溫雅潔， 周生英， 方強(qiáng)恩， 胡桂馨

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心， 甘肅 蘭州 730070)

在長(zhǎng)期的進(jìn)化歷程中，植物和昆蟲形成了一個(gè)既對(duì)立又統(tǒng)一的體系，寄主植物為植食性昆蟲提供食物和棲息場(chǎng)所的同時(shí)，形成了自我保衛(wèi)機(jī)制以抵御或適應(yīng)昆蟲取食為害[1]。植物葉片表面的茸毛密度和長(zhǎng)短會(huì)影響昆蟲的寄生、采食和繁殖，葉片較厚的蠟質(zhì)會(huì)增強(qiáng)葉片對(duì)光波的反射能力，影響昆蟲對(duì)寄主的準(zhǔn)確定位，葉片上氣孔的排列疏密、大小也影響昆蟲采食，表明植物葉片表皮的特殊結(jié)構(gòu)會(huì)增強(qiáng)其抗蟲性[2]。植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理功能具有一致性，研究表明植物葉片解剖結(jié)構(gòu)和光合器官解剖學(xué)特征與葉片光合速率緊密相關(guān)[3-4]。葉綠體和基粒數(shù)量的增加，能更有效地截獲光能，進(jìn)而提高作物凈光合速率和產(chǎn)量[5]。因此，了解植物組織結(jié)構(gòu)與昆蟲取食脅迫的關(guān)系，不僅有助于進(jìn)一步探索植物與昆蟲的相互適應(yīng)關(guān)系，而且對(duì)利用植物抗蟲性防治害蟲、提高作物產(chǎn)量也具有重要的意義。

由于薊馬發(fā)育繁殖速度快、繁殖力強(qiáng)和世代重疊嚴(yán)重等特性，致使苜蓿在第二、三茬的受害率達(dá)到100%，苜蓿干草損失量達(dá)14%以上[6]。以牛角花齒薊馬(Odontothripsloti)為優(yōu)勢(shì)種的薊馬類害蟲的危害已成為我國(guó)西北、華北和東北等苜蓿主產(chǎn)區(qū)的重要威脅和障礙[6-7]。胡桂馨等[8-9]和賀春貴等[10]通過室內(nèi)和大田抗薊馬評(píng)價(jià)，揭示了苜蓿對(duì)薊馬的抗蟲機(jī)制主要表現(xiàn)為耐害性。薊馬為害影響了苜蓿植株的物理性狀，受薊馬為害后苜蓿莖稈變細(xì)，莖稈與葉片顏色加深，尤其是抗薊馬苜蓿葉片顏色變化更大[11]?？芙瓭萚12]的研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿對(duì)薊馬的危害具有明顯的光合補(bǔ)償作用，受害后抗薊馬苜蓿無性系R-1光合補(bǔ)償效應(yīng)顯著大于感薊馬苜蓿無性系I-1。但受薊馬為害后苜蓿組織顯微和超顯微結(jié)構(gòu)的變化尚不清楚。本試驗(yàn)選取抗薊馬苜蓿無性系R-1和感薊馬苜蓿無性系I-1為材料，觀測(cè)苜蓿大田薊馬為害后抗、感薊馬苜蓿無性系的葉片、莖稈組織顯微結(jié)構(gòu)及葉片超微結(jié)構(gòu)的變化，探索苜蓿組織結(jié)構(gòu)與抗薊馬特性間的聯(lián)系，為苜蓿抗薊馬研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試驗(yàn)用苜蓿材料：抗薊馬苜蓿無性系R-1、感薊馬無性系I-1。

供試?yán)ハx：以牛角花齒薊馬(Odontothripsloti)為優(yōu)勢(shì)種的苜蓿大田薊馬復(fù)合種群。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院牧草試驗(yàn)站中進(jìn)行。4月上旬，將室內(nèi)扦插的抗薊馬苜蓿無性系R-1和感苜蓿無性系I-1植株移栽于大田老苜蓿地附近，抗、感苜蓿隔行栽植，行距30 cm，株距20 cm，每種無性系材料各3行，每行30株，試驗(yàn)地面積12 m2。6月下旬，第1茬刈割后，用塑料布將試驗(yàn)地隔為兩半，一半試驗(yàn)地每15 d噴灑一次吡蟲啉控制，另一半試驗(yàn)地任由薊馬為害至苜?，F(xiàn)蕾前期(現(xiàn)蕾率達(dá)到20%)，取樣觀察抗、感薊馬苜蓿葉片和莖稈組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與試驗(yàn)方法

1.3.1抗、感苜蓿健康植株與受害植株葉片上、下表皮的變化 每行隨機(jī)選3株植株，選取健康植株倒5葉和受害植株上受害級(jí)別為2級(jí)[10]的倒5葉，復(fù)葉中間小葉的中部、距主脈兩側(cè)5 mm左右部位，受害葉選取葉中部未受害部分。用刀片切取邊長(zhǎng)2.00～2.50 mm的正方形，立即投入盛有4%戊二醛固定液的小瓶中，于4℃保存。利用掃描電子顯微鏡(Hitachi-S 3400 N)觀測(cè)單位面積表皮細(xì)胞和氣孔數(shù)量，每處理每無性系共隨機(jī)觀測(cè)30個(gè)視野，取均值。

1.3.2抗、感苜蓿健康植株與受害植株莖稈表皮的變化 每行隨機(jī)選3株，取健康植株和受害植株莖稈，于第一朵花蕾下第二節(jié)基部1 cm處，用寬頭鑷子剝下表皮，用1%龍膽紫染色，制成玻片，在生物顯微鏡(Panthera U，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)下觀測(cè)莖稈棱角和平面單位面積表皮細(xì)胞和氣孔數(shù)量，每處理每無性系共隨機(jī)觀測(cè)30個(gè)視野，取均值。

1.3.3抗、感苜蓿健康植株與受害植株莖稈維管束結(jié)構(gòu)的變化 每行隨機(jī)選3株，取健康植株和受害植株莖稈，于第一朵花蕾下第二節(jié)基部1 cm處，徒手切片，挑取較完整的切片，用固綠染色，制成玻片標(biāo)本，在生物顯微鏡下觀測(cè)苜蓿受害株和健康株的莖稈維管束結(jié)構(gòu)變化，每處理每無性系共隨機(jī)觀測(cè)30個(gè)視野。

1.3.4抗、感苜蓿健康植株與受害植株葉片葉肉細(xì)胞和葉綠體的變化 每行隨機(jī)選3株，健康植株倒5葉和受害植株級(jí)別為2級(jí)的倒5葉，選取葉片中部、距主脈5 mm部位的正、反面(受害葉取未受害部分)，取邊長(zhǎng)2.00～2.50 mm的正方形葉片，立即投入盛有4%戊二醛固定液的小瓶中，4℃保存。采用常規(guī)電鏡制樣方法，經(jīng)四氧化鋨雙固定、乙醇系列脫水、環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾雙重染色，在JEM-1230型透射電鏡(日本電子株式會(huì)社廣州事務(wù)所)下觀察和拍照，觀察抗、感植株葉片組織結(jié)構(gòu)(包括柵欄組織和海綿組織、葉綠體結(jié)構(gòu)特征)，每處理每無性系共隨機(jī)觀測(cè)30個(gè)視野。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，制作圖表，并用SPSS 20.0軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗、感苜蓿健康植株與受害植株葉片表皮特征的變化

由表1可知，薊馬為害后，單位面積細(xì)胞數(shù)和氣孔數(shù)顯著增加(P<0.05)。健康抗薊馬苜蓿R-1葉片上、下表皮單位面積細(xì)胞數(shù)和氣孔數(shù)較健康感薊馬苜蓿I-1少，但受害后上表皮單位面積細(xì)胞數(shù)和氣孔數(shù)R-1均高于I-1，而下表皮單位面積細(xì)胞數(shù)和氣孔數(shù)R-1均低于I-1。從增加的倍數(shù)來看，受薊馬為害后，R-1的上表皮和下表皮單位面積細(xì)胞數(shù)的增加倍數(shù)分別為1.75和1.51，單位面積氣孔數(shù)的增加倍數(shù)分別為1.67和1.37，均高于I-1。

表1 健康與受害R-1和I-1苜蓿葉片上、下表皮細(xì)胞與氣孔數(shù)目比較

由圖1可知，健康抗、感苜蓿葉片的上表皮細(xì)胞與下表皮細(xì)胞形態(tài)特征一致，表皮細(xì)胞形狀均不規(guī)則，大小不一，排列緊密，垂周壁式樣為波形，細(xì)胞邊緣呈鋸齒狀(圖1A，1C，1E，1G)。受薊馬為害后，抗、感苜蓿葉片上下表皮細(xì)胞顯著隆起、形狀變?yōu)槎噙呅?，垂周壁式樣變?yōu)槠街毙?，鋸齒狀邊緣消失(圖1B，1D，1F，1H)。

圖1 R-1和I-1苜蓿健康和受害葉片上、下表皮細(xì)胞(500X)

2.2 抗、感苜蓿健康株與受害株葉片顯微結(jié)構(gòu)的變化

由圖2可知，薊馬為害后，抗、感薊馬苜蓿葉片上、下表皮細(xì)胞縱向隆起，橫向收縮。柵欄組織細(xì)胞呈圓柱狀，在受害后收縮，液泡變小，單位面積細(xì)胞數(shù)增加。海綿組織細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列疏松，細(xì)胞間隙大，受害后變化不明顯，且I-1健康葉與受害葉的胞間隙均大于R-1。

圖2 R-1和I-1苜蓿健康和受害葉片表皮細(xì)胞、柵欄組織、海綿組織的變化(2500X)

2.3 抗、感苜蓿健康與受害株莖稈表皮細(xì)胞和氣孔的變化

由圖3可知，抗、感薊馬苜蓿莖稈平面處表皮細(xì)胞形態(tài)為不規(guī)則長(zhǎng)方體形、排列緊密，莖稈棱角處表皮細(xì)胞形態(tài)為規(guī)則的長(zhǎng)方形，排列更為緊密。由圖3和表2可知，受薊馬為害后的R-1和I-1莖稈平面處表皮細(xì)胞體積變小，且R-1較I-1變化顯著，R-1和I-1單位面積細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P<0.05)，增加倍數(shù)分別為1.60和1.10。受薊馬為害后R-1和I-1莖稈棱角處表皮細(xì)胞短軸變窄，長(zhǎng)軸變長(zhǎng)，排列更加緊密。

表2 薊馬為害后抗、感薊馬苜蓿莖平面表皮細(xì)胞和氣孔數(shù)目的變化

圖3 健康與受害R-1和I-1苜蓿莖平面和棱角表皮細(xì)胞(10X)

2.4 抗、感苜蓿健康與受害株莖厚角組織與維管組織的變化

如圖4所示，苜蓿莖的結(jié)構(gòu)由表皮細(xì)胞、皮層和中柱構(gòu)成，中柱中的維管束大小不一，環(huán)狀排列。受薊馬為害后，抗、感薊馬苜蓿莖稈平面處的維管束間距和直徑變小、維管束細(xì)胞減少；莖稈棱角處的維管束直徑變小，維管束細(xì)胞減少，厚角組織的寬度也下降，且I-1比R-1更窄。

圖4 健康與受害R-1和I-1苜蓿莖維管組織和厚角組織比較(10X)

2.5 抗、感苜蓿健康與受害葉肉柵欄組織超微結(jié)構(gòu)的變化

健康苜蓿葉肉柵欄組織細(xì)胞葉綠體呈梭形，葉綠體膜完整，表面附著淀粉粒和少量嗜鋨體。R-1健康葉片淀粉粒數(shù)量少、體積大，受害后體積變小且數(shù)量增加，嗜鋨體增多。健康I-1葉片淀粉粒數(shù)量較R-1多、體積較R-1小，受害后淀粉粒體積變化不明顯、數(shù)量減少，伴有嗜鋨體增多。受害后I-1的嗜鋨體多于R-1，抗、感薊馬苜蓿葉肉葉綠體基粒顯著增加，I-1的葉綠體基粒片層和基質(zhì)片層排列松散且片層間隙大(圖5)。

圖5 健康與受害R-1和I-1苜蓿葉片柵欄組織葉綠體電鏡圖片(12 000X)

3 討論

在植物進(jìn)化過程中，葉片對(duì)環(huán)境變化較為敏感，其解剖結(jié)構(gòu)及微觀特征最能體現(xiàn)環(huán)境因子的影響及植物對(duì)環(huán)境的響應(yīng)[13-14]。表皮是植物抵御外界不良環(huán)境的保護(hù)組織，葉片表皮能減輕脅迫對(duì)葉片內(nèi)部組織的損害[15-16]。黃亞輝等人[17]發(fā)現(xiàn)，茶樹葉片柵欄組織和海綿組織厚度與假眼小綠葉蟬(EmpoascavitisGothe)的蟲口密度極顯著負(fù)相關(guān)。唐楠等[14]對(duì)青藏高原全緣葉綠絨蒿(Meconopsisintegrifolia(Maxim) Franch.)葉表皮特征的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著海拔升高葉片表皮細(xì)胞形態(tài)和垂周壁式樣均發(fā)生變化。陳清西等[18]通過對(duì)不同品種食用蕉(Musaacuminate×M.balbisiana)葉表皮結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，食用蕉葉表皮細(xì)胞所具有的波浪狀垂周壁，是其抗旱抗寒能力較強(qiáng)的表現(xiàn)。紫花苜蓿葉片受薊馬銼吸為害后，表皮細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則形變?yōu)槎噙呅?，垂周壁式樣由波形變?yōu)槠街保f明苜蓿葉片表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)薊馬的為害產(chǎn)生了積極響應(yīng)。

周強(qiáng)等[19]和常金華等[20]研究認(rèn)為，葉片表皮細(xì)胞和氣孔密度小，以及細(xì)胞排列整齊不利于害蟲的取食為害。在本試驗(yàn)中，抗薊馬苜蓿R-1健康葉片上下表皮單位面積細(xì)胞數(shù)目和氣孔數(shù)目明顯少于I-1，而在受害后，R-1葉片上、下表皮單位面積細(xì)胞數(shù)目和氣孔數(shù)目增加倍數(shù)均高于I-1，且垂周壁式樣由波形向平直變化，細(xì)胞排列趨向整齊，說明苜蓿表皮結(jié)構(gòu)的這種變化是其對(duì)薊馬為害的抗性反應(yīng)，且抗薊馬苜蓿無性系的變化更明顯。

許多學(xué)者對(duì)植物顯微和超顯微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，受到不利因素脅迫時(shí)，植物葉片顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)會(huì)受到不同程度的影響，從而影響植物的光合作用。Ivanova等[21]通過對(duì)10種不同功能類型野生植物的研究表明，所有植物類型遮蔭處理后葉肉結(jié)構(gòu)發(fā)生重排。陳斌等[22]對(duì)新娘草(Gibasispellucida)進(jìn)行不同程度的遮光處理發(fā)現(xiàn)，隨著光強(qiáng)的降低葉片柵欄組織和海綿組織的厚度顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，在受薊馬為害后，紫花苜蓿葉片柵欄組織細(xì)胞液泡縮小，細(xì)胞收縮呈橢圓形，相應(yīng)地單位面積細(xì)胞數(shù)增加,而橢圓形的柵欄細(xì)胞可提高近軸面和側(cè)面葉綠體數(shù)量，進(jìn)而最大限度地進(jìn)行光合作用[23]。馬琳[24]的研究報(bào)道，受薊馬為害的苜蓿葉片顏色加深，葉綠素含量增加。寇江濤[25]研究表明，適當(dāng)?shù)乃E馬為害可以提高苜蓿的凈光合速率，使苜蓿產(chǎn)生光合補(bǔ)償效應(yīng)。說明，紫花苜蓿柵欄組織在結(jié)構(gòu)上對(duì)薊馬為害產(chǎn)生積極響應(yīng)，提高了苜蓿葉片對(duì)光能的吸收效率，進(jìn)而產(chǎn)生光合補(bǔ)償效應(yīng)。

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，不良的生長(zhǎng)環(huán)境會(huì)影響細(xì)胞中葉綠體的分布以及形態(tài)結(jié)構(gòu)，造成基粒和片層結(jié)構(gòu)數(shù)量變化、嗜鋨體顆粒增加等現(xiàn)象[25-28]。鹽脅迫時(shí)，葉綠體的響應(yīng)最敏感，葉綠體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，被膜破損甚至消失、類囊體膨大、基粒排列無序，基粒和基質(zhì)片層模糊不清[29]。張潔等[30]和張桂茹等[3]研究證實(shí)了植物體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理功能是相統(tǒng)一的，單位面積細(xì)胞葉綠體數(shù)、基粒數(shù)和片層數(shù)越多，捕獲光能的作用越強(qiáng)，光合作用越強(qiáng)。本試驗(yàn)中，受害后抗、感薊馬苜蓿葉綠體基粒均增加，R-1葉綠體基粒數(shù)和片層增加多于I-1，I-1的葉綠體基粒片層和基質(zhì)片層排列松散且片層間隙大；受害后苜蓿葉肉葉綠體中的淀粉粒體積或數(shù)量減少。說明薊馬為害后，苜蓿葉片通過葉綠體基粒片層增加，提高光合效率，并將更多的淀粉轉(zhuǎn)化成可溶性糖，用于植株自身的補(bǔ)償生長(zhǎng)，彌補(bǔ)薊馬取食為害造成的損失。

嗜鋨體顆粒是類囊體降解膜脂聚集的結(jié)果，可作為植物受損程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)[31]。研究表明，高溫和高光強(qiáng)條件下，植物葉片葉肉細(xì)胞受到損害，葉綠體上出現(xiàn)大量的嗜鋨體顆粒[32-33]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，取食為害后抗、感薊馬苜蓿葉肉細(xì)胞嗜鋨體增多。本試驗(yàn)所用的葉片為受害2級(jí)苜蓿葉片，嗜鋨體多少與苜蓿葉片受害程度大小之間的關(guān)系需要進(jìn)一步探索。

莖是植物地上的重要部分，除了具有光合和支持作用外，最主要的功能是運(yùn)輸和貯存營(yíng)養(yǎng)，保證植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育需求[34]。馬琳等[11]研究報(bào)道，薊馬為害后苜蓿株高降低、分枝增多、節(jié)間變短、莖稈變細(xì)；受害苜蓿的同化產(chǎn)物更多地分配到莖稈中，用于新的側(cè)枝和新葉生長(zhǎng)[8]，使植株產(chǎn)生超補(bǔ)償生長(zhǎng)，而主莖變細(xì)、節(jié)間變短可能是因?yàn)閭?cè)枝增多所致。在本試驗(yàn)中，苜蓿受害后莖稈表皮細(xì)胞體積變小、橫切面維管束間距和直徑降低，從莖稈組織顯微結(jié)構(gòu)的角度解釋了受害苜蓿節(jié)間變短和莖稈變細(xì)的現(xiàn)象。植株莖稈厚角組織具有加強(qiáng)植株莖稈支持作用的功能[35]，受害后抗、感薊馬苜蓿莖稈棱角處厚角組織寬度均有下降，厚角組織寬度的下降使苜蓿植株莖稈的支持作用變?nèi)?，而抗薊馬苜蓿厚角組織寬度下降程度較感薊馬苜蓿低，說明抗薊馬苜蓿莖稈的支持能力強(qiáng)于感薊馬苜蓿。

4 結(jié)論

苜蓿受薊馬為害后，葉片表皮細(xì)胞垂周壁式樣由波形結(jié)構(gòu)向平直變化，細(xì)胞排列趨向更加緊密和規(guī)則，單位面積細(xì)胞和氣孔數(shù)目增加；受害苜蓿葉片的柵欄組織排列也更為緊密，淀粉粒減少，柵欄組織細(xì)胞葉綠體基粒與片層增加，提高了苜蓿葉片有效光合面積和對(duì)光能的吸收效率，使得苜蓿在薊馬危害后產(chǎn)生光合補(bǔ)償，增強(qiáng)了苜蓿對(duì)薊馬的耐害性。R-1葉片和莖稈顯微及葉片的超微結(jié)構(gòu)對(duì)薊馬為害比I-1更為敏感。