柳毓文 劉 萍 胡 娜 葛洪亮 彭雨薇

江西省萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，江西萍鄉(xiāng) 337000

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）屬于自身免疫性疾病，患者多伴有發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、蝶形紅斑等癥狀，若未得到及時(shí)治療，可能會(huì)累及多個(gè)系統(tǒng)，引起多種并發(fā)癥[1-2]。SLE 疾病活動(dòng)指數(shù)（SLE disease activity index，SLEDAI）為臨床評(píng)估 SLE 患者病情嚴(yán)重程度的常用方法， 可將SLE 分為活動(dòng)期與緩解期，但SLEDAI 容易受評(píng)估人主觀意識(shí)影響，且評(píng)估內(nèi)容較多， 導(dǎo)致其在臨床中應(yīng)用存在一定局限性。而臨床對(duì)于不同病情的SLE 患者其治療方法也不盡相同，緩解期患者經(jīng)臨床積極治療后預(yù)后良好，病情容易控制，但活動(dòng)期患者臨床治療難度較高，且病情復(fù)雜，極易引發(fā)狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN），嚴(yán)重?fù)p傷腎臟功能，影響疾病預(yù)后[3-4]。因此，采取有效的手段積極評(píng)估SLE 患者病情具有重要意義。 程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）、程序性死亡配體-2（programmed death ligand-2，PD-L2）均為程序性死亡受體1（programmed death receptor 1，PD-1）的配體，研究指出，PD-1 與其配體組成的信號(hào)途徑具有負(fù)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)作用，且在免疫活化與耐受中具有重要作用[5]。 以往，臨床對(duì)PD-1 的配體PD-L1關(guān)注度較高，而有關(guān)PD-1 的另一個(gè)配體PD-L2 關(guān)注度較低。 基于此，本研究旨在分析外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的 PD-L2 分子在SLE 中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析 2019 年 1 月至 2020 年 1 月萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院收治的 30 例 SLE 患者臨床資料，將SLEDAI[6]評(píng)分＞5 分的15 例活動(dòng)期狼瘡性腎炎患者納入活動(dòng)期組，將SLEDAI 評(píng)分≤5 分的15 例緩解期狼瘡患者納入緩解期組，并選取同期于萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院接受治療的10 例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者作為活動(dòng)期陽(yáng)性對(duì)照病例納入RA 組及接受體檢的10 例健康志愿者納入正常對(duì)照組。 活動(dòng)期組中，男 3 例，女 12 例；年齡 46~74 歲，平均（58.69±2.36）歲；病程 2~6 個(gè)月，平均（4.04±0.52）個(gè)月；體重指數(shù)（body mass index，BMI） 21~27 kg/m2，平均（22.89±1.25）kg/m2。 緩解期組中，男 5 例，女 10 例；年齡 46~75 歲，平均（58.73±2.08）歲；病程 2~6 個(gè)月，平均（4.02±0.55） 個(gè)月；BMI I21~27 kg/m2， 平均 （22.92±1.19）kg/m2。RA 組中，男 4 例，女 6 例；年齡 44~72 歲，平均（58.91±2.15）歲；病程 1~5 個(gè)月，平均（4.03±0.32）個(gè)月；BMI 22~27 kg/m2，平均（23.10±1.06）kg/m2。 正常對(duì)照組中，男 6 例，女 4 例；年齡 45~73 歲，平均（59.02±2.10）歲；BMI 21~27kg/m2，平均（22.96±1.20）kg/m2。 納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合《系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷及治療指南》[7]內(nèi)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，LN：尿蛋白定量＞0.5 g/d；②年齡18~75 歲者；③活動(dòng)期組患者未用過激素和免疫抑制劑或停藥后復(fù)發(fā)。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期或哺乳期婦女；②伴有其他系統(tǒng)性結(jié)締組織病者；③合并腫瘤性疾病者。 四組患者性別、年齡、BMI 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。 本研究經(jīng)萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

PBMC 的PD-L2 分子表達(dá)水平檢測(cè)：①實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR） 檢測(cè) PDL2 分子表達(dá)水平方法如下： 應(yīng)用淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll）梯度分離 PBMC，使用 TRIzol 抽提 PBMC 中總 RNA（TaKaRa，大連），Oligo-dT 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后置于-20oC 下備用。 內(nèi)參引物為 β-actin，序列為：正向 5′-ATCTGCCACCACACCTTCTACC-3′； 反向 5′-GATAGCACAGCCTGGATAGCAA3′。 PD-L2 引物序列為：正向 5′-GTCAGATGGAACCCAGGACC-3′；反向5′-TAGGCTCCAGAGGTGAGTCC-3′。 Real-time PCR使用德國(guó)QIGEN 公司提供的SYBR，采用PCR 兩步法進(jìn)行試驗(yàn)，具體為 60℃、30 s，90℃、10 s，45 個(gè)循環(huán)，結(jié)果應(yīng)用循環(huán)閾值（cycle threshold，CT）表示，基因表達(dá)量為目的基因PD-L2 的CT 值-內(nèi)參引物CT 值得到的△CT。 ②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-L2 分子表達(dá)水平方法如下： 使用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估外周血T 細(xì)胞、B 細(xì)胞與PBMC 中 PD-L2 的表達(dá)。 使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline solution，PBS） 對(duì)方法①中得到的PBMC 進(jìn)行洗滌， 并制成1×106單細(xì)胞懸液，提取50 μl 單細(xì)胞混懸液與3 μl 德國(guó)美天旎公司提供的異硫氰酸熒光素標(biāo)記CD14 抗體及美國(guó)BD 公司提供的抗原呈遞細(xì)胞標(biāo)記PD-L2 抗體共孕0.5 h，經(jīng)PBS 洗滌后避光保存待檢，使用美國(guó)BD 公司提供的Accuri C6 型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

記錄患者PD-L2 分子表達(dá)水平、比較各組PD-L2分子表達(dá)水平、分析SLEDAI 評(píng)分與PD-L2 分子表達(dá)水平的相關(guān)性、 及PD-L2 分子對(duì)SLE 患者病情活動(dòng)程度的預(yù)測(cè)價(jià)值。 ①記錄不同性別、年齡、體重患者PD-L2 分子表達(dá)水平。 ②比較四組患者PD-L2 分子表達(dá)水平。 ③分析SLE 患者SLEDAI 評(píng)分與PD-L2分子表達(dá)水平的相關(guān)性。 ④分析PD-L2 分子表達(dá)水平對(duì)SLE 患者病情活動(dòng)程度的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示， 組間比較采用 χ2檢驗(yàn)；SLEDAI 評(píng)分與PD-L2 分子表達(dá)水平的相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)；繪制受試者工作曲線（receiver operating curve，ROC），得到曲線下面積（area under the curve，AUC），分析PD-L2 分子表達(dá)水平對(duì)SLE 患者病情嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)價(jià)值，以P＜0.05 為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同性別、年齡、體重SLE 患者PD-L2 分子表達(dá)水平的比較

不同性別、年齡、體重的SLE 患者PD-L2 分子表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表 1）。

表1 不同性別、年齡、體重SLE 患者PD-L2 分子表達(dá)水平的比較（）

表1 不同性別、年齡、體重SLE 患者PD-L2 分子表達(dá)水平的比較（）

組別 例數(shù) PD-L2 t 值 P 值性別（例）0.6880.497男女8 22 10.26±2.13 10.85±2.06年齡（歲）＜60≥60體重（kg/m2）＜24≥24 0.9280.361 23 7 11.03±1.89 11.74±1.25 0.1190.906 21 9 10.11±1.76 10.03±1.49

2.2 四組患者PD-L2 分子表達(dá)水平的比較

活動(dòng)期組PD-L2 分子表達(dá)水平高于緩解期組與正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；活動(dòng)期組PD-L2 分子表達(dá)水平與RA 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表 2）。

表2 四組患者PD-L2 分子表達(dá)水平的比較（%，）

表2 四組患者PD-L2 分子表達(dá)水平的比較（%，）

與活動(dòng)期比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) PD-L2活動(dòng)期組緩解期組RA 組正常對(duì)照組F 值P 值15 15 10 10 14.02±3.12 9.79±1.02a 17.02±4.36 6.16±1.05a 33.502＜0.001

2.3 SLE 患者SLEDAI 評(píng)分與PD-L2 分子表達(dá)水平的相關(guān)性分析

活動(dòng)期組患者 SLEDAI 評(píng)分為（8.45±2.13）分，緩解期組患者 SLEDAI 評(píng)分為（3.01±0.54）分。 經(jīng) Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，SLE 患者SLEDAI 評(píng)分與 PDL2 分子表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.946，P=0.000）。

2.4 PD-L2 分子表達(dá)水平對(duì)SLE 患者病情活動(dòng)程度的預(yù)測(cè)價(jià)值

將SLE 患者病情活動(dòng)程度作為狀態(tài)變量（1=活動(dòng)期，0=緩解期）， 將PD-L2 分子表達(dá)水平作為檢驗(yàn)變量，繪制 ROC 曲線（圖 1），結(jié)果顯示，PD-L2 分子表達(dá)水平預(yù)測(cè)SLE 患者處于活動(dòng)期的 AUC 為0.820，AUC 的 95%置信區(qū)間為 0.662~0.978， 標(biāo)準(zhǔn)誤為0.081，P 值為 0.003，最佳閾值為12.17%，靈敏度為0.800，特異度為0.800，約登指數(shù)為0.600，具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。

圖1 PD-L2 分子表達(dá)水平對(duì)SLE 患者病情活動(dòng)程度的預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC 曲線圖

3 討論

SLE 發(fā)生后可能會(huì)累及腎臟、血液、呼吸道、淋巴等臟器與系統(tǒng)，以腎臟損傷最為常見，且該疾病發(fā)生與發(fā)展均與免疫功能紊亂有關(guān)，并且免疫功能情況與疾病活動(dòng)情況及器官損傷具有密切聯(lián)系[8]。 而PBMC的PD-L2 分子表達(dá)與免疫功能有關(guān)[9]。

已有大量研究顯示，SLE 患者 PBMC 中 PD-1、PD-L1 表達(dá)異常，且提出PD-1 受體表達(dá)降低會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體免疫耐受功能， 進(jìn)而生成大量自身抗體，而關(guān)于PD-1 另一個(gè)配體PD-L2 在SLE 患者中的生物學(xué)功能機(jī)制尚未明確[10-12]。本研究結(jié)果顯示，活動(dòng)期組PD-L2 分子表達(dá)水平高于緩解期組與正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；活動(dòng)期組 PD-L2 分子表達(dá)水平與 RA 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，SLE 患者 SLEDAI 評(píng)分與PD-L2 分子表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.946，P=0.000），提示PBMC 的PD-L2 分子表達(dá)水平可能與SLE 患者病情活動(dòng)程度存在一定關(guān)聯(lián)，且表現(xiàn)為正相關(guān)。 分析其原因?yàn)椋琍D-1/PD-L 為CD28/B7 家族重要成員，可通過抑制T 細(xì)胞活化與增殖發(fā)揮調(diào)控免疫應(yīng)答作用，而近年來，也有研究指出其對(duì)T 細(xì)胞活化也具有一定作用[13-14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，一系列正性與負(fù)性刺激信號(hào)共同介導(dǎo)了T 細(xì)胞活化， 而PD-L2 分子是一種重要的負(fù)性共刺激分子，故其對(duì)T 細(xì)胞活化也可能具有一定作用[15-16]。 根據(jù)上述研究結(jié)果，本研究推測(cè)，PD-L2 分子高表達(dá)可能是SLE 患者病情嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)因子。為證實(shí)這一推測(cè)，最后繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，PD-L2 分子表達(dá)水平預(yù)測(cè)SLE 患者處于活動(dòng)期的AUC 為0.820，具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，表明PD-L2 可作為SLE 患者病情嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)因子。 鑒于本研究樣本量較少，若條件允許，后期工作可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本來以證實(shí)本研究結(jié)果，此工作可能為探索PD-L2分子生物學(xué)功能， 為研究SLE 發(fā)病機(jī)制及預(yù)后評(píng)估中提供參考依據(jù)。

綜上所述，PBMC 的PD-L2 分子表達(dá)水平與SLE患者病情活動(dòng)程度密切相關(guān)，臨床可通過檢測(cè)PBMC的PD-L2 分子表達(dá)水平及時(shí)評(píng)估SLE 患者病情狀況，以制定有效的治療方案。