馬世琦 鄧秀玲 吳亞男 韓晶晶 趙 陽 喬一蕓 王海生▲

1.內蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院門診辦公室，內蒙古呼和浩特 010020；2.內蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，內蒙古呼和浩特 010110；3.內蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學實驗中心，內蒙古呼和浩特 010110

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的肝癌組織學亞型，占全世界原發(fā)性肝癌的80%以上[1]。 在全球范圍內，HCC 是與癌癥相關死亡的第四大最常見原因，其五年生存率僅為18%，是僅次于胰腺癌的第二大致命腫瘤[2-3]。 由于大部分HCC 患者發(fā)現(xiàn)時已處于進展期，而全身化療的中位生存時間也不到1 年，治療效果不理想[4]。阿拉嘎斑布是我國的傳統(tǒng)蒙藥，是芫菁科昆蟲的干燥蟲體，其具有破血逐瘀、散結消癥、滋補腎陽、調理體素、增強抵抗力等功效[5]，其有效藥物成分主要為斑蝥素（cantharidin，CTD），分子式C10H12O4，分子量196.2 D。 有關CTD 的提取方法不盡相同，主要有震蕩靜置提取法、超聲波震蕩提取法、冷浸提取法、堿水提取法、熱回流提取法等[6-9]。有文獻報道，芫菁蟲體不同部位的CTD 產率有差別，其中產率最高的部位為蟲體的腹部，并且發(fā)現(xiàn)干燥蟲體較活體蟲體能獲得更多的CTD[10]。CTD 對多種人類惡性腫瘤均表現(xiàn)出顯著的抗癌活性，如對喉癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、皮膚癌等多種腫瘤的生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用[11-14]。但是，CTD 對肝癌抑制作用的具體分子機制目前仍不完全清楚。本研究選用蒙藥阿拉嘎斑布蟲體作為研究藥物，使用課題組前期通過混合法提取的CTD 作為實驗用藥，研究其對HepG2 細胞的影響，并通過RNA 測序， 嘗試從分子水平及基因表達譜的角度對CTD 治療肝癌的分子機制進行研究， 為蒙藥用于肝癌的治療提供新的線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

HepG2 細胞株購自武漢普諾賽生物科技有限公司；阿拉嘎斑布干燥蟲體購自內蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院；胎牛血清購自美國GIBCO 公司；CTD 標準品及PI細胞周期檢測試劑盒購自西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司；MTT 試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；Caspase-GloR3/7 檢測試劑盒購自普洛麥格北京生物技術有限公司；RNAiso Plus Total RNA 提取試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 本研究所用的HepG2 細胞株， 于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀態(tài)，2~3 d 傳代一次。

1.2.2 CTD 母液的配制 將課題組前期提取的CTD 白色粉末用含1‰二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的DMEM 基礎培養(yǎng)液進行超聲溶解配制母液， 使用時再用完全培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.2.3 實驗分組設置 空白對照組（Blank）：不含細胞，加只含有1‰ DMSO 藥物溶劑的完全培養(yǎng)液；溶劑對照組（Mock）：含正常目的細胞，加只含有1‰ DMSO藥物溶劑的完全培養(yǎng)液；實驗組（CTD）：含正常目的細胞，加含有相應濃度CTD 的含藥培養(yǎng)液。

1.2.4 MTT 法檢測增殖 于3 塊96 孔板內接種細胞，每組三個復孔，孵育24 h 后加藥處理，分別于24、48、72 h 后檢測光密度（optical density，OD）值。 實驗分為Blank 組、Mock 組和 CTD 組， 其中 CTD 組的濃度分別為 0.05、0.1、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024 μmol/L。使用 Graphpad prism 5 軟件進行半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）數(shù)值計算。

1.2.5 Caspase 3/7 熒光法檢測凋亡 于96 孔板內接種細胞，每組三個復孔，孵育48 h 后加藥處理，48 h后加Caspase 3/7 反應液檢測。 實驗分組同1.2.4。

1.2.6 流式細胞儀PI 單染法檢測細胞周期 于6 孔板內接種細胞，每組三個復孔，孵育24 h 后加藥處理，48 h 后收集細胞，于4℃冰箱固定24 h，加入Rnase A溶液和PI 染色液后上機檢測。 實驗分為Mock 組和CTD 組，實驗重復 3 次。

1.2.7 測序技術檢測差異表達的mRNA 收集足量細胞，采用Trizol 法提取總RNA 后進行建庫，質檢合格后，采用Illumina 測序平臺進行RNA seq，隨后進行差異基因篩選，并進行富集分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件和GraphPad Prism 5進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT 法檢測結果

檢測結果見圖1。CTD 對HepG2 的抑制呈現(xiàn)一定程度的劑量-時間依賴，且 24、48、72 h 的 IC50分別為54.420、9.892、4.132 μmol/L，48 h 對應曲線的線性效果最佳。因此，參考 48 h 的 IC50值，將 10 μmol/L 作為后續(xù)實驗的CTD 藥物濃度。

圖1 CTD 作用于HepG2 的劑量反應曲線

2.2 Caspase 3/7 熒光法檢測結果

Caspase 3/7 熒光法檢測結果見圖2。結果表明，加藥作用 48 h 后，MOCK 組熒光強度為 7661.67±108.87，CTD 組為 24 310.00±305.50，與 MOCK 組比較，CTD組熒光強度有明顯的增強， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），CTD 是 HepG2 凋亡的有效誘導物。

圖2 CTD 對HepG2 細胞凋亡的影響

2.3 流式細胞儀PI 單染法檢測的 CTD 對HepG2 細胞周期的影響

流式細胞儀PI 單染法檢測結果見圖3（封三）。與MOCK 組比較， 加藥作用 48 h 后，G0/G1期和 S 期下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而 G2/M 期則明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），CTD 可將 HepG2細胞周期阻滯于G2/M 期。

圖3 CTD 對HepG2 細胞周期的影響

2.4 測序技術檢測 CTD 對 HepG2 細胞 mRNA 差異表達譜的影響

2.4.1 差異基因篩選結果 mRNA 差異基因統(tǒng)計結果見圖4（封四）。 當差異基因篩選的閾值為|log2（Fold Change）|＞2 且 Padj＜0.05 時 ，mRNA 差 異 基 因 共 計6293 個，其中5694 個差異表達水平升高，599 個差異表達水平下降。

2.4.2 差異基因富集分析結果 差異mRNA 靶基因的GO 功能富集和KEGG 通路富集結果分別見圖5~6（封四），篩選條件均為 Padj＜0.05。 GO 功能富集選擇顯著性最明顯的一個注釋， 即為endoplasmic reticulum lumen（P＜0.05），屬于 cellular component 類目。KEGG通路富集主要富集在p53 signaling pathway、PI3KAkt signaling pathway、Apoptosis、MicroRNAs in cancer以及多種代謝途徑（P＜0.05），差異基因可能通過這些不同的功能及通路調控HepG2 細胞的生物進程。 對于以上篩選出的顯著差異表達mRNA，通過大量的查閱文獻并結合GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，以及按照差異基因相對表達量的變化倍數(shù)從高到低進一步篩選出mRNA 共計18 個基因，其中14 個基因表達水平上調，4 個基因表達水平下調， 結果見表1，這些基因在CTD 作用于HepG2 細胞時可能發(fā)揮關鍵作用。

表1 顯著差異表達的mRNA 基因匯總表

3 討論

本研究將阿拉嘎斑布的有效成分CTD 選為研究藥物，以HepG2 細胞為研究對象，先后從CTD 作用于HepG2 細胞后的細胞增殖、凋亡和周期分布三個角度進行了實驗研究，結果顯示，CTD 可顯著抑制HepG2的增殖，其機制可能與誘導凋亡和觸發(fā)細胞周期阻滯于G2/M 期有關。

為了進一步研究CTD 抑制肝癌的作用機制，本研究采用RNA-seq 測序技術， 從mRNA 基因差異表達譜的角度研究CTD 抑制肝癌的分子機制。 最終篩選出18 個顯著差異表達的mRNA， 這些基因參與調控多種信號通路如p53 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、p38-MAPK 信號通路等。

雙特異性磷酸酶（dual specificity phosphatase,DUSP）、CDKN1A 和 CDK1 是以上篩選出的顯著差異表達的mRNA。DUSP 屬于酪氨酸磷酸酶中的亞家族，其在體內可參與調控多種信號途徑， 與腫瘤關系密切[15-16]。 DUSP1 是 DUSP 的家族成員之一， 研究表明DUSP1 可通過對MAPK 信號通路進行負性調控從而對肝癌細胞的增殖進行抑制[17-19]，提示DUSP1 在肝癌中發(fā)揮的是抑癌作用， 與本研究的測序結果一致，即用 CTD 處理 HepG2 細胞后， 與對照組比較，CTD 組的DUSP1 mRNA 表達水平上調， 可以推測DUSP1 在CTD 的抗肝癌過程中發(fā)揮重要作用。

CDKN1A，又名P21，是細胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的抑制劑，其對細胞周期的調控具有關鍵作用[20-21]。 研究發(fā)現(xiàn)，CDK1 是CDKN1A 的重要靶標，CDKN1A 通過下調CDK1 使其活性受到抑制，從而將細胞周期阻滯于G2/M 期[22]。 這表明CDKN1A 和CDK1 在調控細胞周期階段轉化中起關鍵作用，與本研究的結果一致，即將CTD 作用于HepG2 細胞后，與對照組比較，CTD 組 HepG2 細胞被阻滯于G2/M 期，且 CTD 組的CDKN1A mRNA 表達水平上調， 而CDK1 mRNA 表達水平下調， 提示CDKN1A 對CDK1 的負性調控可能是CTD 將 HepG2 細胞阻滯于G2/M 期的重要環(huán)節(jié)。

以上這些基因中，一部分已經(jīng)有文獻報道其與肝癌或者其他腫瘤在分子機制上的關系，但絕大多數(shù)均未從CTD 的角度進行過分析研究， 而本研究目前的結果已表明這些基因可能會是CTD 抑制肝癌的重要應答基因，因此這些基因將會是本研究下一步繼續(xù)深入研究CTD 抑制肝癌分子機制的研究對象。