劉文穎，馮曉文，李國(guó)明，張江濤，張新雪，谷瑞增

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院 北京 100083 2 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心 北京 100015）

牡蠣（Ostrea）又名生蠔，是世界上第一大養(yǎng)殖貝類，也是我國(guó)重要的養(yǎng)殖貝類。牡蠣肉中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有“海洋牛奶”之稱。通過(guò)蛋白提純、生物酶解、分離純化、噴霧干燥等步驟加工制得牡蠣低聚肽，是牡蠣高值化利用的有效途徑[1-2]。牡蠣低聚肽主要成分為短肽，具有相對(duì)分子質(zhì)量小，適熱能力強(qiáng)，乳化效果好，易被機(jī)體吸收和具有新的生物活性等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。

抗氧化活性肽是生物活性肽的一種，能夠清除自由基，抑制或消除氧化反應(yīng)，降低氧化速率和過(guò)氧化物含量，保護(hù)細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激損傷，從而達(dá)到抗衰老的功能[5]。與化學(xué)抗氧化劑相比，動(dòng)、植物來(lái)源的抗氧化活性肽安全性高，無(wú)毒副作用，作為天然抗氧化劑在食品和醫(yī)藥行業(yè)中具有較大的競(jìng)爭(zhēng)力，是研究人員探索最多的一種生物活性肽。目前文獻(xiàn)報(bào)道了烏雞、雞蛋、牛奶、大豆等多種蛋白來(lái)源活性肽的抗氧化作用，有研究表明抗氧化肽的活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)[5-7]。目前，關(guān)于牡蠣低聚肽結(jié)構(gòu)和抗氧化作用的系統(tǒng)研究鮮見報(bào)道。

本研究以去殼牡蠣肉為原料，經(jīng)生物酶解、分離純化等步驟制得牡蠣低聚肽，在對(duì)其基礎(chǔ)理化成分、氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量分布分析的基礎(chǔ)上，用掃描電鏡、紫外全波長(zhǎng)掃描和圓二色光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，通過(guò)DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、氧自由基吸收能力（ORAC）和還原能力4 種體外化學(xué)評(píng)價(jià)體系探討其抗氧化能力，為牡蠣低聚肽在抗氧化功能性食品的開發(fā)方面提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍去殼牡蠣肉，北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供；堿性蛋白酶（≥400 000 DU/g）、中性蛋白酶（≥1 600 AU/g），杜邦丹尼斯克公司；分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）、Fluorescein（熒光指示劑）、Trolox（水溶性維生素E），美國(guó)Sigma 公司；乙腈（色譜純），美國(guó)Fisher 公司；ABTS 自由基清除能力測(cè)定試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；其它分析純?cè)噭?，北京化工廠。

UV-1780 紫外可見分光光度計(jì)，日本SHIMADZU 公司；Spectra MR 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)dynex 公司；LC-20A 高效液相色譜儀，日本SHIMADZU 公司；SpectraMax i3x 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MD 公司；A300 全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國(guó)曼默博爾公司；QSY-Ⅱ型凱式定氮儀，北京強(qiáng)盛分析儀器制造中心；HH-501 型超級(jí)恒溫水浴鍋，常州國(guó)宇儀器制造有限公司；DHG-9075A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京陸希科技有限公司；LG10-2.4A 型高速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣低聚肽的制備 將冷凍去殼牡蠣肉先用蒸餾水洗凈，然后稱取600 g，絞碎，加入蒸餾水?dāng)嚢璩蓜驖{?？販兀?0±2）℃，調(diào)節(jié)pH 值至8.5，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的堿性蛋白酶，酶解2 h，再用0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)水解液pH 值為6.5，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%的木瓜蛋白酶，酶解2 h。酶解過(guò)程中用0.1 mol/L HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)水解液pH 值，使其保持不變。酶解結(jié)束后，于100 ℃沸水浴滅酶，10 000×g 離心20 min，取上清液，用截留分子質(zhì)量為2×106u 的陶瓷膜過(guò)濾，取中間清液，用截留分子質(zhì)量為1 000 u 的超濾膜超濾，得到分子質(zhì)量小于1 000 u 的濾過(guò)液，然后噴霧干燥，得到牡蠣低聚肽干粉[8]。

1.2.2 基礎(chǔ)理化成分測(cè)定 參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定牡蠣低聚肽的基礎(chǔ)理化成分。參照GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》 方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量；參照GB/T 22729-2008《海洋魚低聚肽粉》 方法測(cè)定酸溶蛋白含量；參照GB 5009.3-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》方法測(cè)定水分含量；參照GB 5009.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》 方法測(cè)定灰分含量[9-12]。

1.2.3 氨基酸組成測(cè)定 按照GB 5009.124-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》方法，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)牡蠣低聚肽的水解氨基酸和游離氨基酸組成進(jìn)行分析[13]。

1.2.4 相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定 利用流動(dòng)相配制樣品溶液的質(zhì)量濃度為1 mg/mL，經(jīng)孔徑0.2 μm聚四氟乙烯膜過(guò)濾后，使用高效液相色譜儀進(jìn)行凝膠過(guò)濾，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。同時(shí)配制0.1%肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過(guò)膜后進(jìn)樣，制作相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線。4 種肽標(biāo)準(zhǔn)品為：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子質(zhì)量189 u）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子質(zhì)量451 u）、桿菌酶（分子質(zhì)量1 450 u）、細(xì)胞色素C（分子質(zhì)量12 500 u）。色譜條件：色譜柱：TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動(dòng)相：V乙腈∶V水∶V三氟乙酸=45∶55∶0.1；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：30 ℃[14]。

1.2.5 牡蠣低聚肽的結(jié)構(gòu)表征

1.2.5.1 掃描電鏡 將牡蠣低聚肽干粉樣品涂抹在樣盤雙面膠上，然后，進(jìn)行氮吹處理。將處理好的樣品放入掃描電鏡，抽真空，施加一定的電壓，調(diào)整束斑尺寸，待聚焦清晰后分別在500 倍和1 000 倍下獲取圖像，觀察區(qū)別[15]。

1.2.5.2 紫外全波長(zhǎng)掃描 稱取牡蠣低聚肽于超純水中，配制成2.0 mg/mL 的溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，掃描波長(zhǎng)245～325 nm[14]。

1.2.5.3 圓二色光譜掃描 將牡蠣低聚肽配制成1.0 mg/mL 的溶液，用圓二色光譜儀測(cè)量樣品的圓二色光譜。以0.2 nm 的步長(zhǎng)和2.0 nm 的帶寬掃描樣品。光譜范圍190～250 nm，掃描速度200 nm/min。從每個(gè)光譜中減去緩沖液的基線光譜，使用Jasco 軟件內(nèi)置的分析函數(shù)將得到的數(shù)值轉(zhuǎn)換為摩爾橢圓率（θ）[15]。

1.2.6 牡蠣低聚肽的體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.6.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 依次加入100 μL 0.1 mmol/L DPPH-無(wú)水乙醇溶液和100 μL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于96 孔板中，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，然后在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)x；將100 μL 不同濃度的樣品溶液與100 μL 無(wú)水乙醇混合，測(cè)得吸光值A(chǔ)0；以蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照，與100 μL 0.1 mmol/L DPPH-無(wú)水乙醇溶液混合，測(cè)得吸光值A(chǔ)1[16]。

1.2.6.2 ABTS 自由基清除能力測(cè)定 將100 μL ABTS 溶液和100 μL 氧化劑溶液混勻，配成ABTS工作母液，避光靜置過(guò)夜，形成ABTS 自由基儲(chǔ)備液。使用前用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋35 倍成為ABTS 工作液。每個(gè)孔中加入200 μL ABTS 工作液。向標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔中加入10 μL 不同質(zhì)量濃度的Trolox（水溶性維生素E）標(biāo)準(zhǔn)溶液，向樣品檢測(cè)孔中加入樣品10 μL，輕輕混勻后室溫孵育6 min，于波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定吸光值。最終樣品的抗氧化能力以mmol Trolox/L 表示[17]。

1.2.6.3 ORAC 值的測(cè)定 將25 μL 樣品溶液和100 μL Fluorescein （熒光指示劑，0.8 μmol/L）于96 孔板中混合，然后加入75 μL 150 mmol/L 偶氮類化合物AAPH 啟動(dòng)反應(yīng)，此為試驗(yàn)組。分別用25 μL Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品（6.25，12.5，25，50，100，250，500 μmol/L）代替樣品作為陽(yáng)性對(duì)照（制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）、25 μL 磷酸緩沖液（pH=7.4，75 mmol/L）代替樣品為空白對(duì)照，37 ℃保溫20 min，熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm，每隔5 min 測(cè)定1 次，測(cè)定總長(zhǎng)時(shí)間為120 min。另外，做不加AAPH 的對(duì)照。測(cè)樣品的ORAC 值表示為μmol Trolox/g[18]。

1.2.6.4 還原能力的測(cè)定 分別加入100 μL 樣品溶液，100 μL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）和100 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀，50 ℃保溫20 min，然后加入100 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸。取100 μL 反應(yīng)液，加入100 μL 蒸餾水和20 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% FeCl3溶液，反應(yīng)10 min 后，于700 nm 下測(cè)定吸光值[19]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 每組數(shù)據(jù)平行測(cè)定3 次，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用Origin 8.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣低聚肽的基礎(chǔ)理化成分

結(jié)果顯示，牡蠣低聚肽中蛋白質(zhì)含量為（67.57±0.53）%，酸溶蛋白質(zhì)含量為（63.22%±0.56）%，占總蛋白質(zhì)93.56%，表明牡蠣低聚肽中小分子蛋白質(zhì)含量較高。游離氨基酸含量為（7.88±0.23）%，經(jīng)計(jì)算，肽含量為（55.34±0.45）%。水分和灰分含量很低，分別為（4.36±0.39）%和（5.78±0.32）%。由此可見，牡蠣肉蛋白質(zhì)含量較高，是制備低聚肽的優(yōu)良蛋白質(zhì)來(lái)源。酶解過(guò)程中蛋白質(zhì)的溶解、不溶性非蛋白質(zhì)物質(zhì)的去除以及水解后油脂等物質(zhì)的去除，使得制備的牡蠣低聚肽中蛋白質(zhì)和肽含量較高。

2.2 牡蠣低聚肽的氨基酸組成

由表1可知，牡蠣低聚肽中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和天冬氨酸含量較高，總含量為38.47%，而色氨酸和半胱氨酸含量很低，僅為1.10%。牡蠣低聚肽中含有豐富的必需氨基酸，含量為22.11%，占氨基酸總和的27.40%，組成合理，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。這與Dong 等[8]研究的牡蠣肽氨基酸組成相似。牡蠣低聚肽中高含量的谷氨酸、天冬氨酸等風(fēng)味氨基酸對(duì)其風(fēng)味起到一定的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，許多氨基酸具有抗氧化能力，能夠較好地清除自由基，如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、脯氨酸等[20-21]。牡蠣低聚肽富含抗氧化性氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、賴氨酸含量較高。此外，牡蠣低聚肽中疏水性氨基酸含量為21.43%，占氨基酸總和的26.56%。低聚肽中高含量的疏水性氨基酸能夠增加脂溶性，從而有助于清除脂質(zhì)自由基，發(fā)揮重要的抗氧化作用[22]。

表1 牡蠣低聚肽的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of oyster oligopeptides

2.3 牡蠣低聚肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布

分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，方程為：lg MW=-0.2123489t+ 6.877187（R2=0.9961867）。牡蠣低聚肽洗脫圖譜見圖2。使用GPC 軟件處理色譜數(shù)據(jù)，如表2所示，牡蠣低聚肽中大分子蛋白較少，主要為小分子肽混合物，且主要分布在1 000 u的小肽占77.71%，而1 000～2 000 u，2 000～3 000 u，3 000～5 000 u，＞5 000 u 的多肽分別為7.35%，1.07%，0.33%，0.09%，說(shuō)明牡蠣低聚肽的主要成分為1 000 u 以下的小肽。研究表明，肽的抗氧化活性與分子質(zhì)量大小有關(guān)，活性較強(qiáng)的抗氧化肽分子質(zhì)量均較小，氨基酸殘基的數(shù)目一般在20 個(gè)以內(nèi)[23]。牡蠣低聚肽是一種具有潛力的抗氧化性物質(zhì)。

表2 牡蠣低聚肽的分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular weight distribution of oyster oligopeptides

圖1 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of molecular weight

圖2 牡蠣低聚肽的分子質(zhì)量分布凝膠色譜圖Fig.2 Gel filter chromatogram of molecular weight distribution of oyster oligopeptides

2.4 牡蠣低聚肽的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 掃描電鏡 由圖3可看出，牡蠣低聚肽具有明顯的球體顆粒狀，在500 倍和1 000 倍放大倍數(shù)下牡蠣低聚肽表面有不規(guī)則褶皺和氣孔。這可能是因?yàn)槊附馄茐牧说鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)，使粒徑減小，表面暴露出更多的疏水性基團(tuán)，進(jìn)而提高酶解產(chǎn)物的抗氧化能力[24]。

圖3 牡蠣低聚肽的掃描電鏡Fig.3 Scanning electron microscope of oyster oligopeptides

2.4.2 紫外全波長(zhǎng)掃描 將質(zhì)量濃度2.0 mg/mL的牡蠣低聚肽進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，掃描波長(zhǎng)245～325 nm，結(jié)果見圖4。牡蠣低聚肽在波長(zhǎng)267 nm 處的近紫外區(qū)有最大吸收峰，吸光度為1.55，表明該波長(zhǎng)范圍產(chǎn)生價(jià)電子躍遷。這是因牡蠣低聚肽中的生色團(tuán)和助色團(tuán)，如C=O、COOH、NH2的偏光性而形成的。

圖4 牡蠣低聚肽的紫外全波長(zhǎng)掃描Fig.4 UV scanning analysis of oyster oligopeptides

2.4.3 圓二色光譜掃描 圓二色光譜圖（圖5）的峰位和峰形顯示，牡蠣低聚肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)以多種構(gòu)象并存，牡蠣低聚肽在198 nm 處的遠(yuǎn)紫外區(qū)有負(fù)吸收，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β-折疊。利用CDNN 軟件分析得到肽段各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，如表3所示。牡蠣低聚肽的α-螺旋為（5.5±0.2）%，平行式β-折疊為（3.1±0.3）%，反平行式β-折疊為（35.7±2.8）%，β-轉(zhuǎn)角為（19.9±1.1）%，無(wú)規(guī)卷曲為（34.7±1.9）%。與蛋白質(zhì)相比，肽的結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，主要具有肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)及二級(jí)結(jié)構(gòu)[25]。牡蠣低聚肽中緊密且沒有空腔的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)即α-螺旋結(jié)構(gòu)含量較少，β-折疊及無(wú)規(guī)卷曲含量較多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面疏水性變大[26]。這可能是由于酶解使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)展開，蛋白質(zhì)分子內(nèi)無(wú)序結(jié)構(gòu)含量相對(duì)較高，β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲增加，使得隱藏在內(nèi)部的疏水性位點(diǎn)更多地顯露出來(lái)，從而發(fā)揮特定的功能作用[27]，這也是牡蠣低聚肽表現(xiàn)出一定抗氧化能力的原因之一。

圖5 牡蠣低聚肽的圓二色光譜掃描Fig.5 Circular dichroism spectrum of oyster oligopeptides

表3 牡蠣低聚肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 3 Secondary structure of oyster oligopeptides

2.5 牡蠣低聚肽的體外抗氧化作用

2.5.1 牡蠣低聚肽的DPPH 自由基清除能力 由圖6可知，在質(zhì)量濃度0～25 mg/mL 范圍，牡蠣低聚肽對(duì)DPPH 自由基清除率與質(zhì)量濃度呈明顯的劑量關(guān)系，在質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率為（76.25±2.53）%，半抑制濃度（IC50值）約為9.7 mg/mL。這表明牡蠣低聚肽具有降低DPPH 自由基濃度，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的能力。陽(yáng)性對(duì)照VC 對(duì)DPPH 自由基的清除先迅速增加，達(dá)到最大值，然后趨于平緩，IC50值約為3.9 μg/mL。牡蠣低聚肽的DPPH 自由基清除能力可能是因牡蠣肉酶解過(guò)程中釋放出可作為質(zhì)子供體的物質(zhì)，與DPPH 自由基反應(yīng)使其轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的反磁性分子，從而呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力[28]。Dong等[8]考察了牡蠣肽的抗氧化能力，結(jié)果表明，牡蠣肽的DPPH 自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，IC50值約為11.5 mg/mL，比本研究中牡蠣低聚肽對(duì)DPPH 自由基的清除活性低。葉昱輝[3]測(cè)定了牡蠣多肽的DPPH 自由基清除活性，IC50值為4.48 mg/mL，稍強(qiáng)于牡蠣低聚肽對(duì)DPPH 自由基的清除能力。

圖6 牡蠣低聚肽（a）和VC（b）對(duì)DPPH 自由基清除率Fig.6 DPPH free radical scavenging effects of oyster oligopeptides （a） and VC （b）

2.5.2 牡蠣低聚肽的ABTS 自由基清除能力 以Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制的ABTS 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示。牡蠣低聚肽和VC 的ABTS 自由基清除能力如圖8所示。在質(zhì)量濃度為1～20 mg/mL 范圍，牡蠣低聚肽對(duì)ABTS 自由基清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL 時(shí)的ABTS 自由基清除能力與0.06 mg/mL 的VC 相當(dāng)。推測(cè)可能由于牡蠣酶解后，空間構(gòu)型、氨基酸組成和分子空間排列等發(fā)生變化，產(chǎn)生離子化的氨基或羧基等供氫體，此外，某些氨基酸如酪氨酸（Tyr）含有酚羥基，能提供質(zhì)子，還原具有氧化性的自由基，從而終止自由基連鎖反應(yīng)，達(dá)到清除或抑制自由基的目的[24]。VC 在較低的質(zhì)量濃度 （0.01～0.10 mg/mL） 下就能展示較強(qiáng)的ABTS 自由基清除能力。與單一成分的VC 相比，牡蠣低聚肽的ABTS自由基清除能力要弱很多，然而作為一種天然的功能活性物質(zhì)，安全性高，長(zhǎng)期食用無(wú)毒副作用。

圖7 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Trolox standard curve

圖8 牡蠣低聚肽（a）和VC（b）對(duì)ABTS 自由基清除率Fig.8 ABTS free radical scavenging effects of oyster oligopeptides （a） and VC （b）

2.5.3 牡蠣低聚肽的ORAC 值 不同質(zhì)量濃度Trolox 的動(dòng)態(tài)熒光衰減曲線見圖9，由此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖10，y=0.0845x-0.0029，R2=0.9990。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算牡蠣低聚肽和VC 的ORAC 值，分 別 為 （181.75±7.26），（976.42±33.42）μmol Trolox/g。VC 的ORAC 值約為牡蠣低聚肽的5 倍。雖然牡蠣低聚肽的ORAC 值明顯低于各質(zhì)量濃度VC 的ORAC 值（P＜0.05），但是與其它抗氧化肽的ORAC 值相近[29]。這表明牡蠣低聚肽通過(guò)氫轉(zhuǎn)移阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程實(shí)現(xiàn)抗氧化作用[30]。有研究表明，高活性的抗氧化肽通常都在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)，分子質(zhì)量小的肽一般具有較強(qiáng)的抗氧化活性[7，31]。吳明澤等[32]通過(guò)超濾將中華圓田螺肉酶解產(chǎn)物分離純化為分子質(zhì)量＜1 ku，1～3 ku，＞3 ku 的3 個(gè)組分。分子質(zhì)量＜1 ku 組分的ORAC 值均顯著高于另外兩個(gè)組分（P＜0.05），具有良好的氧自由基吸收能力。本研究中牡蠣低聚肽的主要成分為分子質(zhì)量＜1 ku 的小肽，這可能與其具有較高的ORAC 值有關(guān)。

圖9 不同質(zhì)量濃度Trolox 的動(dòng)態(tài)熒光衰減曲線Fig.9 Dynamic fluorescence attenuation curve of Trolox at different concentrations

圖10 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.10 Trolox standard curve

2.5.4 牡蠣低聚肽的還原能力 樣品的還原能力與其抗氧化活性呈正相關(guān)，吸光值越大，還原能力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)[7]。由圖11可見，牡蠣低聚肽和VC 的吸光值均隨質(zhì)量濃度的增加而增大。通過(guò)計(jì)算可知，牡蠣低聚肽在質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL 時(shí)的還原能力與0.01 mg/mL 的VC 相當(dāng)。這表明牡蠣低聚肽是良好的電子供體，具有一定的抗氧化能力。有報(bào)道[3]對(duì)牡蠣多肽的還原能力進(jìn)行了研究，其還原能力與其質(zhì)量濃度呈正比，在質(zhì)量濃度5.0 mg/mL 時(shí)，吸光值約為0.3，與本研究中的牡蠣低聚肽還原能力接近。Dong 等[8]研究了牡蠣肽的還原能力，在其質(zhì)量濃度15.0 mg/mL 時(shí)，吸光值約為0.8，稍強(qiáng)于本研究中牡蠣低聚肽的還原能力。

圖11 牡蠣低聚肽（a）和VC（b）的還原能力Fig.11 Reducing power of oyster oligopeptides （a） and VC （b）

3 結(jié)論

牡蠣低聚肽具有較高的蛋白質(zhì)和肽含量，分別為（67.57±0.53）%，（55.34±0.45）%，必需氨基酸和疏水性氨基酸含量豐富，分別為22.11%，21.43%，主要成分為分子質(zhì)量小于1 000 u 的小肽 （占91.16%）。牡蠣低聚肽具有明顯的球體顆粒狀，表面有不規(guī)則褶皺和氣孔，在267 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰。牡蠣低聚肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)以多種構(gòu)象并存，主要為β-折疊（含量為38.8%）。牡蠣低聚肽具有良好的DPPH 自由基和ABTS 自由基清除能力，以及氧自由基吸收能力和還原能力。牡蠣低聚肽對(duì)DPPH 自由基的IC50值約為9.7 mg/mL，ORAC值為（181.75±7.26）μmol Trolox/g，5.0 mg/mL 時(shí)的ABTS 自由基清除能力與0.06 mg/mL 的VC 相當(dāng)，3.0 mg/mL 時(shí)的還原能力與0.01 mg/mL 的VC 相當(dāng)。上述結(jié)果表明牡蠣低聚肽是一種有效的抗氧化活性肽，后續(xù)將通過(guò)離子色譜、反相高效液相色譜等方法對(duì)其進(jìn)行分離純化，篩選高活性的抗氧化肽段，進(jìn)一步明確牡蠣低聚肽的抗氧化功能構(gòu)效關(guān)系。