孫永勝，許 沙，王宇航，魏新燕，李 晨，4，康紅彥，田洪濤，，4*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定 071001 2 國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 河北保定 071001 3 河北新希望天香乳業(yè)有限公司 河北保定 071001 4 河北省益生功能性乳制品技術(shù)創(chuàng)新中心 河北保定 071001）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于目的基因表達(dá)水平的定量分析[1-3]。當(dāng)向qRT-PCR 體系中加入熒光標(biāo)記的特定目的基因時(shí)，可通過對(duì)內(nèi)參基因的監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)狀況實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的[4]。qRT-PCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性易受cDNA 數(shù)量與質(zhì)量、RNA 質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率、引物特異性、qRT-PCR 條件與效率等因素的影響[5]。需引入內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，以提高qRT-PCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性[6-7]。目前常用管家基因16S 核糖體RNA 基因（16S rRNA）、鳥苷酸激酶基因（gmk）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）作為內(nèi)參基因[8-9]。管家基因一般在生物體的各組織及各生長(zhǎng)階段表達(dá)水平比較穩(wěn)定[10]。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)：這些管家基因不能在所有生理?xiàng)l件下都穩(wěn)定表達(dá)，內(nèi)參基因的表達(dá)會(huì)隨表達(dá)條件的改變而改變[11-12]。目前尚未有任何一種內(nèi)參基因在各種試驗(yàn)條件下均能穩(wěn)定表達(dá)的現(xiàn)象[13-14]。在qRTPCR 研究中，根據(jù)不同試驗(yàn)條件，選擇合適的內(nèi)參基因尤為重要。

隨著科學(xué)技術(shù)水平的提高，與發(fā)酵乳制品促進(jìn)人體健康功能性的揭示以及人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，發(fā)酵乳制品工業(yè)迅猛發(fā)展，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有越來越重要的地位，成為“朝陽產(chǎn)業(yè)”。酸奶是最常見的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，為了保持酸奶中乳酸菌的保健功能，酸奶經(jīng)發(fā)酵后含有一定數(shù)量的乳酸菌活菌，在冷藏條件下的貨架期一般為21 d[15-16]。酸奶發(fā)酵劑菌種長(zhǎng)期使用可能發(fā)生變異或長(zhǎng)期使用國(guó)外商業(yè)直投式發(fā)酵劑等不明原因，使冷藏酸奶中的乳酸菌繼續(xù)利用酸奶中殘存的乳糖緩慢發(fā)酵、產(chǎn)酸，這種現(xiàn)象稱為酸奶的后酸化?，F(xiàn)有研究表明：酸奶發(fā)酵劑的重要菌種保加利亞乳桿菌是導(dǎo)致酸奶后酸化的主要菌種[17]。目前大多采用誘變或細(xì)胞融合育種、高溫處理工藝、添加防腐劑等技術(shù)措施來控制酸奶的后酸化[18]，然而，后酸化基因的調(diào)控機(jī)制不清，不能從根本上解決后酸化問題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究保加利亞乳桿菌后酸化形成機(jī)制與功能基因篩選的基礎(chǔ)上，研究保加利亞乳桿菌后酸化功能基因表達(dá)量，對(duì)于定向選育保加利亞乳桿菌弱后酸化菌株勢(shì)在必行。而篩選適宜的內(nèi)參基因是qRT-PCR 研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，有關(guān)乳酸菌在不同條件下內(nèi)參基因的篩選與表達(dá)穩(wěn)定性分析已有報(bào)道[19]，而保加利亞乳桿菌在qRT-PCR 研究中仍選用管家基因作為內(nèi)參基因[20]，對(duì)不同內(nèi)參基因在后酸化中經(jīng)歷的酸冷脅迫的穩(wěn)定性與適用性研究卻尚未見報(bào)道。

本文以保加利亞乳桿菌模式菌株ATCC11842為試驗(yàn)菌株，根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，選擇5 個(gè)候選內(nèi)參基因（16SrRNA、rpoB、ldh、rodA、recA），利用qRT-PCR 技術(shù)，以ATCC11842 菌株正常培養(yǎng)為對(duì)照，研究ATCC11842 菌株的候選內(nèi)參基因在酸脅迫培養(yǎng)和酸冷脅迫培養(yǎng)下的表達(dá)水平。采用三款軟件geNorm、NormFinder 和Bestkeeper[21]，分析候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選獲得最適內(nèi)參基因。通過篩選獲得的最適內(nèi)參基因，分析ATCC11842 菌株的目的基因在酸脅迫和酸冷脅迫下qRT-PCR 的相對(duì)表達(dá)量，驗(yàn)證內(nèi)參基因的可靠性。為利用qRT-PCR 技術(shù)研究保加利亞乳桿菌后酸化功能基因表達(dá)以及揭示后酸化機(jī)制及定向選育弱后酸化菌株提供依據(jù)；也為采用qRT-PCR 技術(shù)研究其它益生乳酸菌引起酸奶后酸化或不同條件下功能基因表達(dá)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.buLgaricus）ATCC 11842：保加利亞乳桿菌模式菌株，本研究試驗(yàn)菌株，購自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心 （China General Microbiological Culture Collection Center CGMCC），-80 ℃超低溫冰箱保存于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院發(fā)酵工程研究室。

1.1.2 主要試劑 MRS 培養(yǎng)基；DEPC、DNaseI，購于北京康為世紀(jì)科技公司；TransZol Up 試劑盒，購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；RevertAidTM第一鏈cDNA synthesis 試劑盒，購于美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；SYBRRSelect Master Mix試劑盒，購于美國(guó)ABI 公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 DL-CJ-1N 型超凈工作臺(tái)，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；5417R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；ABI 7500 Real-Time PCR 擴(kuò)增儀，美國(guó)ABI 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下的qRT-PCR 分析

1） 候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下總RNA 的提取與cDNA 的合成

①候選內(nèi)參基因在不同表達(dá)條件下的樣品制備 保加利亞乳桿菌ATCC11842 經(jīng)初始pH 值6.5 的MRS 液體培養(yǎng)基42 ℃培養(yǎng)活化2～3 次，以1%（體積分?jǐn)?shù)） 接種于起始pH 6.5、200 mL 液體MRS 的三角瓶中，42 ℃培養(yǎng)9 h 至對(duì)數(shù)中期后分裝3 份（50 mL/管），常溫下6 000 r/min、10 min 離心收集菌體，分別在3 種不同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)：一是空白對(duì)照（CK）培養(yǎng)：離心管中第1 份離心收集的菌體加入pH 6.5 的50 mL 液體MRS，42 ℃培養(yǎng)40 min；二是T1 酸脅迫培養(yǎng)[22]：離心管中第2份離心收集的菌體加入pH 4.8 的50 mL 液體MRS，42 ℃培養(yǎng)40 min；三是T2 酸冷脅迫培養(yǎng)：離心管中第3 份離心收集的菌體加入起始pH 4.8的50 mL 液體MRS，4 ℃培養(yǎng)40 min。以上3 個(gè)樣品分別離心收集菌體（其中：CK 和T1 酸脅迫樣品在室溫下6 000 r/min 離心10 min，T2 酸冷脅迫樣品在4 ℃下6 000 r/min 離心10 min），經(jīng)液氮冷凍后入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

②候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下總RNA 的提取與cDNA 的合成 將3 個(gè)-80 ℃凍存的樣品分別在預(yù)冷研缽中用液氮研磨至質(zhì)地細(xì)膩的粉末；按照TransZol Up 試劑盒說明書方法提取各樣品總RNA；利用DNaseI 去除各樣品總RNA中的基因組DNA。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各樣品總RNA 的完整性；借助紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各樣品OD260/OD280與OD260/OD230的比值 （注：OD260/OD280＞1.8（DNA）～2.0（RNA），若比值小，說明核酸中存在蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)的污染；OD260/OD230＞1.8（DNA）～2.0（RNA），若比值小，說明存在碳水化合物與鹽（胍鹽）的污染），判斷各樣品總RNA 的純度和濃度。

采用RevertAidTM 第一鏈cDNA synthesis（Fermentas）將各樣品總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA：在利用DNaseI 去除各樣品總RNA 中的基因組DNA基礎(chǔ)上，按照給出的體系合成各樣品cDNA 第一條鏈。反應(yīng)體系：5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLockTMRNA 酶抑制劑 （20 U/μL） 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAidTM M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）1 μL，總體系為20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：25 ℃5 min，42 ℃60 min，75 ℃5 min 終止反應(yīng)。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10 倍，分裝（20 μL/支）-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2） qRT-PCR 內(nèi)參基因與需要驗(yàn)證的功能基因的選擇及其引物設(shè)計(jì) 根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果中估算的基因表達(dá)量FPKM 值，選擇5 個(gè)功能不同的候選內(nèi)參基因，分別為16SrRNA、rpoB、ldh、rodA 和recA。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果中KEGG 數(shù)據(jù)，選擇3 個(gè)用于做為驗(yàn)證篩選的內(nèi)參基因的目的基因，分別為：與細(xì)胞膜上H+-ATPase相關(guān)的基因（Ldb1301）、參與碳水化合物和丙酮酸代謝途徑的相關(guān)基因（poxI）、參與負(fù)責(zé)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白質(zhì)折疊的相關(guān)基因（dnaJ）。依據(jù)NCBI 已公布的保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）ATCC 11842 的基因組中相應(yīng)的序列，采用DNAMAN 6.0 軟件設(shè)計(jì)5 個(gè)候選內(nèi)參基因與3 對(duì)目的基因的引物，引物序列由華大基因合成，見表1。

表1 候選內(nèi)參基因與目的基因的引物序列Table 1 Primer sequences of candidate internal reference gene and target gene

3） 候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下qRT-PCR 分析

①qRT-PCR 反應(yīng)條件 候選內(nèi)參基因的qRT-PCR 反應(yīng)程序，按照ABI 公司的SYBRRSelect Master Mix 試劑盒說明書的反應(yīng)體系進(jìn)行，在ABI 7500 Real-Time PCR 擴(kuò)增儀上完成。qRT-PCR20 μL 反應(yīng)體系：cDNA template 1 μL、2×SYBRRSelect Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL，加入ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL。qRT-PCR擴(kuò)增程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，激活Taq DNA polymerase 的活性；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品反應(yīng)重復(fù)3 次。

②引物特異性鑒定、擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增效率計(jì)算 引物特異性鑒定：qRT-PCR 產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并作qRT-PCR 擴(kuò)增后熔解曲線圖分析，檢測(cè)溫度為60～95 ℃，每升溫1℃，采集5 次熒光信號(hào)。判斷引物特異性。

擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增效率計(jì)算：以候選內(nèi)參基因的cDNA 第一條鏈為模板，進(jìn)行10 倍濃度梯度稀釋，配置5 個(gè)濃度梯度系列（10-1～10-5），以濃度稀釋梯度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以候選內(nèi)參基因的3 次重復(fù)的平均Ct 值為縱坐標(biāo)，繪制候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線；采用qRT-PCR 自帶軟件計(jì)算候選內(nèi)參基因擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率E（%）=（10-1/斜率-1）×100、斜率、回歸系數(shù)R2。

③候選內(nèi)參基因Ct 值的分析 qRT-PCR 結(jié)束后，儀器自動(dòng)給出各個(gè)樣品的Ct 值；再用Excel對(duì)原始Ct 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算得出平均Ct 值；繪出候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫不同表達(dá)條件下Ct 值分布圖，根據(jù)Ct 值越低，基因表達(dá)量即豐度越高，進(jìn)行分析比較。

1.2.2 采用3 款軟件（geNorm、NormFinder、Bestkeeper）分析比較候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性

1） 3 款軟件分析比較之前的數(shù)據(jù)處理方法qRT-PCR 結(jié)束后，儀器自動(dòng)給出各個(gè)樣品的Ct值；用Excel 對(duì)原始Ct 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算得出每個(gè)候選內(nèi)參基因的平均Ct 值，根據(jù)每個(gè)候選內(nèi)參基因Ct 值的平均值，用Bestkeeper 軟件分析比較候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性。根據(jù)每個(gè)候選內(nèi)參基因Ct 值的平均值，利用2-△△Ct法計(jì)算在酸脅迫和酸冷脅迫不同表達(dá)條件下候選基因的相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)不同候選內(nèi)參基因在不同表達(dá)條件下的相對(duì)表達(dá)量，用geNorm、NormFinder 軟件分析比較候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性。

2） geNorm 分析比較候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性 geNorm 軟件可以根據(jù)候選內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量，換算成候選內(nèi)參基因平均表達(dá)穩(wěn)定值M，繪制geNorm 分析候選內(nèi)參基因平均表達(dá)穩(wěn)定值M 值圖。一般M 值越小，內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性越高；通常M 值＜1.5，候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性非常高，可作為內(nèi)參基因。

與此同時(shí)，geNorm 軟件可以對(duì)候選內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量做標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異分析（Vn/n+1），以確定內(nèi)參基因最佳數(shù)目，繪制geNorm 分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性最適數(shù)目圖，一般Vn/n+1＜0.15，表示以n 個(gè)基因做為內(nèi)參基因已經(jīng)穩(wěn)定，無需選擇更多的內(nèi)參基因；如果Vn/n+1＞0.15，則表示以n 個(gè)基因做為內(nèi)參基因不穩(wěn)定，需要引入n+1 個(gè)基因做為內(nèi)參基因才能穩(wěn)定。

3） NormFinder 分析比較候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性 NormFinder 軟件可以根據(jù)候選內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量，通過求取組內(nèi)和組間方差，計(jì)算平衡表達(dá)穩(wěn)定值SV 及排名，繪制NormFinder 分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的SV 值及排名表。一般SV 值越小，內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性越高，排名越前。

4） Bestkeeper 分析比較候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性 Bestkeeper 軟件可以根據(jù)每個(gè)候選內(nèi)參基因Ct 值的平均值，用Excel 計(jì)算候選內(nèi)參基因之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD 與變異系數(shù)CV%，繪制Bestkeeper 分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的SD 值與CV%值及排名表。一般SD 值與CV%值越小，內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性越高，排名越靠前；如果SD值＞1，則認(rèn)為內(nèi)參基因不穩(wěn)定。

5） 利用幾何平均值法對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行綜合排名 采用Excel 的幾何平均值計(jì)算法對(duì)geNorm、NormFinder、Bestkeeper 軟件分析的候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名進(jìn)行幾何平均數(shù)綜合排名，繪制利用幾何平均值法對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行綜合排名表。一般幾何平均值越小，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越高，排名越前。然后根據(jù)3 種軟件排名穩(wěn)定性的r值，分析3 種軟件之間的相關(guān)性。

1.2.3 篩選獲得的內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性的驗(yàn)證 根據(jù)篩選獲得的內(nèi)參基因在qRT-PCR 中不同條件下的表達(dá)量，計(jì)算目的基因在qRT-PCR 中不同條件下的相對(duì)表達(dá)量，繪制以篩選獲得的內(nèi)參基因的表達(dá)量分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量圖，通過生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析目的基因在不同條件下相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性，分析目的基因相對(duì)表達(dá)量的qRT-PCR 結(jié)果是否與前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相一致，進(jìn)而驗(yàn)證篩選獲得的內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫條件下的qRT-PCR 分析

2.1.1 候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下總RNA 質(zhì)量檢測(cè) 根據(jù)1.2.1 節(jié)（1）①、②試驗(yàn)方法，進(jìn)行保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下總RNA 的提取，總RNA 的檢測(cè)結(jié)果，見圖1、表2。

由圖1可見，提取樣品的總RNA 的23S rRNA、16S rRNA 和5S rRNA條帶清晰，表明ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫不同條件下提取的總RNA 完整性良好。表2顯示，提取樣品的 總RNA 的OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm均 在1.8～2.0 之間，表明ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫不同條件下提取的總RNA 的純度和質(zhì)量較高。可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 11842 菌株在酸與酸冷脅迫下總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The electrophoresis of total RNA agarose gel of 11842 strain under acid and acid cold stress

表2 11842 菌株在酸與酸冷脅迫下總RNA 的定量檢測(cè)結(jié)果Table 2 Quantitative detection results of total RNAof 11842 strain under acid and acid cold stress

2.1.2 候選內(nèi)參基因引物特異性鑒定、擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增效率分析 根據(jù)1.2.1 節(jié)（2）、（3）①、②試驗(yàn)方法，進(jìn)行保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下5 個(gè)候選內(nèi)參基因的引物特異性鑒定、擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增效率分析，結(jié)果見圖2、圖3、圖4、表3。

由圖2看出，以ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，5 個(gè)候選內(nèi)參基因條帶大小在85～200 bp 之間，與預(yù)期的條帶大小一致，而且各條帶均比較清晰、均呈單一條帶，表明5 個(gè)候選內(nèi)參基因qRT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物均比較單一，沒有出現(xiàn)引物二聚體與其它非正常擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 5 個(gè)候選內(nèi)參基因qRT-PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of qRT-PCR products of 5 candidate internal reference genes

由圖3可知，5 個(gè)候選內(nèi)參基因經(jīng)qRT-PCR在65～95 ℃下擴(kuò)增的熔解曲線，均呈單一信號(hào)峰，無其它非特異性雜峰產(chǎn)生，表明5 個(gè)候選內(nèi)參基因的引物設(shè)計(jì)合理，均能實(shí)現(xiàn)候選內(nèi)參基因的特異性擴(kuò)增。

圖3 5 個(gè)候選內(nèi)參基因qRT-PCR 熔解曲線Fig.3 qRT-PCR melting curves of 5 candidate internal reference genes

由圖4可見，5 個(gè)候選內(nèi)參基因的qRT-PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線中，每個(gè)內(nèi)參基因的cDNA 模板濃度分別與Ct 值成反比，各點(diǎn)基本分布在一條直線上。表3顯示，5 個(gè)候選內(nèi)參基因的qRT-PCR 擴(kuò)增效率在91%～97%范圍內(nèi)、相關(guān)斜率的回歸系數(shù)R2均≥0.990。上述結(jié)果表明，5 個(gè)內(nèi)參基因所設(shè)計(jì)引物的qRT-PCR 擴(kuò)增，線性關(guān)系良好，擴(kuò)增效率較高，符合qRT-PCR 擴(kuò)增要求，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表3 5 個(gè)候選內(nèi)參基因qRT-PCR 擴(kuò)增效率E%、斜率與回歸系數(shù)R2Table 3 Five candidate internal reference genes qRT-PCR amplification efficiency E%,slope and regression coefficient R2

圖4 5 個(gè)候選內(nèi)參基因qRT-PCR 擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Five candidate internal reference genes qRT-PCR expansion standard curve

2.1.3 候選內(nèi)參基因Ct 值的分析 基因表達(dá)豐度是指基因轉(zhuǎn)錄成mRNA 的數(shù)量，基因表達(dá)豐度越高，轉(zhuǎn)錄成mRNA 的數(shù)量越多，合成的蛋白質(zhì)也越多。Ct 值越小，表示基因的拷貝數(shù)越高，基因表達(dá)豐度越高。通過不同條件下qRT-PCR 的Ct 值變化，可以評(píng)價(jià)候選內(nèi)參基因表達(dá)豐度變化。根據(jù)1.2.1 節(jié) （3） ③試驗(yàn)方法，進(jìn)行保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株5 個(gè)候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下Ct 值的分析，結(jié)果見圖5。

由圖5可看出，5 個(gè)候選基因的平均Ct 值介于29.38～36.42 之間，其中rpoB 的Ct 值最小，表達(dá)豐度最高；recA 的Ct值最大，表達(dá)豐度最低；其它3 個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct 值變化范圍分別是，16SrRNA （30.01～32.11），ldh （29.23～31.01），rodA（31.29～32.48）。統(tǒng)計(jì)分析表明，同一內(nèi)參基因在不同試驗(yàn)處理?xiàng)l件下（正常培養(yǎng)CK、酸脅迫培養(yǎng)、酸冷脅迫培養(yǎng)）的表達(dá)量存在顯著（或極顯著）差異，其中，處理組（酸脅迫培養(yǎng)、酸冷脅迫培養(yǎng)）與對(duì)照組（正常培養(yǎng)CK）相比，存在顯著（或極顯著）差異，說明酸脅迫和酸冷脅迫能夠產(chǎn)生顯著（或極顯著）影響。從同一內(nèi)參基因Ct 值在不同試驗(yàn)條件下的變化來看，rpoB 和recA 變化最小，但仍需利用3 款軟件對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析。

圖5 5 個(gè)候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下Ct 值分布圖Fig.5 Ct value distribution of five candidate internal reference genes under acid stress and acid cold stress

2.2 采用3 款軟件（geNorm、NormFinder、Bestkeeper） 分析比較候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性

2.2.1 Genorm 分析比較候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性 geNorm 軟件可以根據(jù)內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量，換算成候選內(nèi)參基因平均表達(dá)穩(wěn)定值M 值，一般M 值越小，內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性越高；通常M 值＜1.5，候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性非常高，可作為內(nèi)參基因。與此同時(shí)，geNorm 軟件可以對(duì)候選內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量做標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異分析（Vn/n+1），以確定內(nèi)參基因的最佳數(shù)量，一般Vn/n+1＜0.15，表示以n 個(gè)基因做為內(nèi)參基因已經(jīng)穩(wěn)定，無需選擇更多的內(nèi)參基因；如果Vn/n+1＞0.15，則表示以n 個(gè)基因做為內(nèi)參基因不穩(wěn)定，需要引入n+1 個(gè)基因做為內(nèi)參基因才能穩(wěn)定。根據(jù)1.2.2 節(jié)（1）、（2） 試驗(yàn)方法，進(jìn)行保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株5 個(gè)候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性的geNorm 分析，結(jié)果見圖6。

由圖6a 可知，6 個(gè)候選內(nèi)參基因在不同試驗(yàn)處理?xiàng)l件下（正常培養(yǎng)CK、酸脅迫培養(yǎng)、酸冷脅迫培養(yǎng)） 的M 值均＜1.5，理論上均可以作為內(nèi)參基因；以M 值為標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性排序?yàn)閞ecA（0.005）=rpoB（0.005）＜rodA（0.02）＜ldh（0.03）＜16SrRNA（0.04）。表明recA 和rpoB 的M 值最小，表達(dá)穩(wěn)定性最高，適宜作為保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下基因表達(dá)的內(nèi)參基因。

由圖6b 可見，所有3 個(gè)條件組的標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異值Vn/n+1值均＜0.15，而且V2/3 配對(duì)變異值最小（0.009）。表明沒有必要引入第3 個(gè)內(nèi)參基因，適宜的內(nèi)參基因數(shù)目為2 個(gè)。

圖6 geNorm 軟件分析5 個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值與最適數(shù)目Fig.6 geNorm software analyzes the expression stability value and optimal number of 5 candidate internal reference genes

2.2.2 NormFinder 分析比較候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性 NormFinder 軟件可以根據(jù)候選內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量，通過求取組內(nèi)和組間方差，計(jì)算平衡表達(dá)穩(wěn)定值SV 及排名。一般SV 值越小，內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性越高，排名越前。根據(jù)1.2.2 節(jié)（1）、（3） 試驗(yàn)方法，進(jìn)行保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株5 個(gè)候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性的NormFinder 分析，結(jié)果見表4。

表4顯示，以SV 值為標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的排序?yàn)閞ecA（0.002）=rpoB（0.002）＜ldh（0.024）＜rodA （0.026）＜16SrRNA （0.035）。表明recA 和rpoB 的SV 值最小，表達(dá)穩(wěn)定性最高，適宜做為保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下基因表達(dá)的內(nèi)參基因，與geNorm 軟件分析結(jié)果相符。

表4 NormFinder 軟件分析5 個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性與排名Table 4 NormFinder software analyzes the expression stability and ranking of 5 candidate internal reference genes

2.2.3 Bestkeeper 分析比較候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性 Bestkeeper 軟件可以根據(jù)每個(gè)候選內(nèi)參基因Ct 值的平均值，用Excel 計(jì)算候選內(nèi)參基因之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV%），一般SD值與CV%值越小，內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性越高，排名越前；如果SD 值＞1，則認(rèn)為內(nèi)參基因不穩(wěn)定。根據(jù)1.2.2 節(jié)（1）、（4）試驗(yàn)方法，進(jìn)行保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株5 個(gè)候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性的Bestkeeper 分析，結(jié)果見表5。

由表5看出，5 個(gè)候選內(nèi)參基因在不同試驗(yàn)處理?xiàng)l件下（正常培養(yǎng)CK、酸脅迫培養(yǎng)、酸冷脅迫培養(yǎng)） 的SD 值均＜1，理論上均可以作為內(nèi)參基因；以CV%±SD 值為標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性排序?yàn)閞poB （0.26±0.08）＜recA （0.49±0.18）＜rodA（1.06±0.18）＜ldh（2.02±0.62）＜16SrRNA（2.81±0.86）。表明rpoB 和recA SD 值與CV%值最小，是表達(dá)穩(wěn)定性最高的2 個(gè)內(nèi)參基因，適宜做為保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下基因表達(dá)的內(nèi)參基因，與geNorm 和NormFinder 軟件分析結(jié)果基本吻合。

表5 Bestkeeper 軟件分析5 個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性與排名Table 5 Bestkeeper software analyzes the expression stability and ranking of 5 candidate internal reference genes

2.2.4 利用幾何平均值法對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行綜合排名 采用Excel 的幾何平均值計(jì)算法對(duì)geNorm、NormFinder、Bestkeeper 軟件分析的候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名進(jìn)行幾何平均數(shù)綜合排名。一般幾何平均值Ct 值越小，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越高，排名越前。再根據(jù)3 款軟件排名穩(wěn)定性的r值，分析3 種軟件之間的相關(guān)性。根據(jù)1.2.2 節(jié)（5）試驗(yàn)方法，對(duì)geNorm、NormFinder、Bestkeeper 軟件分析的候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名進(jìn)行幾何平均數(shù)綜合排名，結(jié)果見表6。

由表6看出，根據(jù)幾何平均值Ct 分析，5 個(gè)候選內(nèi)參基因在不同試驗(yàn)處理?xiàng)l件下 （正常培養(yǎng)CK、酸脅迫培養(yǎng)、酸冷脅迫培養(yǎng)）的表達(dá)穩(wěn)定性由高到低綜合排名依次是rpoB（1.00）≥recA（1.26）＞rodA（3.30）＞ldh（3.63）＞16SrRNA（5.00），表明rpoB和recA 幾何平均值最小，表達(dá)穩(wěn)定性最高，適宜做為保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下基因表達(dá)的內(nèi)參基因，與geNorm、NormFinder 和Bestkeeper 軟件分析結(jié)果相符。根據(jù)3 款軟件排名穩(wěn)定性的r 值分析它們之間的相關(guān)性得出geNorm 與Bestkeeper 之間相關(guān)性最高（r=0.93），達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

表6 利用幾何平均值法對(duì)候選內(nèi)參基因綜合排名Table 6 Comprehensive ranking of candidate internal reference genes using geometric mean method

2.3 篩選獲得的內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選獲得的保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫（T1）和酸冷脅迫（T2）下2 個(gè)內(nèi)參基因rpoB 和recA 的表達(dá)穩(wěn)定性，通過分析保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株的3 個(gè)目的基因Ldb1301 （與細(xì)胞膜上H+-ATPase 相關(guān)的基因）、poxI （參與碳水化合物和丙酮酸代謝途徑的基因）和dnaJ（負(fù)責(zé)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白質(zhì)折疊的基因）在酸脅迫（T1）和酸冷脅迫（T2）下的相對(duì)表達(dá)量而實(shí)現(xiàn)。根據(jù)篩選獲得的內(nèi)參基因在qRT-PCR中不同條件下的表達(dá)量，計(jì)算目的基因在qRTPCR 中不同條件下的相對(duì)表達(dá)量，通過生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析目的基因在不同條件下相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性，分析目的基因相對(duì)表達(dá)量的qRT-PCR 結(jié)果是否與前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相一致。根據(jù)1.2.3節(jié)試驗(yàn)方法，驗(yàn)證篩選獲得的保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫（T1）和酸冷脅迫（T2）下2 個(gè)內(nèi)參基因rpoB 和recA 的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果見圖7。

圖7 以rpoB 和recA 為內(nèi)參基因分析在T1（酸脅迫）和T2（酸冷脅迫）下poxI（a）、Ldb1301（b）、dnaJ（c）的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Analysis of relative expression levels of poxI（a），Ldb1301 （b），dnaJ （c） under T1 （acid stress）and T2 （acid cold stress） using rpoB and recA as internal reference genes

由圖7可知，以篩選獲得的rpoB 和recA 作為內(nèi)參基因時(shí)，3 個(gè)目的基因（poxI、Ldb1301、dnaJ）在qRT-PCR 中酸脅迫和酸冷脅迫下的相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異（P＜0.05），即poxI 和dnaJ 在酸脅迫下表達(dá)量均上調(diào)，在酸冷脅迫下表達(dá)量均下調(diào)；而Ldb1301 在酸脅迫和酸冷脅迫下表達(dá)量均上調(diào)。3 個(gè)目的基因在qRT-PCR 中酸脅迫和酸冷脅迫下的相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果與前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析結(jié)果一致。本試驗(yàn)進(jìn)一步證明，recA 和rpoB 適宜做為qRT-PCR 研究保加利亞乳桿菌ATCC11842 在酸脅迫和酸冷脅迫下基因表達(dá)的內(nèi)參基因。

3 討論與結(jié)論

發(fā)酵乳制品工業(yè)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有越來越重要的地位，保加利亞乳桿菌既是酸奶發(fā)酵劑的常用菌種，又是引起酸奶后酸化的主要菌種。隨著分子生物學(xué)技術(shù)研究的深入，在進(jìn)行保加利亞乳桿菌后酸化形成機(jī)制研究與功能基因篩選時(shí)，常利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)；而對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中后酸化相關(guān)功能基因表達(dá)量的分析驗(yàn)證，則多采用qRT-PCR 技術(shù)。選擇表達(dá)水平穩(wěn)定的內(nèi)參基因是提高qRT-PCR 結(jié)果準(zhǔn)確性的重要前提，一般采用管家基因做為qRT-PCR 的內(nèi)參基因[23]，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，這些管家基因并非在所有生理?xiàng)l件下都能穩(wěn)定表達(dá)，表現(xiàn)為它們的轉(zhuǎn)錄水平并非穩(wěn)定[11]，目前對(duì)保加利亞乳桿菌在不同條件下篩選內(nèi)參基因的研究，尚未見報(bào)道。

本文首先根據(jù)前期保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在后酸化不同條件下轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果，選擇5 個(gè)候選內(nèi)參基因，通過qRT-PCR的基因表達(dá)水平即Ct 值分析，結(jié)果表明，同一候選內(nèi)參基因Ct 值在不同試驗(yàn)條件下，rpoB 和recA表達(dá)量變化最小，初步判斷，rpoB 和recA 可做為內(nèi)參基因。此外，在進(jìn)行qRT-PCR 的Ct 值分析試驗(yàn)時(shí)，做為本底信號(hào)3～15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，通常存在檢測(cè)誤差，因此一般取Ct 值在15～35 個(gè)循環(huán)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。其次，采用3 款軟件geNorm、NormFinder 和Bestkeeper，分析比較了5 個(gè)候選內(nèi)參基因在后酸化不同條件下qRT-PCR 的表達(dá)穩(wěn)定性，3 款軟件分析比較結(jié)果一致得出：rpoB 和recA 是表達(dá)最穩(wěn)定的2 個(gè)基因，可作為篩選出的內(nèi)參基因。值得注意的是：由于3 款軟件所用的統(tǒng)計(jì)分析方法不同，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)3 款軟件分析比較內(nèi)參基因排名結(jié)果不完全一致的現(xiàn)象[24]，這就需要利用幾何平均值法對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行綜合排名。本研究為了提高試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，仍采用幾何平均值法對(duì)5 個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行綜合排名，結(jié)果表明：綜合排名結(jié)果與3 款軟件分析比較結(jié)果相符。最后，運(yùn)用篩選出的內(nèi)參基因rpoB 和recA，分析了ATCC11842 菌株3 個(gè)目的基因pox-I、Ldb1301 和dnaJ 在后酸化不同條件下qRTPCR 的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，3 個(gè)目的基因在后酸化不同條件下qRT-PCR 的相對(duì)表達(dá)量的分析結(jié)果與前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了本研究篩選獲得的2 個(gè)內(nèi)參基因rpoB 和recA 的可靠性。

本試驗(yàn)篩選獲得的2 個(gè)內(nèi)參基因之一rpoB基因，是細(xì)菌RNA 聚合酶β 亞基的編碼基因，為單拷貝基因，序列高度保守，在基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用。本研究篩選獲得的2 個(gè)內(nèi)參基因之二的recA 基因，是細(xì)菌中編碼RecA 蛋白的基因，序列高度保守，在DNA 同源重組與DNA 損傷應(yīng)急修復(fù)（SOS）中發(fā)揮重要作用。Lin 等[19]在研究植物乳桿菌R23 經(jīng)SO2脅迫處理前后的基因表達(dá)量時(shí)，通過篩選8 個(gè)候選內(nèi)參基因得到最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)閞poB、rpoC、recA 和ldh。而趙文靜等[25]研究了ldh、recA、rpoB、gapdh 和16S rRNA 5 個(gè)內(nèi)參基因在植物乳桿菌發(fā)酵過程中的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明在不同發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)中表達(dá)最穩(wěn)定的是ldh 基因。Wen 等[26]研究了干酪乳桿菌發(fā)酵過程中關(guān)鍵酶基因表達(dá)變化分析時(shí) 對(duì)recA、gapd、gyrB、16S rRNA 和ldh 5 個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的為gapd 和gyrB 基因。

綜上所述，本研究通過層層篩選與驗(yàn)證，獲得了保加利亞乳桿菌ATCC11842 在后酸化不同條件下qRT-PCR 表達(dá)穩(wěn)定的2 個(gè)內(nèi)參基因rpoB 和recA，為利用qRT-PCR 技術(shù)深入研究保加利亞乳桿菌后酸化功能基因表達(dá)以及進(jìn)一步揭示后酸化機(jī)制及定向選育弱后酸化菌株提供了可靠依據(jù)；也為采用qRT-PCR 技術(shù)研究其它益生乳酸菌引起酸奶后酸化或不同條件下功能基因表達(dá)提供了借鑒指導(dǎo)。