黃衛(wèi)紅，李雙彤，翁莉莉，柯玉森，曾武峰，張秋芳*

(1.泉州師范學院 海洋與食品學院，福建 泉州 362000；2.福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點實驗室， 福建 泉州 362000；3.泉州市洛江區(qū)河長辦，福建 泉州 362011)

洛陽江起源于泉州市洛江區(qū)羅溪鎮(zhèn)樸鼎山，依次流經(jīng)羅溪鎮(zhèn)、馬甲鎮(zhèn)、河市鎮(zhèn)、雙陽街道、萬安街道，在下游匯入泉州灣，為福建省東南地區(qū)提供了重要水資源[1].微生物是水體生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，其中真核浮游生物對維持水體生態(tài)平衡具有重要的自凈調(diào)節(jié)作用，可作為河流水域質(zhì)量的重要評價指標[2-3].真核浮游生物群落相互關系及其與區(qū)域關系共同支配生態(tài)系統(tǒng)中能量流動和物質(zhì)循環(huán)[4-5].真核浮游生物物種多樣性結(jié)構(gòu)對水體生態(tài)系統(tǒng)功能極為重要，能夠直接反映出水體中氧含量、無機鹽濃度和溫度等因素[6-9].陳曉江等[10]發(fā)現(xiàn)，季節(jié)變化和環(huán)境因素改變均會對真核浮游生物群落產(chǎn)生影響，真核浮游生物達到最佳生長狀態(tài)會使水體富營養(yǎng)化.近年，人類活動對河流生態(tài)環(huán)境和生物多樣性結(jié)構(gòu)造成一定破壞，使得水體生態(tài)系統(tǒng)中真核浮游生物多樣性減少，水體營養(yǎng)嚴重過剩[11-12].故對洛陽江真核浮游生物多樣性及其與環(huán)境相關關系的研究具有重要意義.

為了探明洛陽江水域生態(tài)系統(tǒng)真核浮游生物組成、相對含量及其與環(huán)境因子之間的相關關系，本研究以18S rRNA基因為分子標記，采用Illumina miseq高通量測序技術(shù)對洛陽江流域6個代表性斷面水體真核浮游生物多樣性進行分析，同時對主要水質(zhì)指標進行關聯(lián)性分析，擬獲得洛陽江流域主要水域真核浮游生物群落組成特征及其與環(huán)境因子的互作關系，為了解洛陽江水體微生物生態(tài)及其水質(zhì)安全等提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集洛陽江流域從源頭到泉州灣入?？诜秶?個具代表性斷面水體樣品，采樣點均用GPS定位系統(tǒng)定位，水樣采集點詳見表1.每個采樣點用1.0 L有機玻璃采水器采集表層(水下30 cm)水樣3.5 L，其中:取1.0 L水樣用于總DNA提取，2.5 L用于水質(zhì)指標分析.

表1 洛陽江流域水樣采集點位置信息Tab.1 Water sampling sites information of Luoyang River

1.2 樣品采集水質(zhì)理化參數(shù)分析

分別對水樣中酸堿度(pH)、氨氮(NH3-N)、總氮(TN)、化學需氧量(CODMn)、總磷(TP)、葉綠素a(Chla)等主要水質(zhì)指標進行檢測.pH采用pH計法測定；NH3-N測定采用萘鈉氏試劑分光光度法[13]；TN采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定[14]；CODMn采用高錳酸鉀法測定[15]；TP采用鉬酸銨分光光度法測定[16]；Chla含量采用分光光度法測定.

1.3 樣品采集 樣品總DNA提取

用0.22 μm水系微孔濾膜(Merck Millipore公司，美國)對水樣進行抽濾，將收集有微生物的濾膜充分剪碎，F(xiàn)astDNA Spin Kit For Soil試劑盒(MP Biomedicals公司，美國)和核酸提取儀(MP Biomedicals公司，美國)用于提取總DNA，均質(zhì)條件為18 s和4.5 m/s，提取步驟參照說明書進行.將獲得的總DNA用70 μL DES溶液收集，經(jīng)核酸測定儀測定DNA濃度和純度后儲存于-80 ℃下備用.

1.4 樣品采集PCR擴增及測序

帶Barcode序列[17]的引物對817f/1196r[18]用于18S rRNA基因樣品總DNA的PCR擴增，引物序列為817f：5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′和1196r：5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′.擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 45 s(35個循環(huán))；72 ℃10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后，取足夠量送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，在Illumina Miseq平臺上測序.

1.5 樣品采集數(shù)據(jù)分析

去除原始序列中引物序列與Barcode序列，得到的PE-reads，利用Flash軟件[19]拼接，并用QⅡME v.1.7.0軟件進行分析[20].運用Uclust軟件[19]以97%的閾值進行OTU(Operational Taxonomic Unit)劃分后，實現(xiàn)對序列的聚類.RDP(Ribosomal Database Project)Classifier軟件[21]和SILVA數(shù)據(jù)庫[22]用于注釋每個OTU序列的分類信息.利用Mothur v1.30.1軟件對相似性高于97%的OTUs進行包括覆蓋率(Coverage)、豐富度(Chao)和多樣性(Shannon)在內(nèi)的α-多樣性指數(shù)分析，物種韋恩(Venn)圖、群落組成、β-多樣性和環(huán)境因子相關性等分析[23]均由R語言軟件完成.FUNGuild v1.0 軟件用于真核微生物的功能預測[24].獲得的18S rRNA基因的DNA序列已收錄于NCBI的Sequences Read Archive(SRA)，登錄號為SRP127554.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品采集水質(zhì)分析

洛陽江流域各斷面水體水質(zhì)指標如表2所示.后坂水庫(HB)和惠女水庫(HN)水質(zhì)呈堿性，福濱街橋(FB)為弱酸性水質(zhì)，前后埭交界處(QHD)和和洛陽橋(LY)水質(zhì)呈弱堿性，杏宅水閘(XZ)水質(zhì)呈中性；6個斷面水體TN值具有一定差異，其由高到低依次為杏宅水閘(XZ)、洛陽橋(LY)、前后埭交界處(QHD)、惠女水庫(HN)、福濱街橋(FB)和后坂水庫(HB)，其中后坂水庫(HB)TN值最低(0.04 mg/L)；根據(jù)《國家地表水環(huán)境質(zhì)量標準》中TN含量的限值，后坂水庫(HB)和前后埭交界處(QHD)的水質(zhì)類別為Ⅰ類水，惠女水庫(HN)和福濱街橋(FB)為Ⅱ類水，而洛陽橋(LY)和杏宅水閘(XZ)的水質(zhì)類別分別為Ⅲ類和Ⅳ類.NH3-N含量和TP最高均為杏宅水閘(XZ)，其次是福濱街橋(FB)和前后埭交界處(QHD)，水庫和入海口NH3-N含量和TP則相對較低.根據(jù)《國家地表水環(huán)境質(zhì)量標準》中NH3-N含量的限值，后坂水庫(HB)、惠女水庫(HN)、福濱街橋(FB)和洛陽橋(LY)的水質(zhì)類別均為Ⅱ類，前后埭交界處(QHD)和杏宅水閘(XZ)的水質(zhì)類別分別為Ⅲ類和Ⅳ類；根據(jù)《國家地表水環(huán)境質(zhì)量標準》中TP含量的限值，后坂水庫(HB)、惠女水庫(HN)和洛陽橋(LY)均為Ⅰ類水，前后埭交界處(QHD)為Ⅱ類水，福濱街橋(FB)和杏宅水閘(XZ)均為Ⅲ類水.洛陽橋(LY)CODMn值達到11.0 mg/L，除洛陽橋(LY)外，其他5個斷面水體CODMn值差異較??；根據(jù)《國家地表水環(huán)境質(zhì)量標準》中CODMn含量的限值，除洛陽橋(LY)為Ⅴ類水外，其他5個斷面水體的水質(zhì)類別均為Ⅱ類.對比各斷面水體Chla值可知，前后埭交界處(QHD)葉綠素a含量最高，而福濱街橋(FB)葉綠素a含量最低.

表2 洛陽江流域不同水樣采集點水質(zhì)指標及評價Tab.2 Water quality index and evaluation of Luoyang River at the different water sampling sites

2.2 α-多樣性分析

洛陽江不同水樣采集點α-多樣性指數(shù)見表3.由表可知，洛陽江流域6個斷面水體中微生物Coverage指數(shù)均大于0.99，說明樣品中絕大多數(shù)DNA序列被測出，即測序深度可以反應出樣品中微生物的真實情況.就OTU數(shù)量而言，6個斷面水體真核浮游生物OTU總數(shù)差異較大，惠女水庫(HN)、福濱街橋(FB)和杏宅水閘(XZ)OUT數(shù)目較高，前后埭交界處(QHD)、后坂水庫(HB)、洛陽橋(LY)OUT數(shù)目較低；就Chao指數(shù)而言，福濱街橋(FB)Chao指數(shù)最大，惠女水庫(HN)和杏宅水閘(XZ)相對次之，而洛陽橋(LY)的Chao指數(shù)最小；6個斷面水體Shannon指數(shù)具有一定差異，惠女水庫(HN)的Shannon指數(shù)最高，而后坂水庫(HB)的Shannon指數(shù)最低.以上可以得出，真核浮游生物豐富度最高的是福濱街橋(FB)，其次是惠女水庫(HN)，最低的是洛陽橋(LY)；真核浮游生物多樣性最好的是惠女水庫(HN)，其次是福濱街橋(FB)，而處于洛陽江流域源頭的后坂水庫(HB)真核浮游生物多樣性最差.結(jié)合水體理化指標結(jié)果分析可知，真核浮游生物多樣性與氮素有較大的關聯(lián)性，氮素與眾多水生微生物顯著正相關，而后坂水庫(HB)的TN含量和NH3-N含量均為最低，導致了該斷面水體的真核浮游生物多樣性最差.

表3 洛陽江不同水樣采集點α-多樣性指數(shù)Tab.3 α-diversity index of Luoyang River at the different water sampling sites

圖1 OTU水平下洛陽江水庫(WR)、河流(RR) 和入?？?ER)3個小組真核浮游生物韋恩圖Fig.1 Venn diagram of eukaryotic plankton OTU number of Luoyang River in three groups of reservoir (WR), river (RR) and estuary(ER)

2.3 物種Venn圖分析

根據(jù)洛陽江流域的水域位置和功能特點，將6個斷面水體劃分成水庫(WR)、河流(RR)和入?？?ER)3個小組.其中水庫(WR)包括后坂水庫(HB)和惠女水庫(HN)，河流(RR)包括福濱街橋(FB)、前后埭交界處(QHD)和杏宅水閘(XZ)，入?？?ER)包括洛陽橋(LY).由圖1Venn圖可知，3個小組總共OTU數(shù)量為212個.其中3個小組共有32個OTU；水庫(WR)和河流(RR)共有102個OTU，說明二者物種組成最為相似性；水庫(WR)、河流(RR)和入?？?ER)特有的OTU數(shù)分別為27、47和23，說明各自的物種組成均具獨特性，相比較而言河流(RR)物種組成更為獨特.水體中高含量的TP可能是導致河流(RR)物種組成更為特殊的重要因素，組成河流(RR)的3個斷面水體TP含量明顯高于水庫(WR)和入?？?ER)，過量的TP使河流(RR)水域中包括藻類等不同種類真核浮游生物得以大量繁殖，從而造成該水域物種組成更為獨特.

2.4 結(jié)構(gòu)組成分析

洛陽江流域6個斷面水體中真核浮游生物種類為33個門、46個綱、60個目、71個科、100個屬，不同斷面水體真核浮游生物種類和相對含量不同.圖2為門水平下相對豐度大于1%優(yōu)勢物種，其他物種合并為others.后坂水庫(HB)優(yōu)勢物種主要有隱藻類(Cryptomonadales，81.2%)和纖毛門(Ciliophora，5.9%)；惠女水庫(HN)優(yōu)勢物種主要有隱藻類(Cryptomonadales，31.5%)、領鞭毛類(Choanoflagellida，16.3%)、真核域未分類門(unclassified_d_Eukaryota，13.6%)、壺菌門(Chytridiomycota)、P1-31門(P1-31，8.3%)、子囊菌門(Ascomycota，7.1%)和纖毛門(Ciliophora，6.2%)；福濱街橋(FB)優(yōu)勢物種主要為子囊菌門(Ascomycota，44.1%)、纖毛門(Ciliophora，32.3%)、隱藻類(Cryptomonadales，12.2%)和隱真菌門(Cryptomycota，5.1%)；前后埭交界處(QHD)優(yōu)勢物種主要為纖毛門(Ciliophora，60.7%)、隱藻類(Cryptomonadales，27.6%)和真核域未分類門(unclassified_d_Eukaryota，4%)；杏宅水閘(XZ)優(yōu)勢物種主要為隱藻類(Cryptomonadales，52.8%)、纖毛門(Ciliophora，41.1%)和真核域未分類門(unclassified_d_Eukaryota，4.6%)；洛陽橋(LY)主要優(yōu)勢物種為纖毛門(Ciliophora，85.0%)和隱藻類(Cryptomonadales，11.8%).6個斷面水體共有的優(yōu)勢物種為纖毛門和隱藻類，這兩類真核浮游生物是河流中常見浮游生物群落.后坂水庫(HB)到入?？诼尻枠?LY)的纖毛門浮游生物含量呈遞增趨勢，其中后坂水庫(HB)和惠女水庫(HN)變化較小，福濱街橋(FB)到洛陽橋(LY)變化相對顯著.隱藻類浮游生物含量最高為后坂水庫(HB)，最低為洛陽橋(LY).惠女水庫(HN)和福濱街橋(FB)含有含量較高的子囊菌門，說明子囊菌門浮游生物在二者的水體生態(tài)系統(tǒng)中具有一定的特殊功能.此外，惠女水庫(HN)優(yōu)勢物種種類最多且相對豐度比較平均，說明其真核浮游生物群落組成較為均衡.

圖3顯示屬水平下相對豐度大于1%的優(yōu)勢物種，其他物種合并為others.后坂水庫(HB)、惠女水庫(HN)、福濱街橋(FB)、前后埭交界處(QHD)和杏宅水閘(XZ)的隱藻屬(Cryptomonas)相對豐度均大于10%，洛陽橋(LY)中隱藻屬相對豐度小于1%；其中后坂水庫(HB)隱藻屬相對豐度最大為80.9%，其次是前后埭交界處(QHD)和惠女水庫(HN)，相對豐度分別為51.4%和31.3%.說明隱藻屬最適生長環(huán)境為水質(zhì)較好的水體.散毛亞綱分類不明屬(norank_f_Choreotrichia)為杏宅水閘(XZ)和洛陽橋(LY)的主要優(yōu)勢物種，相對豐度分別達到59.6%和58.7%.下游的杏宅水閘(XZ)和洛陽橋(LY)水質(zhì)狀況低于上游水庫，說明隱藻屬和散毛亞綱分類不明屬是河流水質(zhì)狀況好壞的重要指標.筒殼蟲屬(Tintinnidium)是前后埭交界處(QHD)和福濱街橋(FB)的特有優(yōu)勢物種，相對豐度分別為37.8%和14.6%.酵母目未分類屬(unclassified_o_Saccharomycetales)單獨存在于福濱街橋(FB)，該類微生物在河流中的作用主要是分解糖類等有機物，為其他微生物提高營養(yǎng)物質(zhì).由此可知，福濱街橋(FB)中存在豐富的有機物質(zhì).惠女水庫(HN)門水平和屬水平下的優(yōu)勢物種種類較多，優(yōu)勢物種均勻度較好，說明其水體生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定.

圖2 門水平下洛陽江6個水樣采集點真核浮游生物群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Eukaryotic plankton communities of Luoyang River in six water sampling at the phylum level

圖3 屬水平下洛陽江6個水樣采集點真核浮游生物群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Eukaryotic plankton communities of Luoyang River in six water sampling at the genus level

2.5 β-多樣性分析

層級聚類分析可以直觀地將采樣點物種組成相似或差異程度反映在層級聚類樹圖上，如果物種組成越相似，在層級聚類樹圖中距離數(shù)值就越接近.如圖4所示，6個采樣點間都相差一定距離，說明真核浮游生物群落組成都有一定差異.其中，后坂水庫(HB)和前后埭交界處(QHD)優(yōu)先聚類，說明二者真核浮游生物群落差異程度最小，其次是惠女水庫(HN)和前后埭交界處(QHD)；后坂水庫(HB)和惠女水庫(HN)真核浮游生物群落組成也較為相近；洛陽橋(LY)與其他5個采樣點的差距明顯，說明其真核浮游生物群落組成與其他5個采樣點之間差異顯著.由以上可知，洛陽江流域入?？诘恼婧烁∮紊锶郝浣M成與水庫和河流區(qū)域有明顯區(qū)別.

圖4 OTU水平下洛陽江不同水樣采集點真核浮游生物群落層級聚類分析Fig.4 Eukaryotic plankton communities hierarchical clustering analysis of Luoyang River in different water sampling sites at the OTU level

2.6 真核浮游生物多樣性與環(huán)境因子相關性分析

圖5 門水平下洛陽江不同水樣采集點真核浮游生物群落多樣性與環(huán)境因子相關性熱圖Fig.5 Spearman correlation heatmap of Luoyang River in different water sampling sites of eukaryotic plankton communities diversity and environmental factors at the phylum level

圖6 洛陽江不同水樣采集點真核浮游生物群落 的FUNGuild功能預測分析Fig.6 Eukaryotic plankton communities FUNGuild function predictive analysis of Luoyang River in different water sampling sites

2.7 FUNGuild功能預測分析

洛陽江不同斷面水體真核浮游生物群落的FUNGuild功能預測如圖6所示.其中惠女水庫(HN)和福濱街橋(FB)真核浮游生物的營養(yǎng)型和功能群落組成較為特殊，分別含有相對豐度為6.7%和42.7%的未定義腐生營養(yǎng)型微生物(Undefined Saprotroph).腐生營養(yǎng)型微生物是河流中重要分解者，能夠?qū)⒑恿髦写蟛糠謩又参锓纸鉃闊o機碳和無機氮等物質(zhì)，從而起到凈化水體的作用.惠女水庫(HN)和福濱街橋(FB)中未定義腐生營養(yǎng)型微生物與特有優(yōu)勢物種子囊菌門含量較為一致，說明這兩個斷面水體中未定義腐生營養(yǎng)型微生物可能對應的是子囊菌門下的真核浮游生物群落.

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