林花王欣宇金龍哲王宇輝刁春研安然王懷志車成來(lái)

(1.吉林省延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 延吉 133001；2.吉林省汪清縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,吉林 汪清 133100)

竹茹(Bambusae Caulisin Taenias)，為禾本科植物青稈竹、大頭典竹或淡竹的莖稈的干燥中間層。竹茹具有清熱化痰、除煩止嘔等功效，常用于治療熱痰引起的痰熱咳嗽、痰火挾痰、煩熱嘔吐等病癥。竹茹是臨床常用中藥材之一[1]，自古以來(lái)竹的品種多樣，導(dǎo)致竹茹的基元植物有很多種。宋·唐慎微《證類本草》中就記載有淡竹茹、苦竹茹、青竹茹之分[2]。日本學(xué)者村井杶在《藥征續(xù)編》中提出“凡方內(nèi)稱竹茹者，用淡竹之茹。若無(wú)，則諸竹亦可權(quán)用”[3]。竹茹提取物中所含有的苜蓿素(Tricin)是天然黃酮的一種，具有抗炎[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、抗病毒[7]和免疫調(diào)節(jié)[8]的作用。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明[9]，苜蓿素有抗腸癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、白血病等惡性腫瘤作用。雖然苜蓿素的藥理作用一直是學(xué)者的研究目標(biāo)，但是對(duì)于苜蓿素在植物中的含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)相對(duì)較少，缺少含量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。竹茹、竹根和淡竹葉等禾本類中草藥里苜蓿素的含量較高，且我國(guó)竹資源豐富、價(jià)格低廉，在未來(lái)的開發(fā)利用方面具有極大的優(yōu)勢(shì)。

高效液相色譜技術(shù)[10]在化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜有著高壓、高效、高靈敏度的特點(diǎn)，且應(yīng)用范圍廣、分析速度快、載液流速快。此外，還有色譜柱可以反復(fù)應(yīng)用，樣品易回收、不易被破壞的優(yōu)點(diǎn)。本文運(yùn)用高效液相色譜法為竹茹中苜蓿素的含量測(cè)定提供參考數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 藥材與試劑

竹茹藥材，延吉市藥房；甲醇，色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯，分析純，北京化工廠；二氯甲烷，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；柱層層析硅膠，200～300目，青島海洋化工廠；薄層層析硅膠，GF254，青島海洋化工廠；乙醇，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸，分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司；蒸餾水、純化水，自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器N-1200B型，東京理化器械株式會(huì)社；制備型中壓液相色譜儀CHEETAN MP100，博納艾杰爾科技有限公司；超聲波清洗儀SB-5200，寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平AR124CN，奧豪斯儀器有限公司；DAD高效液相色譜Chromaster 5430，日本島津儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵SHB-IIIA，上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；超純水機(jī)Unique-R20，廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司；恒溫水浴鍋N-1200B型，東京理化器械株式會(huì)社；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)TKB3-6661-01，東京理化器械株式會(huì)社。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 竹茹中苜蓿素的提取分離

2.1.1 竹茹的提取

取竹茹4.5kg，用95%乙醇加熱回流提取3h，共提取3次，過(guò)濾收集3次的濾液，將濾液旋干得竹茹提取物浸膏570g。將竹茹95%乙醇層中的浸膏加入蒸餾水1500mL并攪拌溶解，加入等體積石油醚進(jìn)行萃取，同法萃取3次，合并萃取液并將萃取液旋干，得到竹茹石油醚層浸膏118g。加入相同體積的乙酸乙酯繼續(xù)進(jìn)行萃取，萃取3次，合并萃取液并將萃取液旋干，得到竹茹乙酸乙酯層浸膏43g。提取過(guò)程見圖1。

圖1 竹茹提取分離流程圖

2.1.2 苜蓿素的分離

將乙酸乙酯萃取物以干法上樣。選用石油醚∶乙酸乙酯(30∶1～1∶1)為溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，每250mL為1個(gè)流份。通過(guò)TLC結(jié)果，合并相同組分，共得到12個(gè)組分，標(biāo)記為A～L。

將I組分(1.5g)利用正向硅膠柱層析法，干法上樣，以二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇(150∶10∶1～10∶10∶1)進(jìn)行梯度洗脫，將得到的各組分根據(jù)薄層色譜點(diǎn)板結(jié)果，合并相同的組分，得到苜蓿素68mg。

圖2 苜蓿素的分離流程圖

2.2 竹茹中苜蓿素含量測(cè)定方法建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Thermo C18 ODS(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相為1%乙酸水溶液(A)-乙腈(B)；檢測(cè)波長(zhǎng)為354nm；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為10μL；流速為1.0mL·min-1。梯度洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2.2 對(duì)照品溶液配制

稱取苜蓿素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入甲醇超聲溶解，制成0.2mg·mL-1溶液，用微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.2.3 供試品溶液制備

取竹茹藥材1kg，用95%乙醇冷浸法浸泡3d，過(guò)濾旋干后將浸膏用蒸餾水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取3次，分別合并萃取液，將得到的乙酸乙酯層萃取物旋干，加甲醇溶解，制成20mg·mL-1溶液，用微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密稱定苜蓿素10mg，用甲醇溶解并稀釋成0.5mg·mL-1儲(chǔ)備液，分別精密吸取上述儲(chǔ)備液1mL、1.5mL、3mL、5mL、7mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。進(jìn)樣量10μL，記錄峰面積。以濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，測(cè)定結(jié)果如表2所示，得到回歸方程：Y=36009X-44332，R2=0.9995，線性范圍為0.05～0.35mg·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

圖5 苜蓿素標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定結(jié)果

2.2.5 精密度的考察

取2.2.3下供試品溶液，按2.2.1下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次。根據(jù)峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察精密度。經(jīng)計(jì)算，峰面積均值為5223051，RSD為0.23%，表明儀器的精密度良好。結(jié)果見表3。

表3 精密度檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.6 重復(fù)性的考察

取同一批竹茹供試品，按2.2.3下的方法制備供試品溶液6份，并按2.2.1下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣后根據(jù)得到的峰面積值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察重復(fù)性。經(jīng)計(jì)算,峰面積均值為4783915，RSD為1.12%，表明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 穩(wěn)定性考察

取竹茹供試品溶液，按2.2.1下色譜條件測(cè)定，分別于0h、2h、4h、8h、12h、24h進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)峰面積計(jì)算RSD值，考察穩(wěn)定性。經(jīng)計(jì)算,峰面積均值為4818914，RSD為0.57%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.2.8 加樣回收率

精密稱取3份適量已知含量的竹茹供試品，分別精密加入各標(biāo)準(zhǔn)品，按2.2.1色譜條件測(cè)定，平均回收率為97.98%，RSD為0.60%，表明本方法加樣回收率良好，準(zhǔn)確可行。結(jié)果見表6。

表6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 樣品含量測(cè)定

取竹茹供試品，按2.2.3下方法制備濃度為20mg·mL-1的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，取平均值，根據(jù)峰面積計(jì)算含量。結(jié)果見表7。

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果

將峰面積的平均值代進(jìn)回歸方程：Y=36009X-44332中，得X=134.53，即每20mg供試品中有0.1345mg的苜蓿素，最后測(cè)得竹茹乙酸乙酯層萃取物中苜蓿素的含量為6.73mg·g-1，百分含量為0.673%。竹茹中苜蓿素的含量為0.0064%。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 苜蓿素的結(jié)構(gòu)鑒定

圖6 苜蓿素的結(jié)構(gòu)式

該化合物分子式為C17H13O7，分子量為330，黃色結(jié)晶，可溶于甲醇、吡啶、DMSO等溶劑。

在1H-NMR(500MHz,Pyridine-d5)中共出現(xiàn)了6個(gè)氫信號(hào)峰，包括羥基氫信號(hào)峰δH13.8(1H，s，5-OH)；芳香氫信號(hào)峰δH7.46(2H，s，H-2′,6′)、δH6.90(1H，d,J=2.0Hz，H-8)和δH6.77(1H，d,J=2.0Hz，H-6)；黃酮C環(huán)上的氫信號(hào)峰δH7.04(1H，s，H-3)；甲氧基位置上氫的信號(hào)峰δH3.88(6H，s，H-3′，5′-OCH3)。

在13C-NMR(125MHz,Pyridine-d5)中共出現(xiàn)了12個(gè)碳信號(hào)峰，推測(cè)為黃酮類化合物。包括酮基碳信號(hào)峰δC183.1(C-4)；苯環(huán)上的碳信號(hào)峰δC165.0(C-7)、δC163.5(C-9)、δC158.9(C-5)、δC149.7(C-3′，5′)、δC142.5(C-4′)、δC121.7(C-1′)、δC105.6(C-2′，6′)、δC105.4(C-10)、δC100.4(C-6)和δC95.4(C-8)；黃酮C環(huán)上的碳信號(hào)峰δC166.2(C-2)和δC104.8(C-3)；連接甲氧基的碳的信號(hào)峰δC56.9(C-3′，5′-OCH3)。

根據(jù)氫譜、碳譜以及程聰梅等研究方法[11]，確定該化合物為苜蓿素。

3.2 苜蓿素含量測(cè)定方法建立結(jié)果

3.2.1 精密度考察

測(cè)定6次峰面積，并計(jì)算平均值，其RSD值為0.23%，<2%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

3.2.2 重現(xiàn)性考察

測(cè)定6份樣品，進(jìn)樣量為20mg·mL-1為1.12%，<2%，說(shuō)明該方法的重現(xiàn)性良好。

3.2.3 穩(wěn)定性考察

測(cè)定1份供試品溶液在0h、2h、4h、8h、12h、24h進(jìn)樣，進(jìn)行含量測(cè)定。其RSD值為0.57，<2%，證明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定，不易變質(zhì)，可以進(jìn)行長(zhǎng)期的含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

表8 苜蓿素氫譜及碳譜的化學(xué)位移

3.2.4 加樣回收率考察

精密稱取3份已知含量的供試品溶液，按照供試品成分含量的80%、100%、120%加入對(duì)照品，RSD值為0.60%，<2%，符合方法學(xué)驗(yàn)證中加樣回收率的要求，證明本方法準(zhǔn)確可行。

3.2.5 含量測(cè)定

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，測(cè)得供試品竹茹乙醇提取物中苜蓿素的含量為6.73mg·g-1。

4 結(jié)論

在50.0～350.0μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，苜蓿素的線性關(guān)系良好，為Y=36009x-44332(R2=0.9995)，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均<2%(n=6)，加樣回收率為97.98%(RSD=0.60%)，由此說(shuō)明，HPLC法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定竹茹中苜蓿素的含量。結(jié)果顯示，苜蓿素在竹茹中的含量為6.73mg·g-1。過(guò)去的相關(guān)文獻(xiàn)中，缺少竹茹中苜蓿素含量測(cè)定的報(bào)道，故本文為藥典苜蓿素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了數(shù)據(jù)參考，為苜蓿素的后續(xù)研究提供理論依據(jù)。