張向前，李楠，解新明

表觀遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與探討

張向前1，李楠2，解新明1

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣州 510642 2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與實(shí)踐訓(xùn)練中心，廣州 510642

表觀遺傳學(xué)是構(gòu)筑完整的遺傳學(xué)架構(gòu)的必要內(nèi)容，是現(xiàn)代遺傳學(xué)教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。為了使學(xué)生更好地掌握這方面知識(shí)，本文以科學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有表觀遺傳特性的水稻突變體(,)為實(shí)驗(yàn)材料，設(shè)計(jì)了一個(gè)表觀遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)。水稻突變體植株變矮、穗長縮短、穗型直立且著粒密度增加。突變機(jī)理研究表明，DNA甲基化修飾變異引起過量表達(dá)是產(chǎn)生突變表型的原因。該實(shí)驗(yàn)以突變體表型觀測作為切入點(diǎn)，將科學(xué)研究與課程教學(xué)、課程實(shí)驗(yàn)與開放實(shí)驗(yàn)深度融合，向?qū)W生展現(xiàn)了一個(gè)典型表觀遺傳學(xué)研究課題的完整脈絡(luò)和前沿技術(shù)。通過該實(shí)驗(yàn)，學(xué)生能對(duì)表觀遺傳學(xué)有一個(gè)更為直觀的認(rèn)識(shí)，可深入理解表型與基因型、表觀遺傳修飾與基因表達(dá)之間的關(guān)系，有助于培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維和創(chuàng)新能力。

表觀遺傳學(xué)；綜合性實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)教學(xué)；DNA甲基化

遺傳學(xué)是探究生物遺傳和變異規(guī)律的科學(xué)，是生命科學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)學(xué)科。表觀遺傳學(xué)則是遺傳學(xué)的重要分支，研究一切非DNA序列改變引起的可遺傳變異。表觀遺傳變異擴(kuò)大了真核生物的表型多樣性，能夠?qū)ι锏谋硇秃桶l(fā)育進(jìn)程產(chǎn)生重要影響，可以解釋很多經(jīng)典遺傳學(xué)所無法解釋的現(xiàn)象[1,2]。然而如何突破傳統(tǒng)遺傳學(xué)知識(shí)架構(gòu)，將表觀遺傳學(xué)更好地融入現(xiàn)代遺傳學(xué)教學(xué)中，向?qū)W生呈現(xiàn)系統(tǒng)、完整的遺傳學(xué)知識(shí)，是目前教學(xué)改革中值得深入思考的問題。

目前，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中應(yīng)用的綜合性實(shí)驗(yàn)，以傳授經(jīng)典遺傳學(xué)理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能為主的內(nèi)容較為成熟，且在教學(xué)應(yīng)用上已形成相對(duì)穩(wěn)定的課程實(shí)驗(yàn)和課程開放性實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的教學(xué)模式，但在知識(shí)的深度和廣度方面還有提升空間。當(dāng)前，為適應(yīng)高等農(nóng)林教育發(fā)展改革的需要，遺傳學(xué)需開展科教融合人才培養(yǎng)模式探索[3]。擬在已有課程教學(xué)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，融合科學(xué)研究的前沿性和創(chuàng)新性等優(yōu)勢，設(shè)計(jì)創(chuàng)新、有挑戰(zhàn)的新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目提升學(xué)生實(shí)踐應(yīng)用能力和創(chuàng)新研究能力。

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)研究團(tuán)隊(duì)從粳稻“中花11”中篩選到一個(gè)不完全顯性遺傳的突變體，該突變雜合體植株略矮而穗長顯著變短，命名為()，是一個(gè)典型的表觀遺傳突變體[4]。本文利用該特異材料，設(shè)計(jì)了一個(gè)表觀遺傳學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。該項(xiàng)目有助于學(xué)生對(duì)遺傳學(xué)知識(shí)的全面認(rèn)識(shí)和理解，能幫助學(xué)生理清表型與基因型、表觀遺傳修飾與基因表達(dá)之間的關(guān)系。從技術(shù)層面上，通過該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，學(xué)生可學(xué)習(xí)到RT-PCR和甲基化檢測等新技術(shù)。就教學(xué)層面而言，本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目著力于培養(yǎng)學(xué)生在觀察中發(fā)現(xiàn)并提出問題，在實(shí)踐中獨(dú)立思考并探索解決問題的能力。同時(shí)，在自主探究實(shí)驗(yàn)中鼓勵(lì)學(xué)生運(yùn)用已有知識(shí)去嘗試解決新問題，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)際應(yīng)用和創(chuàng)新研究能力有著重要的實(shí)踐意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料的背景與設(shè)計(jì)思路

稻穗和花序的形態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)水稻穗型塑造及提高水稻產(chǎn)量有著重要意義。在高等植物中，由表觀遺傳變異引起稻穗突變的例子有限。本文所述的水稻突變體是1例不完全顯性遺傳的自然變異突變體。該突變雜合體植株略矮而穗長顯著變短，突變純合體更加矮小，頂端分生組織異常，稻穗分化嚴(yán)重受損。有趣的是，該突變有低頻率的自發(fā)回復(fù)突變現(xiàn)象，因而個(gè)別單株的不同分蘗甚至同一稻穗的不同穗分支都可呈現(xiàn)野生型與突變型共存的現(xiàn)象[4]。這些嵌合體表型是表觀遺傳變異的典型特征，暗示可能是1個(gè)表觀遺傳突變體。水稻突變體可跨代穩(wěn)定遺傳，目前已通過圖位克隆(map-based cloning)技術(shù)將該基因定位在第1染色體上。進(jìn)一步研究表明，基因的DNA序列沒有改變，而基因的DNA甲基化修飾變異引起過量表達(dá)是造成突變體表型的原因[4]。

為使水稻突變體更好的應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)，課題組進(jìn)行如下教學(xué)設(shè)計(jì)。首先，與學(xué)生一起回顧孟德爾遺傳學(xué)理論知識(shí)，提出“不完全顯性遺傳會(huì)在后代表型中表現(xiàn)出怎樣的特征？”，提供給學(xué)生突變體與野生型稻穗，引導(dǎo)學(xué)生觀察表型差異。并對(duì)該材料的F1雜合體和F2群體進(jìn)行表型調(diào)查和遺傳分析，以闡明突變表型不完全顯性遺傳現(xiàn)象和低頻率的自發(fā)回復(fù)突變現(xiàn)象，由此提出科學(xué)問題與研究方法。其次，在遺傳分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展目的基因的圖位克隆和候選基因突變位點(diǎn)分析，引導(dǎo)學(xué)生分析DNA序列變異和基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)DNA序列無差異而基因表達(dá)有差異，有悖于經(jīng)典的突變，進(jìn)一步提出可探索的問題。最后，引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)入自主探究性實(shí)驗(yàn)，獨(dú)立開展表觀遺傳修飾與基因表達(dá)關(guān)系的研究。該實(shí)驗(yàn)整個(gè)教學(xué)設(shè)計(jì)基于問題引導(dǎo)式教學(xué)模式(problem based learning, PBL)，即“觀察現(xiàn)象——提出科學(xué)研究問題——實(shí)踐研究問題——分析問題——再實(shí)踐研究問題——得出科學(xué)結(jié)論”，實(shí)現(xiàn)學(xué)生科學(xué)研究思維和創(chuàng)新研究能力的培養(yǎng)[5]。

2 教學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

掌握基因圖位克隆和RT-PCR技術(shù)，了解表觀遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)及研究方法，探究DNA甲基化修飾與基因表達(dá)的關(guān)系，提升學(xué)生科學(xué)思維與創(chuàng)新研究的能力。

2.2 實(shí)驗(yàn)涉及理論知識(shí)點(diǎn)

該實(shí)驗(yàn)涉及的理論知識(shí)點(diǎn)主要包括表觀遺傳學(xué)、DNA甲基化修飾、圖位克隆等。表觀遺傳學(xué)是研究基因在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，DNA甲基化、基因組印記、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑及核仁顯性等因素的改變，導(dǎo)致基因表達(dá)甚至生物表型發(fā)生的可遺傳變異，是遺傳學(xué)中非常重要的分支學(xué)科。DNA甲基化(DNA methylation)是在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在的一種DNA共價(jià)修飾形式，在DNA甲基化酶/去甲基化酶的作用下，對(duì)DNA的胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)(主要是C)進(jìn)行甲基化的添加/移除修飾，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)[6～8]。

DNA 甲基化修飾與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。一般來說，DNA序列尤其是基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化，往往抑制基因表達(dá)，而去甲基化則會(huì)造成基因過量表達(dá)[9,10]。此外，有證據(jù)表明，基因下游區(qū)段的甲基化狀態(tài)也參與了基因表達(dá)調(diào)控[4,11]。

圖位克隆又稱定位克隆(positional cloning)，該方法利用目標(biāo)性狀分離群體，通過分析目標(biāo)性狀與已知分子標(biāo)記的遺傳連鎖關(guān)系，“按圖索驥”地實(shí)現(xiàn)目的基因的初步定位、精細(xì)定位、物理作圖，直至克隆目的基因[12]。

2.3 實(shí)驗(yàn)材料

水稻突變體是來自粳稻品種“中花11”的1例自然變異突變體。該突變體植株略矮而穗長顯著變短，呈不完全顯性遺傳。水稻突變體自2013年發(fā)現(xiàn)以來已連續(xù)繁殖17個(gè)世代，其候選基因()已通過圖位克隆策略獲得。

將水稻突變體與野生型雜交，并將F1自交獲得F2群體(A群體)，以突變體、野生型、F1植株及F2群體的成熟小穗，F(xiàn)2群體對(duì)應(yīng)的水稻葉片作為突變體表型鑒定及遺傳特性分析實(shí)驗(yàn)材料。將來自與秈稻品種華粳秈74構(gòu)建的F2群體用作突變體基因定位的分離群體(B群體)。所有材料均種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場，單株種植，常規(guī)管理。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1 突變體的鑒定和遺傳分析

將學(xué)生分組，提供給每組同學(xué)野生型、突變純合體、突變雜合體小穗各3株，先讓學(xué)生觀察和測量表型差異。再提供給學(xué)生A群體小穗210株，結(jié)合親本及F1雜合體表型進(jìn)行遺傳分析。配置直尺測量，并運(yùn)用SPSS18.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和檢驗(yàn)。

2.4.2 目的基因的圖位克隆和候選基因突變位點(diǎn)分析

選取4對(duì)SSR多態(tài)性標(biāo)記和2對(duì)Indel (insertion- deletion)標(biāo)記(表1)，檢測B群體200株中突變體表型單株基因型，比較其電泳帶型類別，掌握?qǐng)D位克隆中連鎖分析的遺傳學(xué)原理，學(xué)習(xí)遺傳距離的計(jì)算方法。隨后，結(jié)合科學(xué)研究結(jié)果要求學(xué)生進(jìn)一步分析圖位克隆所獲得的4個(gè)候選基因，鑒定候選基因突變位點(diǎn)。

2.4.3 基因表達(dá)分析

通過半定量RT-PCR方法完成基因表達(dá)分析，具體步驟如下：提取水稻樣品總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 純度及完整程度，–20℃保存或者直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物(引物序列見表1)，擴(kuò)增目的片段，經(jīng)電泳檢測，分析相關(guān)基因表達(dá)變化。

2.4.4 DNA甲基化分析和甲基化抑制劑處理

DNA甲基化分析：通過亞硫酸氫鹽修飾后測序法分析基因甲基化修飾變異情況，方法參照文獻(xiàn)[10]，操作步驟簡述如下：

(1)用亞硫酸氫鹽處理野生型(野生型“中花11”) 和突變體基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

(2)設(shè)計(jì)引物，以處理前后的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)將目的片段純化進(jìn)行TA克隆，挑選陽性克隆測序；

(4)將用亞硫酸氫鹽處理測得的序列與未處理序列比對(duì)，統(tǒng)計(jì)甲基化位點(diǎn)和數(shù)量，并分析野生型和突變體的甲基化差異。

甲基化抑制劑處理：利用甲基化抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine, 5-aza-dC)處理野生型“中花11”萌發(fā)的種子，一周后取樣進(jìn)行表達(dá)量分析，具體處理參照Zhang等[10]方法。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 水稻esp突變體的表型特征和遺傳分析

與野生型“中花11”相比，該突變雜合體植株略矮，而穗長及枝梗長度顯著縮短，引起穗粒數(shù)減少，而突變純合體相關(guān)表型更加嚴(yán)重，植株明顯矮化，頂端分生組織異常，稻穗分化嚴(yán)重受損(圖1)。對(duì)210株的F2群體(A群體)進(jìn)行遺傳分析，野生型58株，短穗型103株，嚴(yán)重矮桿49株，其分離比例符合1∶2∶1 (χ2= 0.85,>0.05)，表明突變表型為不完全顯性遺傳。有趣的是，該突變有低頻率的自發(fā)回復(fù)突變現(xiàn)象，因而個(gè)別單株不同分蘗甚至同一稻穗的不同的穗分支可呈現(xiàn)野生型與突變型共存的現(xiàn)象(圖1)。

3.2 突變基因的圖位克隆和候選基因分析

利用與秈稻品種華粳秈74 構(gòu)建的F2群體(B群體)突變株對(duì)進(jìn)行基因定位，發(fā)現(xiàn)與第1染色體上的標(biāo)記RM140和RM466連鎖，遺傳距離分別為0.7 cM 和5 cM。利用兩標(biāo)記間發(fā)展的Indel標(biāo)記，已將該基因(突變位點(diǎn))定位于51.2 kb 區(qū)間(圖2A)。在這個(gè)區(qū)間內(nèi)有4個(gè)基因，分別為、、和。為了鑒定突變位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)水稻基因組序列數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增野生型和突變體的目的區(qū)段，測序分析表明，在51.2 kb定位區(qū)間內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)DNA序列的改變。

圖1 水稻esp突變體表型特征

圖2 ESP基因圖位克隆和表達(dá)分析

此外，我們對(duì)定位區(qū)間的4個(gè)基因在突變體和野生型中的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，、和這3個(gè)基因在突變體中的表達(dá)量和野生型相比沒有顯著差異(數(shù)據(jù)略)?；蛟谝吧椭袔缀鯔z測不到，但是在突變體中其表達(dá)水平顯著上調(diào)，且該基因的表達(dá)量在純合體中高于雜合體(圖2B)。以上基因表達(dá)分析結(jié)果表明，可能是的候選基因。

進(jìn)一步對(duì)突變嵌合體植株(既有正常表型稻穗又有突變表型稻穗的突變體植株)表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，嵌合體有直立密穗表型的分蘗其基因的表達(dá)量高于同一植株上正常表型的分蘗(圖2C)。以上結(jié)果表明，突變體中的直立密穗表型是由于基因的過量表達(dá)所引起，進(jìn)一步支持就是的候選基因。

3.3 表觀遺傳修飾與ESP的表達(dá)調(diào)控

由于基因DNA序列沒有改變，但是候選基因的表達(dá)量卻有極顯著的差異，因此，我們推測目的基因可能發(fā)生了表觀遺傳變異。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳變異。為此，本實(shí)驗(yàn)通過氫鹽分析了甲基化修飾變異情況，結(jié)果表明，與野生型(高甲基化狀態(tài))相比突變體基因的3′端下游發(fā)生了DNA去甲基化，其具體的甲基化變異位點(diǎn)發(fā)生在基因下游289～601 bp區(qū)間(圖3A)。研究表明，DNA去甲基化通常可以導(dǎo)致基因的過量表達(dá)[11]。本研究中突變體基因下游區(qū)段的去甲基化引起了基因的過量表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致突變表型，與上述結(jié)論相吻合。

5-aza-dC是一種胞苷類似物，能夠通過限制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來抑制DNA甲基化，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。為了進(jìn)一步闡明基因的表達(dá)與甲基化修飾的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)利用甲基化抑制劑5-aza-dC處理野生型“中花11”幼苗(高甲基化狀態(tài))，然后對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)量分析。結(jié)果表明，相比于未處理的幼苗，經(jīng)甲基化抑制劑5-aza-dC處理的幼苗中，基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(圖3B)，說明野生型基因下游區(qū)段的去甲基化可引起基因的過量表達(dá)，是調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵因素，是導(dǎo)致突變表型的原因。

圖3 ESP基因DNA甲基化和基因表達(dá)分析

4 實(shí)踐教學(xué)中的課堂組織方式

4.1 以科研思路為導(dǎo)向，創(chuàng)新課堂教學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)主要以科學(xué)研究的思路作為教學(xué)主線，以有趣的材料表型為切入點(diǎn)，以表型調(diào)查、遺傳特性分析、圖位克隆、DNA甲基化分析及RT-PCR檢測技術(shù)為學(xué)習(xí)重點(diǎn)。首先，結(jié)合孟德爾遺傳定律與不完全顯性理論知識(shí)，引導(dǎo)學(xué)生通過表型觀察發(fā)現(xiàn)有趣的表型現(xiàn)象，提出科學(xué)研究問題；其次，將基因擴(kuò)增與測序分析相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)基因的DNA序列無差異而基因表達(dá)有差異，有悖于經(jīng)典遺傳的突變類型，進(jìn)一步提出可探索的問題；最后，將課程實(shí)驗(yàn)與課程開放實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，引入DNA甲基化理論知識(shí)和RT-PCR技術(shù)，引導(dǎo)學(xué)生運(yùn)用科學(xué)研究的思維和方法分析突變的本質(zhì)原因，幫助學(xué)生理清表型與基因型、基因修飾與基因表達(dá)的內(nèi)在聯(lián)系，學(xué)會(huì)科學(xué)研究的思維方法與技術(shù)手段，提升理論與實(shí)踐、知識(shí)與技術(shù)的整合運(yùn)用能力。

本部分共4次課的課程實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，每周1次課，每次課4個(gè)學(xué)時(shí)。

(1)突變體鑒定及遺傳特性分析1次課

首先結(jié)合孟德爾遺傳學(xué)理論知識(shí)，和學(xué)生探討遺傳分析方法與不完全顯性現(xiàn)象。拋出一個(gè)問題“不完全顯性遺傳會(huì)在后代表型中如何表現(xiàn)？”讓學(xué)生結(jié)合突變體、野生型及F1雜合體稻穗材料進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)三者在稻穗長度與形態(tài)上的差異。再次提供給每組學(xué)生200株F2群體(A群體)的小穗進(jìn)行遺傳分析，提醒學(xué)生留意觀察嵌合突變體表型，通過與常規(guī)變異相比較引導(dǎo)學(xué)生總結(jié)出突變體表型特征(表型的可逆性)，并獨(dú)立提出科學(xué)研究問題。

(2)基因定位和候選基因突變位點(diǎn)分析2次課

第一次課：水稻葉片DNA和幼穗RNA提取。結(jié)合遺傳學(xué)中遺傳物質(zhì)的分子基礎(chǔ)章節(jié)知識(shí)，講授基因定位方法和RNA提取技術(shù)。引導(dǎo)學(xué)生提取親本、雜合體及F2群體中突變純合體的DNA和RNA。

第二次課：講解分子標(biāo)記在實(shí)踐中的設(shè)計(jì)與應(yīng)用，學(xué)會(huì)分析電泳和測序結(jié)果。用已提取的基因定位群體DNA為模板，比較6對(duì)標(biāo)記帶型，掌握基因定位的本質(zhì)—標(biāo)記與表型的連鎖分析。待學(xué)生完成標(biāo)記連鎖分析后，結(jié)合研究結(jié)果，教師向?qū)W生揭示該突變基因的位置。引導(dǎo)學(xué)生學(xué)會(huì)分析突變體和野生型候選基因測序結(jié)果，并啟迪學(xué)生思考“候選基因DNA序列無改變而引起表型變異的可能原因”。

(3)候選基因表達(dá)分析1次課

重點(diǎn)結(jié)合基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄理論知識(shí)點(diǎn)，講解反轉(zhuǎn)錄方法和RT-PCR技術(shù)。用上次課提取的RNA為模板開展實(shí)驗(yàn)，要求學(xué)生以野生型和突變體幼穗為材料分組獨(dú)立完成定位區(qū)間4個(gè)候選基因表達(dá)分析。通過該實(shí)驗(yàn)學(xué)生會(huì)發(fā)現(xiàn)候選基因的表達(dá)量有著極顯著的差異，由此可以引導(dǎo)學(xué)生推測目的基因可能發(fā)生了表觀遺傳變異。結(jié)合表觀遺傳變異的理論知識(shí)點(diǎn)，和學(xué)生開展表觀遺傳變異的討論與思考。

4.2 引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)入自主探究性實(shí)驗(yàn)

通過以上實(shí)驗(yàn)，已為學(xué)生打開表觀遺傳學(xué)研究的大門。如何引領(lǐng)學(xué)生進(jìn)一步獨(dú)立探索引起該表型變異的核心原因，是該研究型實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。在接下來的自主探究性實(shí)驗(yàn)中，將采用任務(wù)驅(qū)動(dòng)和自主學(xué)習(xí)相結(jié)合的方法，以學(xué)生為主體，引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行文獻(xiàn)查閱、自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案、獨(dú)立開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以培養(yǎng)學(xué)生的獨(dú)立思考與探索研究能力。具體教學(xué)方法如下：

首先老師向?qū)W生提出問題：表觀遺傳學(xué)修飾有哪些？應(yīng)該先從哪里入手開展研究？讓學(xué)生帶著問題去查閱文獻(xiàn)資料，了解表觀遺傳修飾的類型及其研究方法。并引導(dǎo)學(xué)生總結(jié)分析前人研究結(jié)果，通過比較各種表觀遺傳修飾，理解DNA甲基化是植物基因組DNA最常見的一種表觀遺傳修飾，是維持基因組穩(wěn)定性的主要手段，在調(diào)節(jié)植物發(fā)育中起著重要作用，讓學(xué)生應(yīng)用科學(xué)研究思維去推測發(fā)生DNA甲基化的可能性。

確定DNA甲基化修飾研究方向后，需要學(xué)生理清DNA甲基化修飾與基因表達(dá)的關(guān)系，因此要求學(xué)生查閱前沿研究成果，例如Ichino等[13]發(fā)表的最新研究論文，幫助學(xué)生了解DNA甲基化介導(dǎo)基因沉默的發(fā)生與維持的機(jī)制等。在此基礎(chǔ)上，學(xué)生需思考如何開展DNA甲基化修飾變異研究，并提出DNA甲基化檢測可供選擇的方案(例如甲基化特異性PCR、氫鹽測序法或全基因組的甲基化分析)，通過比較分析，選用其中一種方法開展研究。在此過程中，教師需及時(shí)跟進(jìn)、解疑答惑，并做好引導(dǎo)。教學(xué)實(shí)踐表明，大部分學(xué)生會(huì)優(yōu)先考慮氫鹽測序法鑒定DNA甲基化修飾。

確定該方法后，師生共同討論并完善實(shí)驗(yàn)方案，開展DNA甲基化研究。在該研究方案中因氫鹽處理樣品及其后續(xù)產(chǎn)物，需根據(jù)實(shí)際教學(xué)學(xué)時(shí)數(shù)進(jìn)行調(diào)整，如果時(shí)間充裕，會(huì)引導(dǎo)學(xué)生完成該實(shí)驗(yàn)。若時(shí)間有限，至少需讓學(xué)生氫鹽發(fā)現(xiàn)甲基化位點(diǎn)，分析野生型和突變體的甲基化差異。教學(xué)實(shí)踐表明，在完成甲基化變異位點(diǎn)分析后，大多數(shù)學(xué)生對(duì)DNA甲基化修飾程度與基因表達(dá)活性呈反比關(guān)系都會(huì)有較好的把握，但是對(duì)DNA甲基化發(fā)生位點(diǎn)的總結(jié)多有疏漏，如對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化修飾影響基因表達(dá)活性容易理解，而對(duì)基因下游DNA甲基化修飾與基因表達(dá)調(diào)控關(guān)注不多，會(huì)對(duì)本文的研究結(jié)果存疑。鑒于此，教師可提出下一步研究問題“如何證實(shí)突變體中DNA去甲基化修飾是基因高表達(dá)的原因”。

為了進(jìn)一步闡明基因的表達(dá)與甲基化修飾的關(guān)系，還需引導(dǎo)學(xué)生從突變體自身特點(diǎn)入手，討論表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)方案。本文的突變體是1例自然變異突變體，相較與野生型基因的高甲基化修飾狀態(tài)，突變體中位點(diǎn)是低甲基化修飾(去甲基化)。因此如果通過某種途徑人工創(chuàng)制變異，將野生型的高甲基化修飾轉(zhuǎn)變?yōu)榈图谆癄顟B(tài)，那么野生型的基因表達(dá)水平亦會(huì)隨之改變。學(xué)生經(jīng)過分析，思路會(huì)更加清晰，通過查閱文獻(xiàn)，會(huì)選擇甲基化抑制劑處理野生型，并通過基因表達(dá)分析，驗(yàn)證假設(shè)。正如預(yù)期，在甲基化抑制劑處理的幼苗中，基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(圖3B)，表明基因甲基化是導(dǎo)致突變表型的原因。另外，由于基因具有長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA, lncRNA)屬性，其甲基化區(qū)段是典型的CpG island，仍有很多值得學(xué)生進(jìn)一步探索和思考的科學(xué)問題。

5 表觀遺傳在遺傳學(xué)案例教學(xué)中的思考

科研與教學(xué)是緊密結(jié)合并相互促進(jìn)的，科研的研究思路和前沿信息，常常被帶入教學(xué)中激發(fā)學(xué)生對(duì)遺傳學(xué)理論知識(shí)的學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)研究能力和知識(shí)應(yīng)用能力[14]。本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行科教融合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)問題值得探討。表觀遺傳學(xué)教學(xué)無論是從材料的特異性要求，還是知識(shí)的廣度深度上，都是遺傳學(xué)教學(xué)中的一個(gè)難點(diǎn)。首先，在表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中材料是關(guān)鍵，典型的材料可以將復(fù)雜的表觀遺傳學(xué)知識(shí)形象化和簡單化，更有利于學(xué)生深刻的理清表型與基因型、基因修飾與基因表達(dá)的本質(zhì)聯(lián)系。其次，在當(dāng)前的基礎(chǔ)課程之上，如何能更好的幫助學(xué)生拓寬知識(shí)深度與廣度，提升學(xué)生的知識(shí)整合與應(yīng)用能力，實(shí)驗(yàn)的巧妙設(shè)計(jì)非常關(guān)鍵。該實(shí)驗(yàn)在目的基因克隆及候選基因突變位點(diǎn)分析中，為下一步表觀遺傳學(xué)研究埋下了伏筆，即引導(dǎo)學(xué)生發(fā)現(xiàn)基因的DNA序列未發(fā)生改變，而通過基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)基因在突變體中表達(dá)顯著提高，以推測目的基因可能發(fā)生了表觀遺傳變異。同時(shí)，為了培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)、勤思、獨(dú)立創(chuàng)新的科學(xué)研究習(xí)慣，特結(jié)合課程開放實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，設(shè)計(jì)了自主探索性實(shí)驗(yàn)。學(xué)生通過自主探索性實(shí)驗(yàn)，不僅可檢驗(yàn)學(xué)生對(duì)已學(xué)知識(shí)的靈活運(yùn)用能力，且能大大改觀學(xué)生對(duì)科學(xué)研究高不可攀的心理，增強(qiáng)研究的自信。

考慮到實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)數(shù)的限制，本試驗(yàn)方案簡化了圖位克隆實(shí)驗(yàn)，然而在該實(shí)驗(yàn)中有2個(gè)關(guān)鍵知識(shí)點(diǎn)需提醒學(xué)生注意：(1)正確選配親本，構(gòu)建基因定位分離群體。一般來講，除突變體作為親本外，有別于表型遺傳分析時(shí)的親本選擇，構(gòu)建基因定位分離群體需要選擇與突變體遺傳差異大的材料為另一親本，以便定位分析時(shí)有數(shù)量充足、類型多樣的多態(tài)性標(biāo)記供選擇。比如本文中突變體來自粳稻品種“中花11”，那么另一親本選擇了一個(gè)秈稻品種“華粳秈74”；(2)正確選擇基因定位分離群體中表型單株類型，進(jìn)行連鎖分析。對(duì)于典型的隱性突變基因定位而言，選擇分離群體中的突變體表型單株開展連鎖分析即可(可與學(xué)生討論野生型單株不作為連鎖分析的原因，進(jìn)一步提出如果是顯性突變?nèi)绾芜x擇表型單株呢？不完全顯性突變又該作何選擇？)。深刻理解上述2點(diǎn)的前提，就是要求學(xué)生必須深刻理解基因定位(或圖位克隆)的遺傳學(xué)本質(zhì)—分子標(biāo)記(基因型)與表型的連鎖分析。此外，由于DNA甲基化位點(diǎn)鑒定實(shí)驗(yàn)的難度較大且周期偏長，受限于教學(xué)時(shí)數(shù)，本實(shí)驗(yàn)方案僅要求學(xué)生通過已測序列進(jìn)行DNA甲基化位點(diǎn)分析。但為保證研究思路和方法的完整性，需要求學(xué)生了解亞硫酸氫鹽測序法檢測基因組DNA甲基化的基本原理和基本步驟。

多年的實(shí)踐教學(xué)表明，在遺傳學(xué)教學(xué)實(shí)踐中選取典型的遺傳突變材料開展綜合性實(shí)驗(yàn)是學(xué)生深入掌握相關(guān)知識(shí)的有效途徑，也是汲取最新的研究成果積極引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行創(chuàng)新思維，開闊學(xué)生思路的有效途徑。

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Design and exploration of epigenetic comprehensive experiments

Xiangqian Zhang1, Nan Li2, Xinming Xie1

Epigenetics is the necessary content to constitute a complete genetic framework, and has become one of the focuses and difficulties of modern genetics education. Here we design a comprehensive experiment for epigenetics by utilizing a rice() mutant identified previously in our research project. Themutants show a shortened and compressed panicle phenotype, which is associated with hypomethylation in the transcriptional termination region ofgene, causingoverexpression in themutants. This experiment uses mutant phenotypic observation as a starting point, integrates scientific research and course teaching, course experiment and open experiment, and demonstrates to students the full picture of a typical epigenetic science research and leading technology. The comprehensive experiment will deepen students’ understanding of the relationship between phenotypes and genotypes, epigenetic modification and gene expression, and help them master the effective way of thinking for scientific research to further improve their ability of innovative abilities.

epigenetics; comprehensive experiment; experimental teaching; DNA methylation

2021-08-10;

2021-10-10

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：31671594)和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)改革與研究項(xiàng)目(編號(hào)：JG19104, JG20046)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31671594) and Teaching Reform and Research Projects of South China Agricultural University (Nos. JG19104, JG20046)]

張向前，博士，教授，研究方向：植物分子育種。E-mail: aacrav@163.com

10.16288/j.yczz.21-294

2021/10/22 14:57:56

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20211021.1708.002.html

(責(zé)任編委: 陳德富)