關(guān) 琛，李 萌，李 寧，周航慶，張建紅，李 琳

（1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院 黑龍江大慶 163100 2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱 150030）

大豆蛋白是一種重要的食品成分，具有營養(yǎng)價(jià)值高、功能性強(qiáng)、有益健康等優(yōu)點(diǎn)，在食品中得到廣泛的應(yīng)用。近年來，很多學(xué)者報(bào)道了大豆蛋白[1-2]、乳清蛋白[3]等食品蛋白均可在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)（通常是pH 2.0）的條件下加熱，通過非共價(jià)結(jié)合（如靜電、氫和疏水相互作用）自發(fā)形成有序的聚集體。這種聚集體通常是長度1～10 μm，直徑1～10 nm 的纖維形態(tài)[4]，具有較好的乳化性、高耐熱性和理想的機(jī)械屬性，以及更高的抗氧化活性等[5-7]。纖維狀結(jié)構(gòu)具有明顯的輪廓長度和高縱橫比，使得蛋白納米纖維可以在低體積分?jǐn)?shù)時(shí)形成空間填充網(wǎng)絡(luò)，被認(rèn)為是有效的凝膠劑[8]。由于遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)的凈電荷較高，靜電斥力增加，優(yōu)先形成透明的細(xì)鏈凝膠。這種以可食用蛋白為基礎(chǔ)的納米凝膠具有足夠的內(nèi)部空間來包裹客體材料，具有高載藥量、高多價(jià)生物偶聯(lián)能力和生物相容性等顯著特性，可被用作生物活性分子和藥物的包封體，如咖啡因[9]、核黃素[10]等。

近年來，利用食品蛋白納米纖維制備冷固性凝膠的趨勢日益明顯。冷凝膠通常在室溫下形成，可作為熱敏化合物載體[11]。與熱固性凝膠相比，冷固性凝膠具有更高的凝膠強(qiáng)度和斷裂性能，更好的保水性和透明度[12]。許多交聯(lián)劑都可誘導(dǎo)淀粉樣纖維形成冷凝膠，如單價(jià)或多價(jià)鹽[13]、酶（轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）[14]等。Veerman 等[13]首先用這種方法開發(fā)了Ca2+誘導(dǎo)的β-乳球蛋白纖維冷凝膠化，主要有兩個(gè)步驟：1）在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)和低離子強(qiáng)度的條件下加熱蛋白質(zhì)，目的是變性，并形成納米纖維結(jié)構(gòu)；2）調(diào)節(jié)pH 值至接近等電點(diǎn)后，通過添加單價(jià)或多價(jià)陽離子在低溫下誘導(dǎo)凝膠化。鹽誘導(dǎo)的納米纖維凝膠化是由離子屏蔽效應(yīng)引起的。靜電能壘在鹽的存在下被克服，并通過Derjaguin-Landau-Vervey-Overbeek（DLVO）相互作用（即范德華和雙電層相互作用），使物理作用轉(zhuǎn)化為持久的化學(xué)交聯(lián)[15]。與熱誘導(dǎo)凝膠法或常規(guī)冷定型凝膠法相比，該過程β-乳球蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的濃度低得多。Mohammadian 等[16]使用不同的二價(jià)陽離子（包括CaCl2、MnCl2和ZnCl2） 制得乳清蛋白纖維冷凝膠，其中Zn2+-冷凝膠具有更緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在模擬胃條件下降解的程度也更大，這種水凝膠既可以作為礦物質(zhì)的載體，也可以作為治療胃腺瘤的藥物和生物活性分子的載體。二價(jià)離子可以通過靜電屏蔽、離子/疏水相互作用以及與蛋白分子的帶負(fù)電荷的羧基交聯(lián)來誘導(dǎo)聚集，建立蛋白質(zhì)-陽離子-蛋白質(zhì)橋。單價(jià)陽離子主要通過減少負(fù)電荷分子之間的排斥作用，形成蛋白質(zhì)分子間的非共價(jià)締合[17]。

目前，尚未見鹽誘導(dǎo)SPI 纖維冷凝膠的研究報(bào)道。本研究通過添加CaCl2和NaCl，從自組裝形成的纖維化SPI 溶液中制備冷固性凝膠，探究Ca-Cl2和NaCl 對SPI 纖維冷凝膠流變性質(zhì)、凝膠硬度和持水性的影響，確定不同鹽濃度下的最小凝膠濃度，為SPI 纖維冷凝膠的開發(fā)及利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆低溫脫脂豆粕，山東萬得福集團(tuán)實(shí)業(yè)有限公司；化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850R 型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)有限公司；ALPHA 1-4 LSC 型冷凍干燥機(jī)，德國Christ 公司；KJ2300 型凱氏定氮儀，瑞典Foss 公司；TA-XTplus 質(zhì)構(gòu)儀，英國Micro System 公司；HAAKE MARS 60 流變儀，德國Thermofisher 公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備 采用堿溶酸沉法自制。將低溫脫脂豆粕粉碎，按料液比1:10 的比例加入去離子水，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至8.0，室溫下低速攪拌2 h 后8 000×g 離心30 min。取上清液用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至4.5。4 ℃靜置1 h 至蛋白質(zhì)析出后，8 000×g 離心10 min 后取出蛋白沉淀，溶于去離子水，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH 值至7.0。8 000×g 離心10 min，去除不溶物。蛋白液于4 ℃透析48 h，凍干后得到SPI。凱氏定氮法測得蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.5%（N×6.25）。

1.3.2 SPI 纖維溶液的制備 將SPI 凍干粉溶解于去離子水中（80 g/L），室溫?cái)嚢? h 后，調(diào)節(jié)pH值至2.0，4 ℃水化過夜。蛋白溶液經(jīng)過10 000×g離心30 min 后，凱氏定氮法測定上清液的蛋白含量。用去離子水（預(yù)調(diào)pH 2.0）將蛋白上清液稀釋到10～60 g/L。將蛋白溶液置于帶密封蓋的小瓶中，85 ℃水浴加熱20 h。加熱結(jié)束后，將蛋白質(zhì)樣品冰浴冷卻10 min，并置于4 ℃保存。

1.3.3 SPI 冷凝膠的制備 根據(jù)Veerman 等[13]的方法，SPI 樣品用1 mol/L 和0.1 mol/L NaOH 將pH 值調(diào)節(jié)至7。添加適量的CaCl2、NaCl 溶液至終濃度為10～100 mmol/L 和60～500 mmol/L，并將溶液充分混合，室溫放置24 h 后測定。

1.3.4 流變學(xué)測量 采用控制應(yīng)變模式，選擇平行板 （直徑35 mm，錐角15°，平行板間距1.0 mm），測定了儲能模量（G′）隨應(yīng)變（掃描頻率1 Hz；溫度25 ℃；應(yīng)變0.01%～1%）的函數(shù)。

1.3.5 凝膠硬度的測定 采用TPA 模式，探頭使用P/10，觸發(fā)力為5 g，壓縮變形為樣品高度的50%，間隔時(shí)間為3 s，測前速度為1.0 mm/s，測試速度為1.0 mm/s，測后速度為1.0 mm/s，檢測溫度為室溫。重復(fù)3 次的平均值作為測定結(jié)果。

1.3.6 持水性（WHC）測定 取一定質(zhì)量（M0）蛋白凝膠裝入離心管中離心（8 000×g，30 min）。取出后用濾紙吸取多余水分稱重（M1）。WHC (%) 定義為：

根據(jù)Urbonaite 等[18]的方法，樣品在不同的離心力（100～1 000 g）下，離心10 min，測定持水性的變化。根據(jù)公式：

式中：A——施加0 和1 000 g 力之間可以離開系統(tǒng)的最大水量，%；B——凝膠中剩余的水量（等于100-A），%；gmin——水分滲出所需的最小離心力，g；k——水在受力下離開系統(tǒng)難易程度的系數(shù)。

通過對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行最小二乘最小擬合得到參數(shù)A、k 和gmin。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次取均值，采用Origin 8.0軟件作圖。數(shù)據(jù)處理和分析采用SPSS 19.0 軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽誘導(dǎo)的SPI 纖維冷凝膠相圖

如圖1所示，未加鹽的SPI 溶液只有在質(zhì)量濃度大于60 g/L 時(shí)，在pH 2.0 和80 ℃下加熱20 h 后，才能夠形成凝膠。20～55 g/L SPI 纖維溶液冷卻后，將pH 值調(diào)整為7.0。Mohammadian 等[16]和Gilbert 等[19]的研究表明，pH 值調(diào)節(jié)為7.0 時(shí)納米纖維仍然存在，長度小于與pH 值為2.0 時(shí)的原始狀態(tài)。CaCl2濃度較低時(shí)，鹽離子的靜電屏蔽作用能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的聚集，仍無法交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。CaCl2濃度增加，Ca2+與蛋白質(zhì)形成鹽橋，導(dǎo)致交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。同時(shí)形成SPI 纖維冷凝膠所需的蛋白濃度隨著離子強(qiáng)度從0 增加到30～50 mmol/L，最小質(zhì)量濃度從60 g/L 逐漸降低到20 g/L。在一定的CaCl2濃度下，蛋白濃度的增加會(huì)導(dǎo)致形成不透明凝膠。這些結(jié)果表明，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或形態(tài)與蛋白質(zhì)濃度和靜電相互作用的變化密切相關(guān)。

在SPI 纖維溶液 （調(diào)至pH 7.0） 中加入60，90，150 和300 mmol/L NaCl，離子強(qiáng)度分別等于20，30，50 和100 mmol/L 的CaCl2。同樣觀察到形成冷凝膠所需的蛋白濃度隨著NaCl 濃度的增加而下降。對于10 g/L SPI 纖維溶液，添加CaCl2和NaCl 都沒有形成凝膠。以上結(jié)果表明，CaCl2和NaCl 都能夠誘導(dǎo)SPI 纖維的冷凝膠化，降低形成凝膠所需的蛋白濃度。

2.2 動(dòng)態(tài)黏彈性測量

通過動(dòng)態(tài)振蕩測量，研究了在不同蛋白質(zhì)濃度和離子強(qiáng)度形成的SPI 凝膠的動(dòng)態(tài)黏彈性。在所有的試驗(yàn)中，形成凝膠的儲能模量G′大于黏性模量G′′（數(shù)據(jù)未顯示），表明形成了更具彈性的凝膠。這些凝膠具有線性區(qū)域，即G′與應(yīng)變無關(guān)。隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，SPI 凝膠的線性區(qū)域中的G′增長（圖2）。Ramos 等[20]的研究也表明，當(dāng)將鹽添加到熱變性蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，蛋白質(zhì)濃度對溶液的流變性質(zhì)有很大影響。在低蛋白質(zhì)濃度下，熱變性蛋白質(zhì)將傾向于形成黏性溶液，但超過臨界蛋白質(zhì)濃度就會(huì)獲得冷凝膠。CaCl2濃度從0 增加到50 mmol/L，儲能模量逐漸增加，而當(dāng)離子強(qiáng)度進(jìn)一步增加到100 mmol/L 時(shí)，儲能模量逐漸減小，這可能是由于產(chǎn)生了纖維宏觀聚集，導(dǎo)致凝膠物理性質(zhì)的退化，如圖1的相圖所示。同樣的，NaCl 濃度增加到300 mmol/L 時(shí)，儲能模量達(dá)到最大。30 g/L SPI 纖維溶液加入30 mmol/L CaCl2制得的冷凝膠與60 g/L SPI 纖維凝膠的儲能模量相當(dāng)。結(jié)果表明，CaCl2和NaCl 的添加促進(jìn)了凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。

圖1 添加不同濃度CaCl2（a）、NaCl（b）SPI 纖維冷凝膠的相圖Fig.1 Phase diagram of SPI fibril cold-set gels with different concentrations of CaCl2（a） and NaCl （b）

凝膠理論P(yáng)ercolation 模型G′～（c-cp）t用于擬合凝膠彈性（G′）與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系，其中cp和t 是臨界滲流濃度和標(biāo)度指數(shù)[21]。根據(jù)Erik 等[22]描述的方法，使用（G′）1/t對c 的曲線圖，并將這些曲線圖外推到（G′）1/t=0。對于該擬合過程，即無論t值如何，曲線必須與濃度軸相交于相同的值（即cp）。當(dāng)假設(shè)的t 值接近實(shí)際值時(shí)，曲線圖將是線性的，否則這些線將是曲線。根據(jù)這些曲線圖，確定了cp的平均值。然后繪制lg G′ vs lg （c-cp），使用從估計(jì)t 值獲得的不同cp值，確定平均t 值。不同離子強(qiáng)度下的平均cp值和t 值見表1。

表1 不同離子濃度下形成的SPI 纖維冷凝膠cp 和t 計(jì)算值Table 1 Calculated values for cp and t of the formed SPI fibril cold-set gels at varying ionic strengths

所有樣品的t 值都在1.1～1.9 之間，表現(xiàn)為各向同性滲流和均勻的網(wǎng)絡(luò)[23]。CaCl2濃度增加到30 mmol/L 時(shí)，cp值最低，靜電屏蔽效應(yīng)和Ca2+在SPI 的帶電基團(tuán)或羧基之間形成的鹽橋存在最佳的相互作用。當(dāng)CaCl2濃度高于30 mmol/L 時(shí)，cp隨離子強(qiáng)度的增加而增加，這可能是由于排斥力的增加和鹽橋的形成導(dǎo)致了纖維聚集形成纖維束。不同的CaCl2濃度引起的凝膠機(jī)制的不同，可能是由于微觀水平上網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建過程不同[24]。

二價(jià)陽離子與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而降低了它們的凈電荷密度，單價(jià)離子與蛋白質(zhì)不是特異結(jié)合，而是通過靜電屏蔽作用誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集體的凝膠化。加入NaCl 后樣品的cp值均高于加入同等離子強(qiáng)度的CaCl2的樣品，說明冷凝膠形成的條件下，由多價(jià)陽離子形成鹽橋是形成凝膠網(wǎng)絡(luò)的主要驅(qū)動(dòng)力，而靜電屏蔽并不是主要作用[20]。

2.3 凝膠硬度

根據(jù)流變性分析結(jié)果，選擇CaCl2濃度為20，50，100 mmol/L 和NaCl 濃度分別為60，150，500 mmol/L 的纖維冷凝膠進(jìn)行硬度測定。如圖所示，蛋白濃度越大，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用越強(qiáng)，纖維冷凝膠的硬度越大[25]。Ramos 等[20]的研究也表明，當(dāng)將鹽添加到熱變性蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，蛋白質(zhì)濃度對溶液的流變性質(zhì)有很大影響；在低蛋白質(zhì)濃度下，熱變性蛋白質(zhì)將傾向于形成黏性溶液，但超過臨界蛋白質(zhì)濃度，就會(huì)獲得冷凝膠。CaCl2濃度為50 mmol/L 時(shí)，硬度最大，與流變分析結(jié)果一致。當(dāng)CaCl2濃度小于50 mmol/L 時(shí)，屏蔽效應(yīng)占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致聚集率的增加，凝膠硬度增加。而在較高的CaCl2濃度下，鹽橋的形成會(huì)導(dǎo)致聚集率的降低。Kharlamova 等[26]的研究也報(bào)道了在較高的離子強(qiáng)度下，凝膠硬度隨鹽濃度的增加而降低。這種降低是由于靜電排斥的屏蔽促進(jìn)了網(wǎng)絡(luò)的局部致密化。添加CaCl2的冷凝膠的硬度高于添加NaCl的冷凝膠，說明二價(jià)陽離子比一價(jià)陽離子更有效地誘導(dǎo)凝膠化，因?yàn)樗鼈兡軌蛱禺愋缘嘏c蛋白質(zhì)結(jié)合。

圖3 添加CaCl2（a）、NaCl（b）SPI 纖維冷凝膠的硬度Fig.3 Hardness of SPI cold-set gels with CaCl2 （a）and NaCl （b） addition

2.4 持水性分析

蛋白凝膠的持水能力與其結(jié)構(gòu)、網(wǎng)絡(luò)孔徑、聚合物特性和添加鹽的類型有關(guān)。圖4為不同鹽濃度和蛋白濃度的SPI 纖維冷凝膠離心30 min 以去除水分的持水性結(jié)果。蛋白濃度越高，冷凝膠的持水性越強(qiáng)，這主要是因?yàn)樾纬傻闹旅苣z網(wǎng)絡(luò)具有較強(qiáng)的毛細(xì)作用力。不同離子類型對凝膠樣品的持水能力有顯著影響（P＜0.05）。同等離子強(qiáng)度下，添加CaCl2制備的SPI 纖維冷凝膠在離心力作用下的保水能力比NaCl 強(qiáng)，可能是由于二價(jià)陽離子的鹽橋作用，形成了緊密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能夠截留更多的水。

圖4 添加CaCl2（a）、NaCl（b）SPI 纖維冷凝膠的持水性Fig.4 WHC of SPI cold-set gels with CaCl2 （a）and NaCl （b） addition

將蛋白質(zhì)量濃度為40 g/L 的凝膠在不同的離心力（500～5 000 g）下離心10 min，測定持水性的變化，以反映施加的離心力和去除的水之間的平衡狀態(tài)。曲線用方程（2）擬合，擬合參數(shù)如表2所示，不同類型的鹽及其濃度對持水性有很大的影響。CaCl2和NaCl 濃度分別為50 和150 mmol/L時(shí)，總脫水量（A）最低。此外，較大的最小所需力（gmin）和較小的k 表明，凝膠網(wǎng)絡(luò)變形較慢，水分在外力作用下更不容易從凝膠中去除。鹽濃度過高時(shí)，加快了蛋白質(zhì)的聚集速率，形成了結(jié)構(gòu)粗糙、空隙較大的不透明凝膠，持水性下降。結(jié)合凝膠硬度結(jié)果表明，各向同性滲流和均勻的網(wǎng)絡(luò)以及較硬的凝膠需要更多的能量來使網(wǎng)絡(luò)變形，并且需要施加更高的外力來克服高毛細(xì)力以去除水分。Nieuwland 等[27]的研究表明卵白蛋白凝膠的凝膠硬度與保水性之間具有較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系。Urbonaite 等[28]提出凝膠粗糙度和凝膠硬度的組合對凝膠持水性有協(xié)同作用。Mohammadian 等[16]也報(bào)道了Zn2+誘導(dǎo)的乳清蛋白納米纖維水凝膠比Ca2+和Mn2+誘導(dǎo)的水凝膠更堅(jiān)硬，在離心力下失去了更少的蛋白基質(zhì)結(jié)合水。這與本文結(jié)果一致。

圖5 不同離子對SPI 冷凝膠的持水性的影響Fig.5 Effect of different ions on WHC of SPI cold-set gels

表2 持水性的擬合參數(shù)（%）Table 2 Fitting parameters of WHC （%）

3 結(jié)論

1） CaCl2和NaCl 都能夠在環(huán)境溫度下誘導(dǎo)SPI 纖維溶液形成冷凝膠。所需的cp的最低值比熱凝膠低。流變學(xué)測量結(jié)果表明，隨著離子強(qiáng)度的增加，臨界滲濾濃度cp先降低后增加，標(biāo)度指數(shù)t為1.1～1.9，對應(yīng)于各向同性滲流和均勻的網(wǎng)絡(luò)。

2） 隨著離子強(qiáng)度的增加，CaCl2和NaCl 誘導(dǎo)的纖維冷凝膠的凝膠硬度和持水性均先增加后降低。

3） 同等離子強(qiáng)度下，NaCl 誘導(dǎo)凝膠的cp值均高于加入CaCl2的cp，說明二價(jià)陽離子形成的鹽橋是形成凝膠網(wǎng)絡(luò)的主要驅(qū)動(dòng)力。