裴立碩，朱永龍，毛晴，陳麗梅，郭永軍，孫敬鋒

點帶石斑魚致病性哈維氏弧菌的分離鑒定及藥敏試驗

裴立碩，朱永龍，毛晴，陳麗梅，郭永軍，孫敬鋒通信作者

（天津農學院 水產學院 天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392）

為探究養(yǎng)殖點帶石斑魚死亡原因，從患病點帶石斑魚（）肝臟中分離得到一株細菌，命名為SBY-G。經形態(tài)學觀察、生理生化試驗鑒定，初步判定為哈維氏弧菌（）?；蛐蛄蟹治鲲@示，菌株SBY-G與哈維氏弧菌菌株（KU364055.1）相似性最高，基因序列分析顯示，菌株SBY-G與哈維氏弧菌菌株（LC370081.1）相似性最高，系統發(fā)育樹顯示與哈維氏弧菌聚為一支，因此確定該菌為哈維氏弧菌（）。藥敏試驗結果表明，菌株SBY-G對阿莫西林、頭孢孟多、頭孢克肟、頭孢曲松、諾氟沙星等15種抗生素高度敏感；對頭孢噻肟、慶大霉素、卡那霉素等6種抗生素中度敏感；對氨芐西林、苯唑西林、頭孢呋辛、頭孢他啶、鏈霉素、新霉素等18種抗生素不敏感。人工回歸感染試驗結果顯示，菌株SBY-G對斑馬魚的半數致死量LD50為1×105cfu/g。本研究結果為哈維氏弧菌感染引起魚類疾病的防治和診斷提供了科學參考。

哈維氏弧菌；；；藥敏試驗

點帶石斑魚（），屬于鮨科，石斑魚亞科，石斑魚屬。因其肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，是經濟價值較高的海水名貴種類[1]。近年來隨著養(yǎng)殖技術的發(fā)展，人工養(yǎng)殖石斑魚規(guī)模不斷擴大，成為繼大黃魚、鲆魚和鱸魚后的第四大類海水養(yǎng)殖品種[2]。但是在人工養(yǎng)殖過程中，由于密度過大，水體污染嚴重等原因，魚類機體抵抗力下降，為細菌侵入創(chuàng)造了有利條件[3]。已有報道指出溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌等都可以導致海洋經濟動物大量死亡[4]。并且，在石斑魚養(yǎng)殖過程中，弧菌與石斑魚潰瘍病有著直接的關系[5]。

弧菌病是嚴重危害海水養(yǎng)殖魚類的疾病之 一[6]。哈維氏弧菌為弧菌屬的一種，是目前海水魚蝦養(yǎng)殖過程中常見的條件致病菌，給我國水產養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失[7]。目前，已在大黃魚[8]、長牡蠣[9]、大菱鲆[10]、半滑舌鰨[11]等海洋經濟動物中分離到哈維氏弧菌。

近期，天津市某養(yǎng)殖場點帶石斑魚出現皮膚潰瘍癥狀，為研究其病因，本實驗室對患病魚進行了致病菌的分離鑒定。在患病石斑魚肝臟組織中分離到一株細菌，通過細菌形態(tài)學觀察，生理生化試驗，、基因序列分析鑒定為哈維氏弧菌，并進行了人工回歸感染和藥敏試驗。研究結果為魚類感染哈維氏弧菌的防治提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病點帶石斑魚（體長（10±2）cm）取自天津市某海水魚養(yǎng)殖場；健康斑馬魚（體長（3.5± 0.2）cm）購自天津市某花鳥魚蟲市場；2216E培養(yǎng)基、細菌生化鑒定管和藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；PCR Master Mix試劑購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離純化

取患病石斑魚肝臟、脾臟、腎臟組織，在2216E固體平板上劃線分離，28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。從脾臟和腎臟組織沒有分離得到細菌，觀察從肝臟組織分離細菌的菌落形態(tài)，挑取優(yōu)勢菌落進行3次劃線分離，獲得純培養(yǎng)的菌株SBY-G，加入同等體積40％甘油混合保種，-20 ℃保存。

1.2.2 生理生化特性

無菌條件下挑取單菌落接種于微生物生化鑒定管中，進行生理生化特性鑒定。接種后鑒定管于28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后觀察結果。將獲得的菌株生理生化特征對比《伯杰細菌鑒定手冊》[12]及《常見細菌系統鑒定手冊》[13]中標準菌株的結果來初步判定菌株屬種。

1.2.3、基因序列分析

采用水煮法[14]提取DNA，以此作為模板進行、基因序列PCR擴增。PCR擴增反應體系（25 μL）包括：DNA模板2 μL，超純水11 μL，PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各 1 μL。PCR擴增反應條件：首先95 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性1 min，56 ℃（）/ 50 ℃（）退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后在72 ℃再延伸10 min。PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后送至天津金唯智生物科技有限公司進行測序。將測序結果通過NCBI的Blast檢索系統進行相似性分析，使用MEGA 6.0軟件采取Neighbor-Joining 法構建系統發(fā)育進化樹。

1.2.4 人工回歸感染試驗

健康斑馬魚（體長（3.5±0.2）cm）購自天津某花鳥魚蟲市場，在實驗室觀察飼養(yǎng)1周，確認健康無病后，用于人工回歸感染試驗。隨機選取70條健康斑馬魚，平均分為6個試驗組和1個對照組，試驗組的斑馬魚分別腹腔注射濃度為1×104、1×105、1×106、1×107、1×108和1×109cfu/mL的菌液，每一個體注射劑量為10 μL，對照組注射相同體積的0.9％生理鹽水。連續(xù)觀察7 d，每天記錄各組斑馬魚的死亡情況，采用Bliss法[15]算出半數致死量LD50。

1.2.5 藥敏試驗

采用藥敏紙片法[16]進行藥敏試驗。在無菌條件下將菌液均勻涂布于2216E固體培養(yǎng)基上，用鑷子順時針依次貼入含有各種抗生素的藥敏紙片，恒溫培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑并取平均值，根據藥敏紙片說明書，判定該菌對抗生素藥物敏感性。

2 結果與分析

2.1 細菌分離純化及生理生化特性

從患病石斑魚肝臟組織中分離純化得到一株細菌，命名為SBY-G。該菌在2216E培養(yǎng)基上生長良好，菌落表面光滑，邊緣規(guī)整，中部略突起，呈乳白色。菌株SBY-G生理生化結果顯示，與麥芽糖、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、蕈糖、鼠李糖等反應為陽性；與硫化氫、阿拉伯醇、蛋白胨水、水楊素、七葉苷等反應為陰性（表1）。

表1 菌株SBY-G的生理生化試驗結果

注：“＋”表示陽性；“－”表示陰性

2.2 16SrDNA、gapA基因序列及系統發(fā)育樹分析

2.2.1序列及系統發(fā)育樹分析

測序結果顯示，菌株SBY-G的序列長度為1 397 bp（圖1），Blast對比結果表明該菌株的序列與哈維氏弧菌菌株KU364055、KU245727、KF607055的相似性高達99.93％，系統發(fā)育樹結果顯示菌株SBY-G與哈維氏弧菌自然聚為一支（圖2）。

注：圖中M為Marker

2.2.2基因序列及系統發(fā)育樹分析

測序結果顯示，菌株SBY-G的基因序列長度為766 bp（圖3），Blast對比結果表明該菌株的基因序列與哈維氏弧菌菌株LC370081、EF596108、DQ184650的相似性分別為100.00％、99.86％、99.87％，系統發(fā)育樹結果顯示菌株SBY-G與哈維氏弧菌自然聚為一支（圖4）。

注：圖中M為Marker

2.3 人工回歸感染試驗

用SBY-G菌株腹腔注射感染斑馬魚后，第二天，斑馬魚開始出現發(fā)病死亡的現象。死亡的斑馬魚發(fā)病癥狀與患病石斑魚癥狀特征相似，表現為胸鰭發(fā)紅（圖5A），腹部發(fā)紅、皮膚潰爛（圖5B）。累計觀察7天后，不同濃度感染組均出現死亡現象，且感染濃度為1×107、1×108、1×109cfu/mL的感染組斑馬魚死亡率高達80％以上 （表2）。SBY-G菌株對斑馬魚半數致死量（LD50）為1×105cfu/g。

注：A為胸鰭發(fā)紅；B為腹部發(fā)紅、皮膚潰爛

表2 人工回歸感染試驗結果

2.4 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果表明，菌株SBY-G對阿莫西林、頭孢孟多、頭孢克肟、頭孢曲松、美羅培南、阿奇霉素、諾氟沙星、利福平等15種抗生素高度敏感；對頭孢噻肟、慶大霉素、卡那霉素等6種抗生素中度敏感；對氨芐西林、苯唑西林、青霉素G、哌拉西林、頭孢呋辛、頭孢他啶、鏈霉素、新霉素、四環(huán)素等18種抗生素不敏感 （表3）。

注：R表示不敏感；I表示中度敏感；S表示敏感

3 討論

隨著我國水產養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，近年來，由于片面追求經濟效益，和環(huán)境惡化等原因，水產養(yǎng)殖病害呈上升趨勢，水生動物病害時有發(fā)生，給水產養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失[17-18]。哈維氏弧菌是近年感染水產養(yǎng)殖動物常見的致病菌之一，感染凡納濱對蝦[19]、豹紋鰓棘鱸[20]、鮑魚[21]等都引起嚴重的疾病。本研究中，患病石斑魚臨床癥狀主要表現為表皮潰爛，腹部發(fā)紅、潰爛，胸鰭發(fā)紅，初步認為是細菌引發(fā)的該疾病，故采用傳統細菌分離鑒定法進行研究。從病魚肝臟中分離一株革蘭氏陰性菌，經細菌形態(tài)觀察、生理生化試驗、和基因序列及系統發(fā)育樹分析鑒定為哈維氏弧菌。

常規(guī)的生化指標只能進行初步的判定，對于生理生化相似度較高的細菌較難做出正確的鑒 定[22]，基因具有高度保守性，常用來對細菌進行分類鑒定，但對于親緣關系比較近的細菌分辨率不高，有時只能在屬的水平上區(qū)分細 菌[23]。基因是原核和真核生物中廣泛存在的看家基因，具有高度的保守性，不同種屬細菌之間又存在相對穩(wěn)定的變異性，近年來被廣泛用于細菌的種系發(fā)生學和分類學鑒定[24-26]。本試驗中采用基因序列分析對菌株SBY-G進一步鑒定，其結果與序列分析結果一致。

人工回歸感染試驗結果表明，菌液濃度達到1×107cfu/mL時，試驗組斑馬魚的死亡率已達到90％，濃度為1×108和1×109cfu/mL時，試驗組斑馬魚死亡率均為80％。根據SANTOS等[27]提出的標準，當一種細菌對魚類的半數致死量LD50值在1.7×104～1.0×106cfu/g這一范圍時，則可以認為該菌對魚類有高等毒性。在本試驗中，菌株SBY-G的半數致死量LD50為1×105cfu/g，這表明該菌具有較高的毒力。所以，哈維氏弧菌作為一種重要的條件性致病菌，在環(huán)境應激如營養(yǎng)不良、水質惡化、機械損傷等不利條件下，容易引起魚類發(fā)病。

抗生素在防治細菌感染性疾病中具有重要作用[28]，但在實際應用過程中其濫用現象愈演愈烈，不僅造成藥品的浪費，還增加細菌耐藥性的產生，對機體造成危害[29]。在水產養(yǎng)殖中，濫用抗生素會使動物體內出現藥物殘留，使得出產的水產品安全得不到保障[30]，本研究中，藥敏試驗結果顯示，菌株SBY-G對氨芐西林、苯唑西林、青霉素G、哌拉西林、頭孢呋辛、頭孢他啶、鏈霉素、新霉素、四環(huán)素等18種抗生素具有抗性。所以，在點帶石斑魚養(yǎng)殖過程中要慎用漁用抗菌藥物，防止細菌耐藥性的產生和加重。據報道，大部分哈維氏弧菌菌株對氯霉素敏感[31]，而對呋喃唑酮具有較高的耐藥性[32]，這與本研究結果一致。雖然部分抗生素如氯霉素、紅霉素、呋喃唑酮等在水產養(yǎng)殖過程中已經被禁用，但研究其耐藥性對哈維氏弧菌分類鑒定具有一定的參考價值[33]。同時，該研究結果還可為水產養(yǎng)殖動物的病害防治以及對抗生素類藥物的科學規(guī)范使用提供參考。

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Isolation, identification and antibiotic susceptibility analysis of the pathogenicfrom

Pei Lishuo, Zhu Yonglong, Mao Qing, Chen Limei, Guo Yongjun, Sun JingfengCorresponding Author

（Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

To explore the cause of death ofa bacterial strain was isolated from the liver of diseasedand named as SBY-G. This bacterial strain was preliminarily determined asaccording to its morphological, physiological and biochemical characteristics.The sequence analysis of theandgenes respectively showed SBY-G had the highest similarity with（KU364055.1）and（LC370081.1）, and the phylogenic trees showed that it was clustered with. The results of antibiotic susceptibility analysis showed that SBY-G was highly sensitive to amoxicillin, cefixime, cefamandole, ceftriaxone, norfloxacin and other fifteen antibiotics, moderate sensitive to cefotaxime, gentamicin, kanamycin and other six antibiotics, while resistant to ampicillin, oxacillin, cefuroxime, ceftazidime, streptomycin, neomycin and other eighteen antibiotics. Artificial infection experiments showed that the median lethal dosage（LD50）of the SBY-G strain on zebra fish was calculated as 1×105cfu/g. The results of this study provide a scientific reference for the prevention, treatment and diagnosis of fish diseases caused by.

;;;antibiotic susceptibility analysis

1008-5394（2021）04-0035-06

10.19640/j.cnki.jtau.2021.04.009

Q959.48

A

2020-03-28

天津市自然科學基金項目（19JCZDJC34600）；天津市企業(yè)科技特派員項目（18JCTPJC64700，19JCTPJC60100）

裴立碩（1997—），女，本科在讀，主要從事魚類疾病與免疫學研究。E-mail：2440076384@qq.com。

孫敬鋒（1976—），男，教授，博士，主要從事水產動物病害及免疫學研究。E-mail：sun_jf@163.com。

責任編輯：張愛婷