王彤，葉子茂，劉夢雨，申晚霞,2，趙曉春,2*

（1.西南大學(xué)柑桔研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；2.國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712）

多甲氧基黃酮（polymethoxylated flavone,PMF）是通過O-甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用將S-腺苷-L-甲硫氨酸提供的甲基整合到類黃酮羥基上而產(chǎn)生的一類分子后修飾化合物[1]。因其具有較強(qiáng)的抗氧化、抗癌、抗肥胖、抗炎、抗動脈硬化等生物活性[2-5]而引起了特別的關(guān)注。PMFs廣泛存在于蕓香科柑橘屬植物中，迄今為止，已經(jīng)從蕓香科柑橘屬植物中分離出40余種PMFs，其取代基的數(shù)量、位置各不相同。PMFs 在柑橘中的組成及特征成分與品種、產(chǎn)地等有關(guān)，可以作為柑橘產(chǎn)品質(zhì)量控制、產(chǎn)品溯源和柑橘品種分類的依據(jù)[6-8]。

柑橘種類繁多，種、屬間有較高的雜交親和性，因此產(chǎn)生了具有復(fù)雜種、屬間關(guān)系的豐富多樣的種質(zhì)資源，其種間、種內(nèi)代謝物組分差異為次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控研究帶來了極大的優(yōu)勢。多甲氧基黃酮主要存在于寬皮柑橘（Citrus reticulataBlanco）中，是寬皮柑橘黃酮類化合物的主要組分[8]。本研究選取不同遺傳背景的39份寬皮柑橘種質(zhì)作為研究對象，對其果皮、果肉、葉片中PMFs的含量進(jìn)行檢測，分析其變化規(guī)律，為進(jìn)一步研究PMFs生物合成的遺傳調(diào)控及柑橘營養(yǎng)成分的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

39份寬皮柑橘種質(zhì)材料（表1）的成熟果實和葉片于2020 年11 月至2021 年1 月采集于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國家果樹種質(zhì)重慶柑橘圃（National Citrus Germplasm Repository, Chongqing,China, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,CRIC）。

表1 本研究中所用的寬皮柑橘種質(zhì)材料Table 1 Mandarin germplasm materials used in this study

1.2 樣品采集與處理

果實的采集：從柑橘樹的東、南、西、北4個方位各采集1個果實，清洗干凈后將每個果實平均分為4份，從中各隨機(jī)選取一份進(jìn)行混合，將果皮、果肉、種子分離，分別取適量上述3 種組織成分于錫箔紙中密封標(biāo)記，并立即用液氮冷凍，再用飛利浦粉碎機(jī)將其研磨成粉末后保存于－40 ℃冰箱中，用于高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）分析。

葉片的采集：采集與果實同一植株上的成熟葉片（完全展開），按東、南、西、北4個方位采摘適量樣品，對其表面進(jìn)行清潔后，置于液氮中急速冷凍，再用飛利浦粉碎機(jī)將其研磨成粉末后保存于－40 ℃冰箱中，用于HPLC分析。

1.3 儀器設(shè)備及試劑

有機(jī)針式過濾器，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；410 OHT超聲波清洗器，廣東省深圳市觀益佳科技有限公司；安捷倫1260infinity液相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司；XBridgeTMC18色譜柱，沃特世科技（上海）有限公司；色譜級甲醇、色譜級乙酸，成都市科隆化學(xué)品有限公司；Eppendorf 5424離心機(jī)，艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司；Synergy R型超純水儀，美國Millipore公司。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品

甜橙黃酮（純度為＞98.0%），成都克洛瑪生物科技有限公司；去甲基川陳皮素、梔子黃素B、川陳皮素、橘皮素（純度為＞95.0%），美國ChromaDex公司。

1.5 黃酮類化合物含量測定

黃酮類化合物提取、檢測參照冉玥等[9]的方法并做適當(dāng)修改。

色譜條件：XBridgeTMC18 色譜柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相為甲醇和0.2%乙酸溶液，采用梯度洗脫（表2）；進(jìn)樣量5 μL，柱溫24 ℃；流速0.8 mL/min；檢測波長330 nm；采用甜橙黃酮、川陳皮素、去甲基川陳皮素、橘皮素、梔子黃素B標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行洗脫。

表2 流動相梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program of the mobile phase

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，使用TBtools_1_09856 繪制熱圖；用Origin 9.0 繪制高效液相色譜圖；用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0 進(jìn)行相關(guān)性和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 圖

5種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖見圖1，且測得其線性范圍為5～500 mg/L，線性關(guān)系系數(shù)均在0.999 以上，表明測定結(jié)果的穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation,RSD）（＜3%）均表現(xiàn)良好。

圖1 5 種多甲氧基黃酮標(biāo)準(zhǔn)品在330 nm 波長處的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of five PMF standards at 330 nm wavelength

2.2 PMFs 在寬皮柑橘果皮中的積累模式

如圖2所示，果皮中總PMFs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化范圍為15.81～3 660.94 mg/kg（以鮮質(zhì)量計，下同）。PMFs 以川陳皮素為主，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為435.74 mg/kg，占5種PMFs總含量的39.2%，其中在曼谷橘中的最高，達(dá)1 122.9 mg/kg，而在大津4 號、象引15號、青島溫州等14 份種質(zhì)中未檢測到川陳皮素；其次為橘皮素，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為404.50 mg/kg，占5 種PMFs 總含量的36.4%，在聶都野橘2 號中的最高，為2 795.12 mg/kg，在盛田溫州中的最低，僅為15.81 mg/kg。果皮中去甲基川陳皮素、甜橙黃酮和梔子黃素B 的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為166.47、81.31 和23.84 mg/kg，分別占總量的15.0%、7.3%和2.1%。

圖2 寬皮柑橘果皮中多甲氧基黃酮含量的聚類分析熱圖Fig.2 Heat map of cluster analysis of polymethoxylated flavone contents in the peel of mandarins

2.3 PMFs 在寬皮柑橘果肉中的積累模式

由圖3可知，果肉中總PMFs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化范圍為5.71～27.67 mg/kg，其PMFs 總含量顯著低于果皮，且PMFs 的組成及各組分的含量與果皮中也明顯不同。果肉中橘皮素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為7.87 mg/kg，占PMFs總含量的48.2%，其中以蜂洞橘最高，達(dá)19.95 mg/kg，佐賀橘最低，僅為4.25 mg/kg。梔子黃素B 的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.75 mg/kg，在城固冰糖橘中的含量最高，在本地早橘和久賀早生中的含量最低。甜橙黃酮檢出率較低，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅1.00 mg/kg。而川陳皮素和去甲基川陳皮素在果肉中幾乎未被檢測出。

圖3 寬皮柑橘果肉中多甲氧基黃酮含量的聚類分析熱圖Fig.3 Heat map of cluster analysis of polymethoxylated flavone contents in the pulp of mandarins

2.4 PMFs 在寬皮柑橘葉片中的積累模式

由圖4 可知，葉片中總PMFs 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化范圍為97.14～8 476.15 mg/kg，其PMFs 的總含量在3 個組織中最高，39 份種質(zhì)葉片的平均PMFs 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 228.04 mg/kg，其中曼谷橘中的最高，為8 476.15 mg/kg，顯著高于其他種質(zhì)。橘皮素是葉片中主要的PMFs，其平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為890.73 mg/kg，占5種PMFs的40.0%，曼谷橘中的最高，為5 260.82 mg/kg，是久賀早生（橘皮素含量最低）的237倍。川陳皮素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為620.19 mg/kg，占總PMFs的27.8%，在粗皮狗屎柑中高達(dá)1 767.46 mg/kg。去甲基川陳皮素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為534.00 mg/kg，占PMFs總量的24.0%，在各品種中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為44.16 mg/kg（久賀早生）～1 557.56 mg/kg（曼谷橘）。甜橙黃酮和梔子黃素B 的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為120.52和62.60 mg/kg ，分別占總PMFs含量的5.4%和2.8%。

圖4 寬皮柑橘葉片中多甲氧基黃酮含量的聚類分析熱圖Fig.4 Heat map of cluster analysis of polymethoxylated flavone contents in the leaf of mandarins

2.5 果皮、果肉、葉片中PMFs含量的相關(guān)性分析

由圖5可知：PMFs的組分及其含量在不同種質(zhì)間有顯著差異，表現(xiàn)出明顯的種質(zhì)特異性；不同組織中PMFs的含量也存在很大差異，葉片中總PMFs平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為2 228.04 mg/kg，是果皮的2倍、果肉的136 倍。為進(jìn)一步探究寬皮柑橘種質(zhì)間果皮、果肉、葉片中PMFs 含量變化的關(guān)系，對39 個寬皮柑橘中5 種PMFs 含量在這3 個組織之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果（表3）表明，果皮、果肉、葉片之間的PMFs含量均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系。說明PMFs的積累規(guī)律在不同組織中基本相同。

表3 果皮、果肉、葉片中多甲氧基黃酮含量的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of the contents of polymethoxylated flavones in peel,pulp and leaf

圖5 果皮、果肉、葉片中多甲氧基黃酮含量的聚類分析熱圖Fig.5 Heat map of cluster analysis of polymethoxylated flavone contents in peel,pulp and leaf

3 討論

PMFs 是一種修飾類型比較特殊的黃酮類化合物，因其具有顯著的抗癌、抗炎等活性而備受關(guān)注。PMFs 廣泛地分布在不同種類的柑橘中，其組成和含量有明顯的種質(zhì)特異性，且受基因型的影響大于環(huán)境因素[10]。這一特性可以用于鑒定柑橘品種[8]和甜橙汁純度[6]等。

果皮、果肉、葉片等組織中都含有PMFs。本研究中，不同組織中的PMFs含量有著明顯的差異，總PMFs平均含量在葉片中最高，果皮次之，果肉中最低，與張靜[11]、CELANO 等[12]、PETERSON 等[13]的研究結(jié)果一致。然而，前人的研究多側(cè)重于分析果皮、果肉或果汁中的PMFs，而忽略了葉片。葉片作為一種常見的試驗材料，在營養(yǎng)診斷、抗性評價、基因功能研究等方面有著重要的作用。從本研究的結(jié)果來看，葉片中不僅含有PMFs的各類組分，而且其含量和果皮、果肉中的PMFs 含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明葉片中PMFs 的生物合成及其遺傳調(diào)控與果皮和果肉中的基本一致。葉片因其可以周年提供、容易獲得轉(zhuǎn)基因材料等，成為開展PMFs代謝的遺傳調(diào)控研究的最佳材料，且葉片中含有比其他部位更多的PMFs，也可以作為提取PMFs的原材料。

寬皮柑橘果皮中PMFs 含量的排序為川陳皮素＞橘皮素＞去甲基川陳皮素＞甜橙黃酮＞梔子黃素B；果肉中PMFs含量的排序為橘皮素＞梔子黃素B＞甜橙黃酮＞去甲基川陳皮素，未檢測到川陳皮素；葉片中橘皮素＞川陳皮素＞去甲基川陳皮素＞甜橙黃酮＞梔子黃素B，與吳桂蘋[8]、KE等[14]報道的結(jié)果相符。橘皮素在多數(shù)寬皮柑橘種質(zhì)及不同組織中的含量均比較高，聚類分析熱圖結(jié)果表明，橘皮素在果皮和葉片中都被單獨分為一類，說明橘皮素是寬皮柑橘PMFs的重要特征成分。

4 結(jié)論

寬皮柑橘中PMFs的積累規(guī)律呈現(xiàn)明顯的種質(zhì)特異性。通過對39 份寬皮柑橘種質(zhì)果皮、果肉、葉片中PMFs含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)PMFs含量在不同品種中表現(xiàn)出顯著的差異性，其中橘皮素、川陳皮素是寬皮柑橘中主要的PMFs。果皮、果肉、葉片等組織部位中PMFs 的積累規(guī)律基本相同。PMFs 含量在這3個組織間呈極顯著正相關(guān)。本結(jié)果可為進(jìn)一步研究PMFs生物合成的遺傳調(diào)控及柑橘營養(yǎng)成分的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。