兩次重復實驗中,4種策略共鑒定到372個蛋白質C端。其中“胰蛋白酶+二甲基化”策略鑒定到的蛋白質C端數(shù)目共計220個(見圖4a和4b)。新型“LysargiNase+乙酰化”策略在前者策略的基礎上,鑒定到的蛋白質C端種類新增105個(見圖4b),兩種策略鑒定的蛋白質C端數(shù)目占總數(shù)目的87%,且兩種策略鑒定蛋白質C端種類的重疊部分僅為20%(見圖4b),說明兩種策略對于蛋白質C端的鑒定范圍具有很強的互補性。

對兩種策略下鑒定到的C端肽段進行對比分析,發(fā)現(xiàn)共有肽段的強度相關性較差(見圖4c),且離子分數(shù)差異較大(見圖4d),表明兩種方法對序列相同的C端肽段具有不同的偏好性。這種偏好性可歸因于兩種方法產生了不同的N末端結構:乙?；摩?N端(由“LysargiNase+乙?；辈呗援a生)和二甲基化的α-N端(由“胰蛋白酶+二甲基化”策略產生)。一方面,“LysargiNase+乙酰化”策略中,Arg上胍基強堿性的優(yōu)勢在于較高的離子化效率利于肽段的檢測[36];但該基團的局限可能在于堿性太強而更難碎裂[37,38],從而影響C端肽段的鑒定(見圖4e和4f)。另一方面,“LysargiNase+乙?；辈呗灾笑?N端上的乙?；揎椡ㄟ^增強肽段主鏈解離和穩(wěn)定N端碎片離子[39,40],能產生更多的a離子和b離子(見圖4g和4h)。此外,乙?；摩?N端Arg基團的疏水性遠低于二甲基化的α-N端(XLOGP3[41]值分別為-2.84和-0.2),這在很大程度上影響了肽段的色譜保留,從而影響了對蛋白質C端的鑒定。

為了深入了解兩種策略對鑒定蛋白質C端的偏好性,分析了兩種策略各自“特有的”C端肽段的特征。結果顯示,“胰蛋白酶+二甲基化”策略更傾向于鑒定長度為11～15的2+肽段(見圖4i和4j)。而“LysargiNase+乙酰化”策略更傾向于鑒定長度為6～15的2+肽段,以及疏水性較低且含有較多酸性殘基的肽段(見圖4k和4l)。

綜上所述,通過使用基于Arg型酶切的新策略“LysargiNase+乙?；?在原有策略“胰蛋白酶+二甲基化”的基礎上進一步擴大了蛋白質C端的覆蓋范圍。

3 結論

本研究通過對基于Arg型酶切的反向富集策略的系統(tǒng)性優(yōu)化,縮短了樣本準備時間,提升了C端肽段的鑒定深度,并擴大了C端肽段的鑒定范圍。此外,通過與其他鑒定C端肽段的策略相比,本研究在鑒定范圍上具有獨特性,進一步提示,可以采用多種策略聯(lián)用的方式進行蛋白質C端的鑒定,用以提升蛋白質C端的鑒定“深度”和“廣度”。通過將優(yōu)化后的方法與其他策略結合,不僅可以高效地用于基于Arg型酶切的蛋白質C端組學深度分析,還可以對不同細胞、組織來源的蛋白質C端狀態(tài)進行系統(tǒng)表征,獲得蛋白質C端狀態(tài)的全景,將為蛋白質C端在生理病理中的分子機制研究提供新的信息。