張緒湃 曾 潔 徐 婭 程 紅 陳柯材 張 婷

1 臨床資料患者男，53歲，因“體檢發(fā)現白細胞及血小板計數升高”于2020年12月14日入住內江市第一人民醫(yī)院血液科?；颊呷朐呵鞍胩煊诋數蒯t(yī)院體檢，血常規(guī)示白細胞計數113.98×109/L、血小板計數1 579×109/L，腹部多普勒超聲提示脾腫大；患者平素無疲倦乏力及納差，無早飽感，無夜間盜汗、消瘦，無左上腹疼痛，無頭暈、頭痛，無畏寒、發(fā)熱，無牙齦出血及皮膚瘀點、瘀斑，無黑便、血便，無胸悶、氣促、心悸等不適。當地醫(yī)院建議其至上級醫(yī)院就診，患者遂來我院就診，急診復查血常規(guī)示白細胞計數121.95×109/L,血紅蛋白130 g/L,血小板計數1 504×109/L，以“白細胞及血小板增多”收入院?；颊呒韧眢w健康，無高血壓、糖尿病、心臟病病史，無肝炎、結核病史，無放射性及毒物接觸史，無特殊不良嗜好，家族中無類似疾病病史。入院體格檢查：神志清楚，無貧血貌，皮膚無瘀點、瘀斑，淺表淋巴結未觸及腫大，胸骨無壓痛，心肺無異常，腹軟，無壓痛、反跳痛及肌緊張，肝臟肋下未捫及，脾臟肋緣下約2 cm，無摩擦感。入院后再次復查血常規(guī)示白細胞計數122.31×109/L，血紅蛋白127 g/L，血小板計數1 469×109/L；白細胞手工分類示中性粒細胞0.40，淋巴細胞0.06，單核細胞0.04，嗜酸性粒細胞0.11，嗜堿性粒細胞0.12，幼稚細胞0.27。肝腎功能、血脂正常，乳酸脫氫酶445 U/L(正常值范圍100～350 U/L)，堿性磷酸酶79 U/L(正常值范圍45～125 U/L)，凝血常規(guī)無明顯異常。腹部多普勒超聲提示脾大。骨髓涂片示有核細胞增生活躍；粒系比例增高占骨髓有核細胞 (ANC)0.83，以中性粒細胞及以下階段增生為主，原始粒細胞占ANC 0.005，嗜堿性粒細胞比例偏高，嗜酸性粒細胞比例增高；紅系增生減少，形態(tài)未見明顯異常，成熟紅細胞形態(tài)及染色體大致正常；淋巴細胞比例降低，形態(tài)大致正常；單核細胞形態(tài)及比例大致正常；全片見巨核細胞39個，可見體積偏大的巨核細胞，散在血小板易見，成堆及成簇血小板增多；全片未見寄生蟲；中性粒細胞堿性磷酸酶(NAP)積分17分。 骨髓活組織檢查(簡稱活檢)：骨髓增生極度活躍(造血容量約95%)，粒紅系比例增高，可見典型不成熟前體細胞異常定位(ALIP)現象，幼稚細胞稍增多，小簇狀或散在分布；粒系增生，各階段細胞均可見，以偏成熟階段細胞為主，嗜酸性粒細胞增多，小簇狀或散在分布；可見少量中晚幼紅細胞；巨核細胞數量增多，大部分胞體偏小，胞核分葉少；淋巴細胞、漿細胞散在分布可見；骨髓間質局灶可見纖維化，骨小梁規(guī)整。先后2次骨髓穿刺，定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測BCR-ABL1融合基因(p210型、p190型、p230型)均呈陰性。骨髓JAK2基因V617F突變、CALR基因突變、MPL基因突變陰性。骨髓染色體核型分析(細胞培養(yǎng)法G顯帶)：46，XY，t(4;22)(p16;q11.2)，del(7)(p13p21) [20](圖1)。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技術檢測到BCR-ABL1融合基因。分析200個細胞，各信號模式如下：1F2R1G 54.5%，1F1R1G 33.0%，1F2R2G 6.5%，1F1R2G 2.0%，2R2G 4%(圖2)。

圖1 細胞培養(yǎng)法G顯帶骨髓染色體核型分析結果

A、B 1F2R1G信號模式，綠色熒光G標記BCR(22q11)探針，紅色熒光R標記ABL1(9q34)探針，BCR-ABL1融合基因顯示黃色或紅綠疊加信號F，正常信號模式2R2G，經典Ph染色體信號模式2F1R1G。閾值標準：融合信號1F>11%為陽性，2F>2%為陽性

結合臨床表現及實驗室檢查，慢性粒細胞白血病(CML)慢性期診斷明確。入院后予羥基脲1～3 g/d治療，根據血常規(guī)結果調整其用量，輔以堿化尿液、補液等處理。于2020年12月29日復查血常規(guī)示白細胞計數19.38×109/L，血紅蛋白120 g/L，血小板計數1 522×109/L?；颊邽榍筮M一步治療至上級醫(yī)院，予以甲磺酸氟馬替尼片600 mg/d、注射用重組人干擾素α1b 50 μg/d治療，于2021年1月21日復查血常規(guī)示白細胞計數7.45×109/L,血紅蛋白125 g/L,血小板計數386×109/L。出院后患者長期服用甲磺酸氟馬替尼片600 mg/d單藥治療，定期復查血常規(guī)均無明顯異常，目前正在密切隨訪中。

2 討 論CML是骨髓造血干細胞克隆增生的惡性腫瘤，通常以外周血白細胞計數顯著升高為特點，其中以中、晚幼粒細胞為主，同時伴有嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞比例升高。大約有50%患者在初診時血小板計數升高，部分患者可達1 000×109/L以上，且增高的程度與白細胞計數無明顯相關性。持續(xù)性血小板計數>1 000×109/L為CML加速期的診斷標準之一，而在CML慢性期少見[1]。研究[2]結果表明，以血小板計數顯著升高為表現的CML，在骨髓中可見到較多的不分葉圓核小巨核細胞。CML與原發(fā)性血小板增多癥(ET)均屬骨髓增殖性腫瘤，WHO的ET診斷標準中必須先排除BCR-ABL1融合基因或Ph染色體陽性[3]。ET的主要表現是外周血血小板計數顯著升高并且存在功能異常，骨髓涂片通常顯示以巨核細胞增生為主，粒系和紅系增生正常，巨核細胞呈松散簇，大成熟巨核細胞增多，并且多存在JAK2 V617F、CALR、MPL基因突變[4]。本例患者血常規(guī)提示血小板計數顯著升高，需與ET進行鑒別，但該患者外周血白細胞計數顯著升高且外周血及骨髓中嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞增多，超聲提示脾腫大，骨髓檢查提示粒系增生活躍，巨核細胞數量增多，大部分胞體偏小，胞核分葉少，并且JAK2 V617F、CALR、MPL基因突變均為陰性，FISH技術檢測到BCR-ABL1融合基因，因此診斷CML明確。

目前CML中發(fā)現的BCR-ABL1融合基因主要有3種[5]。其中，M-BCR可形成2種BCR-ABL1融合轉錄本，即e13a2(b2a2)和e14a2(b3a2)，蛋白質產物均為P210；m-BCR可形成e1a2融合轉錄本，編碼P190融合蛋白；u-BCR形成e19a2融合轉錄本，翻譯成P230蛋白質產物。本例患者骨髓BCR-ABL1融合基因(p210型、p190型、p230型)陰性，但通過FISH技術檢測到BCR-ABL1融合基因。究其原因，一方面存在定量PCR檢測BCR-ABL1融合基因出現假陰性可能，但2次結果均出現假陰性的可能性?。涣硪环矫婧芸赡艽嬖谏僖娦虰CR-ABL1融合基因轉錄本。據報道，目前有十余種少見型BCR-ABL1融合基因轉錄本，如b2a3(e13a3)[6]、b3a3(e14a3)[7]、e1a3[8]、e6a2[9]、e8a2[10]、e18-int-a2等，其中BCR基因斷裂點可發(fā)生在外顯子內部或內含子的插入，ABL1基因融合位點為外顯子a3處[11-12]。在少見型BCR-ABL1融合基因轉錄本中又以b2a3、b3a3稍多見，其他則相對少見，并且b2a3、b3a3轉錄本CML患者的疾病進展相對緩慢，對酪氨酸激酶抑制劑(TKI)類藥物敏感[6-7]，而e6a2、e8a2轉錄本患者疾病進展較快且對TKI類藥物耐藥多見[10,13]。目前看來,本例CML患者對TKI類藥物的治療反應尚可。RNA測序又稱轉錄組高通量測序，檢測細胞內所有表達的轉錄本，可發(fā)現新的融合基因及位點，同時可行表達分析、可變剪切分析及突變分析等。針對BCR-ABL1融合基因的靶向RNA測序靈敏度更高，可檢出低豐度的融合基因。本例患者可進一步行RNA測序檢測出罕見型BCR-ABL1融合基因及位點甚至其他融合基因，但患者及其家屬拒絕行該項檢查。

95%以上初診CML患者的染色體核型分析發(fā)現Ph染色體,即t(9,22)(q34,q11);極少數存在隱匿性Ph染色體，同時合并其他染色體異常。約有10%初診CML患者存在變異性Ph染色體，可以由22q11與非9號染色體易位形成，也可以由9、22號及其他染色體復雜易位形成，無論是經典還是復雜易位的Ph染色體，9q34和22q11融合是其形成的根本。FISH技術是目前探究變異性Ph染色體產生機制的重要手段之一。變異性Ph染色體的形成主要為一步機制和二步機制[14]，其中一步機制為染色體易位同時發(fā)生在3條及以上不同染色體之間(圖3A)，二步機制是在標準Ph染色體的基礎上涉及另一染色體的相繼易位(圖3B)。大約有15%的經典易位和40%的變異易位通過FISH技術檢測發(fā)現存在衍生9號和22號染色體BCR和(或)ABL1區(qū)域的缺失[14-15]。研究[14]結果表明，不論變異性Ph染色體為何種形成機制、參與染色體的數目或者存在BCR和(或)ABL1區(qū)域缺失與否，其對TKI類藥物的分子生物學和細胞遺傳學反應、療效均無顯著差異。本例患者骨髓染色體核型分析顯示20個中期分裂相均存在4p16和22q11.2相互易位，FISH技術檢測骨髓BCR-ABL1融合基因陽性，可能存在4、9、22號染色體三聯易位?？紤]可能由于Ph染色體易位拷貝數少或者9號染色體在易位前后長度未發(fā)生變化，常規(guī)染色體核型分析因不如FISH技術檢測靈敏度高而不能得出陽性結果。根據相關文獻研究結合該患者FISH技術檢測信號模式，推測該患者染色體三聯易位可能由于二步機制合并衍生9號染色體BCR和(或)ABL1區(qū)域的缺失所致(圖3C和圖3D)。

A 為一步機制(1F2R2G：1F位于衍生22號染色體，2R位于正常和衍生9號染色體，2G位于正常22號染色體和衍生另一染色體) B 為二步機制(2F1R1G：2F位于衍生22號染色體和另一染色體，1R位于正常9號染色體，1G位于正常22號染色體) C 為本例患者可能的染色體易位機制一(1F2R1G：存在衍生9號染色體BCR區(qū)域缺失，1F位于衍生22號染色體，2R位于正常9號染色體和衍生4號染色體，1G位于正常22號染色體) D 為本例患者可能的染色體易位機制二(1F1R1G：存在衍生9號染色體BCR和ABL1區(qū)域缺失，1F位于衍生22號染色體，1R位于正常9號染色體，1G位于正常22號染色體)

此外，推測該患者可能存在更為復雜的易位機制[14-15]，同樣可通過RNA測序予以證實。

在臨床工作中遇到白細胞及血小板計數顯著升高的患者必須常規(guī)進行BCR-ABL1融合基因、JAK2基因V617F突變，以及CALR、MPL基因突變檢測，以排除其他骨髓增殖性疾病，若PCR檢測BCR-ABL1融合基因陰性，但臨床表現及骨髓細胞學提示CML可能，需進一步行BCR-ABL1融合基因FISH技術檢測甚至RNA測序檢查。