馮 雷 黃美興 雷水生 方培炫 朱 璐

銀屑病是一種在多基因遺傳背景下，由免疫反應(yīng)介導(dǎo)的炎癥性皮膚病，其患病率約為0.1%～3.0%[1-2]。銀屑病常合并其他系統(tǒng)異常(如伴內(nèi)臟及關(guān)節(jié)損害等),治療難度大。中、重度銀屑病患者罹患代謝綜合征和動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重危害其身心健康。銀屑病主要的病理學(xué)表現(xiàn)為表皮角化過度伴角化不全，真皮乳頭層毛細(xì)血管擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯[3-4]。銀屑病以角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖、分化和血管增生為基礎(chǔ)，皮損處最先發(fā)生的病理學(xué)改變?yōu)檠芊植己托纬傻漠惓！Ｑ軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在血管生成過程中起中心調(diào)控作用[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，CD31和CD34是較理想的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，可有效標(biāo)記和檢測(cè)腫瘤新生血管的微血管密度。臨床研究顯示，在皮膚鏡下銀屑病患者皮損處組織可見大量血管結(jié)構(gòu)，搔抓后可出現(xiàn)點(diǎn)狀出血。本研究通過檢測(cè)銀屑病患者皮損處組織中VEGF、CD31和CD34的表達(dá)情況，探討銀屑病可能的發(fā)生機(jī)制，以期為臨床診治提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年3月—2020年5月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院就診的30例銀屑病患者的臨床資料及皮損處活組織，經(jīng)臨床、皮膚鏡檢查確認(rèn)均處于疾病進(jìn)行期，并納入銀屑病組；其中男18例、女12例，年齡范圍為25～61歲，中位年齡為31歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》和《皮膚鏡診斷圖譜》銀屑病進(jìn)行期的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即具有典型表現(xiàn)(臨床表現(xiàn)為新皮疹不斷出現(xiàn)，舊皮疹不斷擴(kuò)大，鱗屑厚積，炎癥明顯，周圍有炎性紅暈，瘙癢感較顯著。皮膚鏡表現(xiàn)為亮紅色或鮮紅色背景上彌漫性分布白色鱗屑，血管多為小球狀、發(fā)夾狀和環(huán)狀)；3 個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素、維甲酸、免疫抑制劑等藥物；1個(gè)月內(nèi)未使用銀屑病相關(guān)的口服、外用藥物或光療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期或哺乳期婦女；精神疾病患者；有其他系統(tǒng)性疾病或皮膚病患者。另取曾在急診科行清創(chuàng)術(shù)的10例患者的皮膚組織樣本作為對(duì)照組。取對(duì)照組和銀屑病組各7例行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，本研究符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求，患者均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 使用的試劑、試劑盒和抗體分別為RNA裂解液TRIzol[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,批號(hào)為10296010]、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大富酶泰斯生物公司, 批號(hào)為K1622)、SYBR Green RNA提取試劑盒[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,批號(hào)為00720733]、RIPA裂解液[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,批號(hào)為89900]、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,批號(hào)為UF281363]、DAB顯色試劑盒[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，批號(hào)為170-5060]、兔抗人CD31單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)為77699S)、兔抗人CD34單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)為ab81289)、鼠抗人VEGF單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)為sc-7269)、羊抗兔二抗[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,批號(hào)為230194]、羊抗鼠二抗[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,批號(hào)為31430]、超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒(福州邁新公司)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 將經(jīng)石蠟包埋好的組織塊切成厚度為4 μm切片后，行60 ℃烤片1 h，予常規(guī)脫蠟、乙醇水化、抗原修復(fù)、一抗和二抗封閉后，進(jìn)行染色。應(yīng)用1×PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組處理試劑，商品化的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用TRIzol提取組織總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，操作步驟: 取RNA 4 μg，加入Oligo(dT)18 1 μL，加三蒸水將總體積補(bǔ)足至12 μL，65 ℃ 5 min，冰上靜置3～5 min；再依次加入Ribolock RNase抑制劑1 μL，RevertAid M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL， 5×反應(yīng)緩沖液4 μL，10 mmol/L dNTP混合液2 μL, 置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。按程序25 ℃ 5 min、42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min運(yùn)行。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)。擴(kuò)增條件如下: 50 ℃ 2 min、 95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s、 60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔct值計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以銀屑病組相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù)表示。引物序列如下：VEGF正向引物為5’- GTG CCC ACT GAG GAG TCC A-3’, 反向引物為5’- GTG CTG GCC TTG GTG AGG T-3’; CD31正向引物為5’- AAC AGT GTT GAC ATG AAG AGC C-3’, 反向引物為5’- TGT AAA ACA GCA CGT CAT CCT T-3’; CD34正向引物為5’-CTA CAA CAC CTA GTA CCC TTG GA-3’,反向引物為5’-GGT GAA CAC TGT GCT GAT TAC A-3’; GAPDH正向引物為5’-AAT GGG CAG CCG TTA GGA AA-3’,反向引物為5’-GCC CAA TAC GAC CAA ATC AGA G-3’。

1.3.3 免疫印跡試驗(yàn) 將收集的銀屑病皮損處及正常皮膚組織充分剪碎，用RIPA裂解液裂解，勻漿機(jī)勻漿，收集蛋白裂解液，經(jīng)12 000×g，離心15 min后，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。每孔蛋白質(zhì)上樣量為20 μg，加入10%十二烷基硫酸鈉(SDS)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至0.22 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。在常溫下，用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉含目的蛋白質(zhì)的PVDF膜條帶2 h后， 在4 ℃下，將條帶與抗 VEGF(1∶500)、CD31(1∶1 000)和CD34(1∶1 000)單克隆抗體、抗β-actin(1∶3 500)單克隆抗體共同孵育過夜，經(jīng)TBST洗滌3次后與相應(yīng)的二抗(1∶5 000)在室溫下共孵育2 h，經(jīng)TBST洗滌3次后，加入ECL試劑顯影，定影晾干后拍照，分析目的條帶的灰度值。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) VEGF免疫組織化學(xué)染色以切片組織的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)，陰性對(duì)照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中應(yīng)無(wú)棕黃色反應(yīng)物。CD31、CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。在染色成功的區(qū)域挑選5個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)陽(yáng)性染色細(xì)胞面積的百分率進(jìn)行相應(yīng)評(píng)分：<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。同時(shí)對(duì)著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無(wú)色為0分，淺棕色為1分，棕黃色為2分，棕紅色為3分。

2 結(jié) 果

2.1 皮損處皮膚鏡下組織表現(xiàn)和臨床大體表現(xiàn) 皮膚鏡下疾病的典型表現(xiàn)為亮紅色背景，其上有白色鱗屑，可見彌漫性分布的點(diǎn)狀、小球狀、腎小球樣和環(huán)狀血管(圖1A、1B)。患者皮損處的大體照片可見鮮紅斑塊附有大量銀白色鱗屑，邊界清晰，部分皮損處可見血痂附著(圖1C、1D)。

A 皮膚鏡下見淡紅色背景上紅色點(diǎn)狀、短棒狀血管規(guī)則分布，有銀白色鱗屑附著(×50) B 紅色背景、曲折擴(kuò)張的腎小球樣毛細(xì)血管呈均勻、規(guī)則的散在分布(×200) C、D 大體觀見鮮紅斑塊上大量銀白色鱗屑，邊界清晰，可見血痂附著

2.2 皮損處組織病理學(xué)染色與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 H-E染色顯示銀屑病組患者皮損處組織角化過度伴角化不全，Munro微膿瘍和(或)Kogoj海綿狀膿瘍形成，顆粒層變薄或消失，表皮銀屑病樣增生，真皮層乳頭水腫伴血管擴(kuò)張，周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2A、2B)。CD31、CD34 陽(yáng)性染色位于銀屑病組患者皮損處組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈條狀或環(huán)狀彌漫分布；對(duì)照組組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中少量表達(dá)CD31、CD34(圖2C～2F)。VEGF在銀屑病組患者的皮損處組織中表達(dá)遍布表皮全層，以棘層染色最強(qiáng)，基底層細(xì)胞染色明顯減弱或不染色，且主要表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，為細(xì)胞內(nèi)的顆粒狀棕黃色染，真皮淺層浸潤(rùn)的部分炎癥細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)亦可見陽(yáng)性表達(dá)(圖2G、2H)。與對(duì)照組相比，銀屑病組患者皮損處組織的VEGF、CD31和CD34免疫組織化學(xué)染色評(píng)分顯著增加(P值均<0.05)。見表1。

表1 兩組免疫組織化學(xué)染色評(píng)分的比較 分)

A、B 對(duì)照組、銀屑病組(H-E染色，×40) C、D 對(duì)照組、銀屑病組(CD31免疫組織化學(xué)染色，×40) E、F 對(duì)照組、銀屑病組(CD34免疫組織化學(xué)染色，×40) G、H 對(duì)照組、銀屑病組(VEGF免疫組織化學(xué)染色，×40)

2.3 皮損處皮膚組織血管標(biāo)志物的表達(dá) 銀屑病組患者皮損處組織中的VEGF、CD31和CD34的mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)，見表2。 銀屑病組患者皮損處組織中的VEGF、CD31和CD34的蛋白質(zhì)水平顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)，見圖3。

圖3 兩組患者皮損處皮膚組織血管標(biāo)志物蛋白質(zhì)的表達(dá)情況

表2 兩組皮膚組織血管標(biāo)志物的mRNA表達(dá)量的比較

3 討 論

銀屑病是一種常見的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病。典型損害表現(xiàn)為紅色斑塊上覆蓋銀白色鱗屑，皮膚常常伴有瘙癢、皸裂和疼痛等，甚至伴有全身癥狀。此外，外在皮損引發(fā)的變化給患者帶來(lái)極大的心理負(fù)擔(dān)[7]。目前，銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，本研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)行期銀屑病患者皮損處組織中VEGF水平升高，同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，提示血管增生在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。

銀屑病的組織病理學(xué)表現(xiàn)為表皮角化過度、角化不全、棘層肥厚，真皮乳頭血管擴(kuò)張和以淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)[8]。通過皮膚鏡檢查發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損處可見大量血管結(jié)構(gòu)，典型皮膚鏡檢查表現(xiàn)為均勻且規(guī)則分布的血管模式、紅色點(diǎn)狀血管、淡紅色背景，并且以上3種表現(xiàn)同時(shí)存在的特異性為99%。

VEGF 是一種作用強(qiáng)，且特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，其不僅可以促進(jìn)真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生，還可以增加血管通透性，并對(duì)炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞有化學(xué)趨化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病組患者皮損處組織中VEGF的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量均顯著升高，提示其可能是銀屑病血管異常生成的重要促進(jìn)因子，這為抗血管生成藥物治療銀屑病提供了理論依據(jù)。

近年來(lái)，VEGF在銀屑病發(fā)病中的作用研究有逐漸增多的趨勢(shì)，其作為一種促血管生成因子，在血管生成過程中發(fā)揮重要作用。CD31是目前廣泛使用的血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，其在血細(xì)胞如血小板、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等中也有表達(dá)[9]。CD34是泛血管內(nèi)皮標(biāo)志物之一，被認(rèn)為是重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、較成熟的血管內(nèi)皮標(biāo)志物[10]。鑒于CD31、CD34是較理想的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，因此本研究以抗CD31、CD34為標(biāo)記抗體，發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損處組織中CD31、CD34蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯增高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行期銀屑病皮損處組織中有大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，推測(cè)血管生成在銀屑病的發(fā)生中可能發(fā)揮了作用。VEGF、CD31和CD34在肺癌、肝癌等腫瘤中的研究較多，但目前鮮見文獻(xiàn)報(bào)道這三者在銀屑病中共同表達(dá)的情況。本研究采用3種不同的方法證實(shí)在進(jìn)行期銀屑病組織中VEGF、CD31和CD34的mRNA、蛋白質(zhì)水平存在高表達(dá)。在疾病進(jìn)行期，大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞增生、毛細(xì)血管生成促進(jìn)了銀屑病病情的進(jìn)展，說(shuō)明皮膚鏡檢查結(jié)果可作為診斷銀屑病的據(jù)依，為臨床診治提供思路。

綜上所述，血管生成源于血管生成因子的產(chǎn)生，其中活性最強(qiáng)的VEGF負(fù)責(zé)內(nèi)皮細(xì)胞的活化、增殖并遷移到血管周圍區(qū)域，從而形成大量的血管結(jié)構(gòu)促進(jìn)銀屑病表皮增生。因此，筆者推測(cè)銀屑病皮損各個(gè)時(shí)期的發(fā)展變化均可能以血管病變?yōu)榛A(chǔ)，上述假設(shè)有待進(jìn)一步的研究予以證實(shí)。