胡曉輝崔鳳高楊偉強(qiáng)侯名語(yǔ)張勝忠王 嵩侯 剛王晶珊苗華榮*陳 靜*

(1.山東省花生研究所,山東 青島 266100;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071001;3.安徽省農(nóng)科院作物研究所,安徽 合肥 230001; 4.鐵嶺農(nóng)科院,遼寧 鐵嶺 112616;5.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山東 青島 266109)

籽仁大小是花生產(chǎn)量的重要指標(biāo),改良籽仁大小對(duì)于提高產(chǎn)量具有重要作用。 近年來(lái)已檢測(cè)到一些控制籽仁大小相關(guān)性狀的QTL[1-10],但在多環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá)的QTL 數(shù)量有限。 成良強(qiáng)以富川大花生×ICG6375的F2、F3群體,檢測(cè)到8個(gè)籽仁長(zhǎng)度相關(guān)QTL,位于染色體A05、A07、A10、B01、B08、B09和B10;檢測(cè)到3個(gè)籽仁寬度相關(guān)QTL 位于染色體A01、B03、B06 染色體上[1]。 Huang等利用中花10 號(hào)×ICG12625 構(gòu)建的F2:3群體檢測(cè)到籽仁長(zhǎng)相關(guān)3個(gè)QTL,表型變異解釋率為9.86%～10.48%;籽仁寬相關(guān)4個(gè)QTL,表型變異解釋率6.39%～12.20%[2]。李振動(dòng)利用徐州68-4×遠(yuǎn)雜9102構(gòu)建的RIL 群體,兩年共檢測(cè)到12 個(gè)籽仁長(zhǎng)度相關(guān)QTL、20個(gè)籽仁寬相關(guān)QTL 和15 個(gè)籽仁長(zhǎng)寬比相關(guān)QTL,其中A05、A06 染色體在兩年重復(fù)檢測(cè)到控制籽仁長(zhǎng)(A05)、籽仁寬(A06)、籽仁長(zhǎng)寬比(A05)相關(guān)的QTL[3]。 宋延濱利用遠(yuǎn)雜9102與徐州68-4構(gòu)建的RIL群體和兩張遺傳圖譜,兩圖譜中在染色體A09 上檢測(cè)到籽粒長(zhǎng)修改QTL、在染色體A05和A09上檢測(cè)到籽粒長(zhǎng)寬比相關(guān)QTL[4]。 Chen等利用富川大花生和ICG6375構(gòu)建了RIL群體,在A07重復(fù)檢測(cè)到控制籽仁長(zhǎng)的QTL、在A10 和B02 重復(fù)檢測(cè)到控制籽仁寬的QTL、在A02、A03和A07重復(fù)檢測(cè)到控制籽仁長(zhǎng)寬比的QTL[5]。 Wang等利用ZH16×sd-H1構(gòu)建的RIL 群體和SLAF 高密度遺傳圖譜,在B07染色體上重復(fù)檢測(cè)到控制籽仁長(zhǎng)和籽仁寬的QTL[6]。 Zhang等利用花育36號(hào)×6-13構(gòu)建的RIL群體和SLAF高密度遺傳圖譜,分別檢測(cè)到控制籽仁長(zhǎng)、籽仁寬和籽仁長(zhǎng)寬比的QTL 10個(gè)、5個(gè)和8個(gè),在多環(huán)境下重復(fù)檢測(cè)到位于A02連鎖群上Marker938～Marker893 間控制籽仁長(zhǎng)的QTLqSL2和籽仁長(zhǎng)寬比的QTLqLW2,表型貢獻(xiàn)率為42.43%～83.23%[7]。 Huang等共檢測(cè)到7個(gè)籽仁長(zhǎng)相關(guān)QTL、8個(gè)籽仁寬相關(guān)QTL,其中位于連鎖群A02和B05檢測(cè)到控制籽仁長(zhǎng)主效穩(wěn)定QTLqSLA2.2和qSLB5、連鎖群A03、A07和B06檢測(cè)到控制籽仁寬穩(wěn)定QTLqSWA3、qSWA7.1和qSWB6.2[8]。曾新穎等以中花16和J11雜交的RIL群體為材料,兩個(gè)環(huán)境下檢測(cè)到18個(gè)籽仁長(zhǎng)相關(guān)QTL、16個(gè)籽仁寬相關(guān)QTL,18個(gè)籽仁長(zhǎng)寬比相關(guān)QTL,在連鎖群A05重復(fù)檢測(cè)到控制籽仁長(zhǎng)的QTL和籽仁長(zhǎng)寬比的QTL、在B06連鎖群上重復(fù)檢測(cè)到控制籽仁長(zhǎng)的QTL和籽仁寬的QTL[9]。 Luo等以徐花13號(hào)和中花6號(hào)雜交的RIL群體為材料,在染色體A05上重復(fù)鑒定到籽仁長(zhǎng)的主效QTLqPLA05.1,在染色體A07上重復(fù)鑒定到籽仁長(zhǎng)的主效QTLqPLA07、籽仁寬的主效QTLqPWA07[10]。由此可見,利用不同的材料可能會(huì)檢測(cè)到不同的花生籽仁性狀相關(guān)的QTL,且遺傳效應(yīng)大小各異,因此利用不同群體挖掘不同環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá)的QTL非常有必要。

作物重要性狀基因位點(diǎn)的高效挖掘依賴于遺傳圖譜標(biāo)記的穩(wěn)定性、分布范圍和數(shù)量多少。花生野生種和栽培種參考基因組信息的公布[11-14]和高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用為挖掘花生重要性狀基因位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。 SLAF-seq技術(shù)是一種基于高通量測(cè)序大規(guī)模開發(fā)SNP 及其分型的新技術(shù),在花生圖譜構(gòu)建和QTL 定位方面得到應(yīng)用[6-7,15-16]。

本研究利用花育28 號(hào)和P76 創(chuàng)建RIL 群體,在不同環(huán)境下測(cè)定RIL 群體的籽仁大小,借助SLAF-seq技術(shù)開發(fā)的多態(tài)性SNP 以及實(shí)驗(yàn)室篩選到的多態(tài)SSR,聯(lián)合分析構(gòu)建高密度遺傳圖譜,分析控制花生籽仁大小的QTL,鑒定出遺傳穩(wěn)定、貢獻(xiàn)率高的主效QTL,為花生產(chǎn)量性狀改良奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用花育28號(hào)和P76構(gòu)建的RIL 群體為試驗(yàn)材料。 花育28 號(hào)由山東省花生研究所育成,2008年通過(guò)山東省審定,2019年通過(guò)國(guó)家非主要農(nóng)作物登記;P76為誘變創(chuàng)制的高油酸品系,RIL群體包含146個(gè)株系。

1.2 籽仁大小測(cè)定

2018年RIL群體(F2∶14)和親本種植于山東省花生研究所萊西試驗(yàn)站和山東省農(nóng)科院東營(yíng)試驗(yàn)基地,每份材料1行,行長(zhǎng)1.50 m,行距0.40 m,常規(guī)大田管理。 成熟時(shí)按株系收獲,晾干后剝殼取飽滿籽仁30粒以上,利用萬(wàn)深自動(dòng)籽仁考種分析儀測(cè)定各個(gè)RIL 家系和親本的籽仁長(zhǎng)度和寬度,重復(fù)3次,并計(jì)算各個(gè)RIL 家系和親本籽仁長(zhǎng)寬比。 采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

DNA 提取、SSR 分析和SLAF 文庫(kù)構(gòu)建參照文獻(xiàn)[15],以栽培種Tifrunner基因組為參考。SLAF-seq數(shù)據(jù)分析和基因分型參照Sun等[17]的方法,利用High Map 軟件[18-19]構(gòu)建高密度遺傳圖譜。 以2018年?yáng)|營(yíng)和2018年萊西調(diào)查的RIL群體表型數(shù)據(jù),包含籽仁長(zhǎng)、籽仁寬和長(zhǎng)寬比,利用QTL IciMapping v4.1對(duì)籽仁大小相關(guān)QTL進(jìn)行定位分析。 QTL 的命名規(guī)則為q+性狀+染色體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽仁大小表型性狀的變異

不同環(huán)境下,花育28號(hào)和P76籽仁大小表現(xiàn)有一定差異(表1)。 花育28號(hào)籽仁長(zhǎng)與寬均大于P76,而籽仁長(zhǎng)寬比低于P76。 RIL 群體籽仁大小表現(xiàn)為連續(xù)變異,每個(gè)性狀都表現(xiàn)超親分離,偏度和峰度絕對(duì)值均小于1或接近1,頻數(shù)分布基本符合正態(tài)分布,適合進(jìn)行QTL分析。

表1 親本及RIL群體籽仁相關(guān)表型性狀表現(xiàn)Table 1 Performance of seed size traits in parents and RIL populations

圖1 兩種環(huán)境下花生籽仁長(zhǎng)、籽仁寬、籽仁長(zhǎng)寬比性狀頻率分布Fig.1 Frequency distributions of seed length,seed width,and ratio of seed length to width under two environments

2.2 高密度遺傳圖譜構(gòu)建

以花育28號(hào)/P76組合衍生的146份重組自交家系為作圖群體,利用SLAF-seq技術(shù)開發(fā)多態(tài)標(biāo)簽。 花育28號(hào)SLAF標(biāo)簽數(shù)量426 794,平均深度19.11×;P76的SLAF標(biāo)簽數(shù)量433 211,平均深度18.26×;RIL群體SLAF標(biāo)簽數(shù)量279 638,平均深度4.88×(表2)。 本文共開發(fā)464 453個(gè)SLAF,親本間多態(tài)性的有12 737個(gè)SLAF,滿足aa×bb基因分型的為8 755個(gè),占比1.89%。 對(duì)這些標(biāo)簽進(jìn)行過(guò)濾篩選,獲得高質(zhì)量多態(tài)性SLAF標(biāo)簽為2 350個(gè),在親本和后代中平均測(cè)序深度大于50×和大于10×。

表2 親本及RIL的SLAF數(shù)量及覆蓋深度Table 2 Coverage and number of markers for parents and RIL

利用High Map軟件構(gòu)建了一個(gè)包含20個(gè)連鎖群、上圖標(biāo)記2 411 個(gè)(SLAF 標(biāo)簽2 350 個(gè),SSR標(biāo)記61個(gè))、平均距離為0.76 c M、總圖距為1 814.72 c M 的遺傳圖譜(表3)。 B05連鎖群上圖標(biāo)記數(shù)最多(330個(gè)),標(biāo)記間平均距離0.33 c M;A10連鎖群上圖標(biāo)記數(shù)最少(12個(gè)),連鎖群圖距最短(42.62 c M)。 20個(gè)連鎖群中標(biāo)記間最大距離為22.81 c M,位于B01連鎖群;標(biāo)記平均間距最低的連鎖群為A09,間距0.18 c M,標(biāo)記平均間距最高的連鎖群為B01,間距5.33 c M(表3)。 該圖譜可用于重要農(nóng)藝性狀QTL定位。

表3 花生20連鎖群信息統(tǒng)計(jì)Table 3 Description on characteristics of the 20 linkage groups in peanut

2.3 RIL群體中的QTL定位分析

表4表明,共檢測(cè)到7個(gè)控制籽仁長(zhǎng)的QTL,PVE變幅為3.393%～10.958%。 加性效應(yīng)對(duì)表型的累計(jì)貢獻(xiàn)率為42.227%,加性QTL與環(huán)境互作對(duì)表型累計(jì)貢獻(xiàn)率為4.717%。 檢測(cè)到主效QTL有1個(gè),qSLA 02.2表型貢獻(xiàn)率10.958%,加性表型貢獻(xiàn)率10.536%,LOD值6.993。 與環(huán)境互作對(duì)表型貢獻(xiàn)率相對(duì)較大的QTL為qSLA 07,表明該位點(diǎn)易受環(huán)境影響。

表4 籽仁大小相關(guān)的QTLTable 4 QTLs identification for seed size

共檢測(cè)到控制籽仁寬的QTL5個(gè),PVE變幅為2.759%～12.912%。 加性效應(yīng)對(duì)表型累計(jì)貢獻(xiàn)率為32.496%,加性QTL與環(huán)境互作對(duì)表型累計(jì)貢獻(xiàn)率為0.725%(表4)。 檢測(cè)到主效QTL 有1 個(gè),qSWA02表型貢獻(xiàn)率12.912%,加性表型貢獻(xiàn)率12.910%,LOD 值11.041。

控制籽仁長(zhǎng)寬比的QTL共檢測(cè)到8個(gè),PVE變幅為3.619%～19.256%。 加性效應(yīng)對(duì)表型的累計(jì)貢獻(xiàn)率為63.153%,加性QTL與環(huán)境互作對(duì)表型累計(jì)貢獻(xiàn)率為9.519%(表4,圖2)。 檢測(cè)到主效QTL有3個(gè),qSLWA02.1、qSLWA02.2和qSLWA02.2,LOD 值13.319～17.554,表型貢獻(xiàn)率13.070%～19.256%,加性表型貢獻(xiàn)率12.707%～17.709%。 檢測(cè)到qSLWA09.1和qSLWA09.2與環(huán)境互作對(duì)表型貢獻(xiàn)率的影響相對(duì)較大,累計(jì)5.653%,表明這兩個(gè)位點(diǎn)的表達(dá)易受環(huán)境影響。

圖2 多環(huán)境聯(lián)合分析定位籽仁大小相關(guān)QTL的分布Fig.2 Distribution of QTLs for seed size by multi-environmental joint analysis

將RIL群體籽仁長(zhǎng)、籽仁寬、籽仁長(zhǎng)寬比相關(guān)QTL 進(jìn)行區(qū)間位置比較,在A02、A05、A07、A08、A09和B09連鎖群上2個(gè)或2個(gè)以上QTL在共定位。 其中在A02 連鎖群上9.65～10.48 Mb和95.89～98.65 Mb區(qū)間發(fā)現(xiàn)2個(gè)QTL 區(qū)間存在共定位。 A02連鎖群上9.65～10.48 Mb區(qū)間檢測(cè)到籽仁長(zhǎng)QTLqSLA02.1、籽仁寬QTLqSWA02和籽仁長(zhǎng)寬比相關(guān)QTLqSLWA02.1,該區(qū)間內(nèi)QTL的LOD值范圍為6.817～17.554,表型變異解釋率為9.122%～14.427%;A02連鎖群上95.89～98.65 Mb區(qū)間檢測(cè)到籽仁長(zhǎng)相關(guān)QTLqSLA02.2和籽仁長(zhǎng)寬比相關(guān)QTLqSLWA02.2,該區(qū)間內(nèi)QTL的LOD值范圍為6.993～13.319,表型變異解釋率為10.958%～13.070%。

3 討論與結(jié)論

作物許多重要性狀屬數(shù)量性狀,表型易受環(huán)境影響,研究人員于是越來(lái)越側(cè)重于挖掘遺傳穩(wěn)定、貢獻(xiàn)率高和受環(huán)境影響小的QTL,來(lái)對(duì)某性狀進(jìn)行改良。 花生籽仁大小性狀表現(xiàn)為正態(tài)分布,為數(shù)量性狀,因此挖掘多環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá)的籽仁大小性狀主效QTL,對(duì)產(chǎn)量改良具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

本文利用RIL群體和SLAF-seq技術(shù)構(gòu)建包含2 411個(gè)上圖標(biāo)記、總圖距1 814.72 c M,標(biāo)記間平均距離為0.76 c M 的高密度遺傳圖譜。 多環(huán)境聯(lián)合分析在A02 染色體上Marker10593～Marker97229 區(qū)間存在籽仁長(zhǎng)寬比相關(guān)QTL(qSLWA02.1)、籽仁長(zhǎng)相關(guān)QTL (qSLA02.1)和籽仁寬相關(guān)QTL(qSWA02),在A02染色體上Marker140970～Marker133566 區(qū)間存在籽仁長(zhǎng)寬比相關(guān)QTL(qSLWA02.2)、籽仁長(zhǎng)相關(guān)QTL(qSLA02.2),且對(duì)應(yīng)的LOD值和表型貢獻(xiàn)率都較高,說(shuō)明控制不同性狀的QTL可能受同一QTL或基因調(diào)控,也可能是兩個(gè)獨(dú)立基因的緊密連鎖。

目前,花生籽仁大小性狀相關(guān)QTL 定位已有相關(guān)報(bào)道,在A02、A03、A05、A07、A10、B06均重復(fù)鑒定到相關(guān)QTL。 Chen等在染色體A10上重復(fù)鑒定到1個(gè)籽仁寬相關(guān)QTL[5]。 曾新穎等在染色體A05 上重復(fù)鑒定到2 個(gè)籽仁長(zhǎng)相關(guān)QTL和2個(gè)籽仁長(zhǎng)寬比相關(guān)QTL,在染色體B06上重復(fù)鑒定到2個(gè)籽仁長(zhǎng)相關(guān)QTL 和2個(gè)籽仁寬相關(guān)QTL[9]。 Huang等在3個(gè)環(huán)境下重復(fù)檢測(cè)到籽仁長(zhǎng)相關(guān)QTLqSLA2.2、籽仁寬相關(guān)QTLqSWA3、qSWA7.1 和qSWB6.2。 其中籽仁長(zhǎng)主效QTLqSLA2.2在3個(gè)環(huán)境中能重復(fù)檢測(cè)到,置信區(qū)間為連鎖群A02上62.0～68.5 cM,物理位置為84.50～89.73 Mb,LOD 值為4.8～9.1,加性效應(yīng)為0.77～1.12,表型變異解釋率為14.60%～25.55%[8]。 Zhang等在四個(gè)環(huán)境下重復(fù)檢測(cè)到籽仁長(zhǎng)相關(guān)QTLqSL2和籽仁長(zhǎng)寬比相關(guān)QTLqLW2,位于A02連鎖群,物理位置為92.75～99.81 Mb,表型變異解釋率均大于10%[7]。 與已報(bào)道的QTL 進(jìn)行比對(duì),本研究在A02連鎖群物理位置95.89～98.65 Mb區(qū)段檢測(cè)到控制籽仁長(zhǎng)的QTLqSLA02.2和籽仁長(zhǎng)寬比的QTLqSLWA02.2,這可能與Huang 等和Zhang等[7-8]報(bào)道的qSLA2.2、qSL2和qLW2是同一個(gè)位點(diǎn)。 在A02連鎖群9.65～10.48 Mb區(qū)段檢測(cè)到控制籽仁長(zhǎng)的QTLqSLA02.1、籽仁長(zhǎng)寬比的QTLqSLWA02.1和籽仁寬的QTLqSLWA02,為新的主效QTL。

本研究構(gòu)建了一張高密度遺傳圖譜,共包含2 350個(gè)SLAF標(biāo)簽和61個(gè)SSR 標(biāo)記,覆蓋長(zhǎng)度為1 814.72 c M。 共檢測(cè)到20個(gè)控制籽仁大小的QTL,其中A02 染色體上Marker10593～Marker97229區(qū)間同時(shí)定位到控制籽仁長(zhǎng)、籽仁寬和籽仁長(zhǎng)寬比的相關(guān)QTL、Marker140970～Marker133566區(qū)間同時(shí)定位到控制籽仁長(zhǎng)和籽仁長(zhǎng)寬比的相關(guān)QTL。