林玉暖，候運(yùn)郁，米 多，李春霞，陶 均

（1.海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)院;2.海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院,海口 570228）

環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）是細(xì)菌中普遍存在的第二信使分子，首次在葡糖酸醋酸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，是纖維素合酶的異構(gòu)激活因子[1-2]。其后的研究結(jié)果表明，c-di-GMP 參與調(diào)節(jié)各種生物過程如致病性、運(yùn)動性、生物被膜、胞外多糖及胞外酶等[3-4]。胞內(nèi)c-di-GMP 水平受含有GGDEF、EAL 或HD-GYP 結(jié)構(gòu)域蛋白的調(diào)控：GGDEF 蛋白負(fù)責(zé)c-di-GMP 合成，而EAL 或HD-GYP 蛋白參與c-di-GMP 的分解[5]。GGDEF 結(jié)構(gòu)域含有約180 個氨基酸殘基，具有保守的Gly-Gly-Asp-Glu-Phe 氨基酸殘基序列[6]。在新月形桿菌（Caulobacter crescentus）中，GGDEF 結(jié)構(gòu)域蛋白PleD 具有雙鳥苷酸環(huán)化酶活性，調(diào)控細(xì)菌的運(yùn)動功能，促進(jìn)細(xì)胞從運(yùn)動轉(zhuǎn)向靜止[7-9]。EAL 結(jié)構(gòu)域長約250 個氨基酸，Glu-Ala-Leu 序列高度保守，可調(diào)控細(xì)菌生物被膜的形成和運(yùn)動性[10]。有時GGDEF 和EAL 結(jié)構(gòu)域共存于同一個蛋白中，可能只有其中1 個結(jié)構(gòu)域有功能。例如，銅綠假單胞菌BifA 含有GGDEF 和EAL 結(jié)構(gòu)域，但其沒有c-di-GMP 合成卻有分解活性[5]。稻黃單胞菌水稻致病變種（Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo）是引起水稻白葉枯病的病原菌[11]，可對水稻造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。C-di-GMP 代謝相關(guān)蛋白同樣參與Xoo 致病力的調(diào)控，如：①GGDEF 結(jié)構(gòu)域蛋白GdpX1 具有合成c-di-GMP 的活性，調(diào)節(jié)Xoo的運(yùn)動能力、胞外多糖的含量以及致病力[12]；② EAL 結(jié)構(gòu)域蛋白PXO_03877 具有降解c-di-GMP 的活性，增強(qiáng)細(xì)菌的致病性、運(yùn)動性、胞外多糖合成以及生物被膜的形成能力[13]；③GGDEF/EAL 結(jié)構(gòu)域蛋白PdeR 與組氨酸激酶PdeK 組成雙組份系統(tǒng)，磷酸化的PdeR 具有分解c-di-GMP 的能力，pdeR突變降低Xoo 的致病性、胞外多糖及生物被膜的含量，但對運(yùn)動性和胞外酶無明顯影響[14]。本研究分析了Xoo 中另一個GGDEF/EAL 結(jié)構(gòu)域蛋白CrxV 對運(yùn)動性、生物被膜、胞外多糖以及胞外酶等毒力因子的調(diào)控作用，為進(jìn)一步分析c-di-GMP 在Xoo 與水稻互作中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料Xoo野生型菌株P(guān)XO99A、大腸桿菌DH5a、基因敲除載體pK18mobSacB、過表達(dá)載體菌株pHM1 等均由筆者所在的實(shí)驗(yàn)室保存；一般化學(xué)藥品購自廣州化學(xué)試劑公司；PCR 試劑購自諾唯贊生物科技有限公司；內(nèi)切酶和連接酶購自NEB 生物科技有限公司；快速質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂凝膠DNA 回收試劑盒等購自天根生物科技有限公司；IR24 水稻用于檢測Xoo的致病力；用SMART 軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.2 突變體與互補(bǔ)菌株的構(gòu)建及其致病力分析將crxV基因上下游各約500 bp 的序列通過PCR 擴(kuò)增、酶切（HindIII/XbaI 與XbaI/EcoRI）回收后連接到自殺性載體pK18mobSacB（HindIII/EcoRI 酶切），獲得敲除載體pK-crxV，電擊轉(zhuǎn)化PXO99A菌株，采用同源重組2 次交換的方法構(gòu)建突變體ΔcrxV[15-16]。利用PCR 方法擴(kuò)增crxV基因片段，酶切（HindIII/EcoRI）回收后連接互補(bǔ)載體pHM1（HindIII/EcoRI 酶切），然后轉(zhuǎn)化ΔcrxV獲得互補(bǔ)菌株C-ΔcrxV（引物序列見表1）。為便于比較，野生型菌株和ΔcrxV也轉(zhuǎn)入空載體pHM1。采用剪葉法檢測致病力，將突變體菌株ΔcrxV-pHM1、野生型菌株P(guān)XO99A-pHM1 和互補(bǔ)菌株C-ΔcrxV接種至生長期為60 d 的水稻葉片上，14 d 后統(tǒng)計(jì)水稻的發(fā)病情況。

表1 引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.3 胞外酶活性檢測參照文獻(xiàn)[17]的方法檢測胞外酶的活性，將突變體菌株ΔcrxV-pHM1、野生型菌株P(guān)XO99A-pHM1 和互補(bǔ)菌株C-ΔcrxV置28 ℃條件下液體培養(yǎng)48 h 后，取1 mL 培養(yǎng)物用ddH2O 洗滌2 遍，用1 mL ddH2O 重懸菌體。取3 μL 重懸液分別接種至纖維素檢測培養(yǎng)基、淀粉酶檢測培養(yǎng)基和蛋白酶檢測培養(yǎng)基上，在28 ℃條件下靜置培養(yǎng)5 d。PGA 培養(yǎng)基：1 g·mL-1Tryptone、1 g·mL-1葡萄糖、0.1 g·mL-1L-谷氨酸鈉、1.5% agar；纖維素檢測培養(yǎng)基為PGA 培養(yǎng)基+0.5%羧甲基纖維素；淀粉酶檢測培養(yǎng)基為PGA 培養(yǎng)基+0.1%可溶性淀粉；蛋白酶檢測培養(yǎng)基為PGA 培養(yǎng)基+2%脫脂奶粉。纖維素酶活性測定方法：0.1%剛果紅染色30 min，用1mol·L-1的NaCl 溶液洗2 次，觀察酶水解直徑(cm)；淀粉酶活性測定方法：1：100 I2/KI (0.08% mol·L-1I2，3.2 mol·L-1KI)溶液染色10 min，觀察酶水解直徑（cm）；蛋白酶活性測定方法：直接在蛋白培養(yǎng)基上觀察水解光圈（cm）。每個試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 游動性檢測 參照文獻(xiàn)[18]的方法檢測游動性。用牙簽蘸取1.3 節(jié)中的菌重懸液，垂直接種于含0.25%瓊脂的游動性培養(yǎng)基（0.03%Tryptone,0.03%Yeast-extract,0.25%agar）底部，在28 ℃條件下靜置培養(yǎng)4 d，測量菌株在培養(yǎng)基表面游動的直徑（cm）并統(tǒng)計(jì)。重復(fù)3 次。

1.5 生物被膜及胞外多糖試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[19 -20]的方法檢測生物被膜的形成及胞外多糖的產(chǎn)生。取單克隆細(xì)菌在PSA 中培養(yǎng)48 h 后，取2 mL 菌在5 500 r·min-1條件下離心3 min，收集菌體，用M210 培養(yǎng)基（5 g·L-1蔗糖；8 g·L-1酶水解酪素；4 g·L-1Yeast-extract；3 g·L-1K2HPO4；0.3 g·L-1MgSO4· 7H2O，pH7.0）洗滌2 次，再加入M210 重懸，把重懸液的OD600調(diào)至0.5。生物被膜實(shí)驗(yàn)：取2 mL 重懸液（OD600=0.5）接種至玻璃試管，在28 ℃下靜置培養(yǎng)4 d，緩慢倒出玻璃試管底的培養(yǎng)基，用H2O 洗滌3 遍，0.1%結(jié)晶紫染色液染色30 min，再用H2O 洗滌3 遍，加入3 mL90%乙醇溶解，在OD590下測吸光值。胞外多糖實(shí)驗(yàn)：取2 μL 重懸液（OD600=0.5）接種至PGA 培養(yǎng)基表面，在28 ℃下靜置培養(yǎng)4 d，觀察菌落表面形態(tài)。試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 CrxV 保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果根據(jù)SMART 預(yù)測結(jié)果，CrxV 含有GGDEF、EAL、HAMP 結(jié)構(gòu)域(圖1)。GGDEF 和EAL 可能參與c-di-GMP 的合成與分解，而HAMP 可能通過調(diào)控CrxV 的二聚體化影響GGDEF 和EAL 的活性，因此，CrxV 可能參與c-di-GMP 的代謝，調(diào)控細(xì)菌對外界環(huán)境的響應(yīng)能力。

圖1 CrxV 的保守結(jié)構(gòu)域保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測采用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)；GGDEF：c-di-GMP 合成結(jié)構(gòu)域；EAL：c-di-GMP 分解結(jié)構(gòu)域；HAMP：CrxV 二聚化結(jié)構(gòu)域。Fig.1 The conserved domains of CrxVCrxV conserved domains,analyzed by SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) with default parameters.GGDEF：The domain involved in c-di-GMP synthesis,EAL：The domain involved in c-di-GMP degradation,HAMP：The protein dimerization domain;Blue box:Transmembrane helix;Pink box:low complexity regions.

2.2 crxV 突變體的成功構(gòu)建為了分析crxV的功能，本實(shí)驗(yàn)采用同源重組2 次交換法構(gòu)建了crxV的缺失突變體（圖2）。結(jié)果顯示：crxV突變體基因組擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 000 bp，而野生型PXO99A基因組擴(kuò)增片段比突變體長約1 500 bp（與crxV基因大小一致），說明crxV突變體構(gòu)建成功。

圖2 PCR 驗(yàn)證 crxV 突變體（ΔcrxV）M：DL2000 Marker；1、2：ΔcrxV；W：野生型 PXO99A；N：陰性對照Fig.2 PCR confirmation of the crxV mutantM:DL2000 Marker;lanes 1 and 2:ΔcrxV；W:wild-type PXO99A；N:negative control.

2.3 crxV 突變與Xoo 致病性的關(guān)系為了分析基因?qū)oo的致病性，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了ΔcrxV的互補(bǔ)菌株C-ΔcrxV。致病性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ΔcrxV的病斑長度比野生型PXO99A的病斑長度減短了3 cm 左右，互補(bǔ)菌株的致病力與野生型基本一致（圖3）。說明CrxV 是Xoo 侵染所必需的。

圖3 PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV 的致病性分析A：接種水稻14 d 后，野生型菌株P(guān)XO99A-pHM1、突變體菌株ΔcrxV-pHM1 和互補(bǔ)菌株C-ΔcrxV 的病斑特征，H2O 為空白對照。B：接種14 d 后的水稻病斑長度/cm (*:P<0.05,**:P<0.01)。Fig.3 Virulence analysis of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxVA:The lesions caused by PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxV (H2O:mock control).B:The lesion lengths (cm) of the infected IR24 leaves after 14 days’ inoculation of the indicated Xoo strains (*:P<0.05,**:P<0.01,compared withPXO99ApHM1).

2.4 crxV 突變與Xoo 運(yùn)動性的關(guān)系運(yùn)動性是Xoo的重要毒力因子之一，且受c-di-GMP 調(diào)控[21]，為此有必要分析crxV突變是否影響Xoo的運(yùn)動能力。PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV的游動能力分析結(jié)果（圖4）表明，這3 個菌株之間泳動能力沒有顯著差異，說明CrxV不調(diào)控Xoo 的運(yùn)動性。

圖4 PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV 的 游 動能力上圖：細(xì)菌在平板上的游動表型；下圖：游動直徑的統(tǒng)計(jì)分析。Fig.4 The swimming abilities of PXO99A-pHM1,ΔcrxVpHM1 and C-ΔcrxVUp panel:swimming phenotypes of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxV;Down panel:the diameters of swimming zones of the indicated strains.All the experiments were repeated triple times.Values are given as means ± SD.

2.5 crxV 突變與Xoo 生物被膜形成的關(guān)系胞外多糖和生物被膜是Xoo的毒力因子，與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)[14]。為分析胞外多糖的產(chǎn)生和生物被膜的形成，本實(shí)驗(yàn)將菌株接種至PGA 固體培養(yǎng)基表面和M210 液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)4 d 后發(fā)現(xiàn)，PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV菌落表面無明顯差別，而ΔcrxV-pHM1 的生物被膜形成的量比PXO99A-pHM1 高出了2 倍，回補(bǔ)菌株與野生型菌株的生物被膜形成量接近一樣（圖5），說明CrxV 負(fù)調(diào)控Xoo生物被膜的形成，但可能不調(diào)控細(xì)菌胞外多糖的產(chǎn)生。

圖5 PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV 產(chǎn)生生物被膜（A）及胞外多糖（B）的能力A：液體靜置培養(yǎng)4 d 后生物被膜含量分析。上圖：氣液表面生物被膜的結(jié)晶紫染色；下圖：生物膜含量的定量分析（*:P<0.05）。B：PGA 固體培養(yǎng)基上菌落的生長情況及表型特征。Fig.5 The biofilm (A) and extracellular polysaccharide (B)contents of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and CΔcrxVA:The biofilm contents of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxV 4 days after incubation (*:p<0.05).Up panel:the crystal violet staining biofilm synthesized in the liquid-gas interfaces;Down panel:the biofilm contents of the indicated strains (OD590).All the experiments were repeated triple times.Values are given as means ± SD.*:P <0.05,compared withPXO99A-pHM1.B:The colony phenotypes (4 days after incubation) of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxV.

2.6 crxV 突變與Xoo 胞外酶活性的關(guān)系胞外酶通過Ⅱ型分泌系統(tǒng)將毒力因子分泌至胞外，促進(jìn)細(xì)菌對寄主的致病力，胞外酶合成或分泌可能受c-di-GMP 調(diào)控[22-23]。如圖6 所示，PXO99A-pHM1、ΔcrxVpHM1 和C-ΔcrxV菌株間的胞外纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶活性均沒有顯著差別，說明CrxV 不調(diào)控Xoo 胞外酶的合成或分泌。

圖6 PXO99A-pHM1、ΔcrxV-pHM1 和C-ΔcrxV 胞外酶活性分析A：蛋白酶活性；B：淀粉酶活性；C：纖維素酶活性。1：PXO99A-pHM1；2：ΔcrxV-pHM1；3：C-ΔcrxV。Fig.6 The extracellular enzyme activities of PXO99A-pHM1,ΔcrxV-pHM1 and C-ΔcrxVA:protease activities;B:amylase activities;C:cellulase activities.1：PXO99A-pHM1；2：ΔcrxV-pHM1；3：C-ΔcrxV.All the experiments were repeated triple times with same results.

3 討論

C-di-GMP 分別由GGDEF 結(jié)構(gòu)域蛋白負(fù)責(zé)合成和EAL/HD-GYP 結(jié)構(gòu)域蛋白負(fù)責(zé)降解，胞內(nèi)受體通過感知c-di-GMP 水平調(diào)控細(xì)胞多個代謝途徑，影響細(xì)菌的生長及環(huán)境適應(yīng)能力。通常低水平的c-di-GMP 提高細(xì)菌的運(yùn)動能力，高水平的c-di-GMP 則有利于生物被膜的形成，調(diào)節(jié)細(xì)菌的致病能力[4]。在Xoo 中，GGEDF 結(jié)構(gòu)域蛋白GdpX1，通過負(fù)調(diào)控胞外多糖的產(chǎn)生和運(yùn)動性從而抑制Xoo 的致病性[12]。EAL 結(jié)構(gòu)域蛋白PXO_03877 具有c-di-GMP 水解酶活性，正調(diào)控致病性、生物膜的形成和胞外多糖的產(chǎn)生[13]。PdeR 含有保守的GGDEF 和EAL 結(jié)構(gòu)域，作為響應(yīng)調(diào)節(jié)因子與組氨酸激酶PdeK 組成雙組份系統(tǒng)，正調(diào)控Xoo致病性和胞外多糖的產(chǎn)生[24]。同PdeR 類似，CrxV 也含有保守的GGDEF 和EAL 結(jié)構(gòu)域，但其具體工作還不清楚。由于致病性與c-di-GMP 的含量可能成負(fù)相關(guān)[13,24],crxV突變導(dǎo)致Xoo 致病力降低，因此CrxV 可能作為c-di-GMP 分解酶，其GGDEF 結(jié)構(gòu)域可能沒有酶活性。雖然研究發(fā)現(xiàn)Xoo 中影響致病性的c-di-GMP 代謝酶都可能調(diào)控諸如運(yùn)動性、胞外多糖和胞外酶等毒力因子的合成或分泌[13,24]，但crxV突變并不影響這些因子的形成或分泌。有趣的是，crxV突變導(dǎo)致Xoo 生物被膜含量顯著增加。生物被膜形成和解聚是細(xì)菌致病重要的調(diào)節(jié)過程，缺一不可。因此，CrxV 可能負(fù)調(diào)控生物被膜的解聚，進(jìn)而正調(diào)控病原菌的致病力。以上結(jié)果雖然顯示CrxV 可能通過介導(dǎo)c-di-GMP 代謝，影響病原菌生物被膜的含量，調(diào)控病原菌的致病力，但CrxV 的酶活性及其在生物被膜形成與解聚中的作用還不清楚，尚需做進(jìn)一步研究。