周鳴 孫喜營(yíng) 崔文杰 覃美英 耿帥康 張樹(shù)林 田麗

(河南省氣象服務(wù)中心，鄭州，450003)(安陽(yáng)工學(xué)院)

侯曉奎 朱高浦

( 黃河交通學(xué)院) ( 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開(kāi)發(fā)中心)

Toll蛋白首先在果蠅(Drosophilid)中被鑒定，后來(lái)在哺乳動(dòng)物中被命名為T(mén)LRs[1]。在脊椎動(dòng)物研究領(lǐng)域，對(duì)TLRs進(jìn)行了系統(tǒng)的研究[1-15]；隨著脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物基因組學(xué)的發(fā)展，不斷擴(kuò)大了對(duì)TLR成員的功能分析[6，16-19]：這些研究結(jié)果，證明了部分TLRs基因與耐毒素或耐化學(xué)因子密切相關(guān)。在昆蟲(chóng)研究領(lǐng)域，雖然許多研究已經(jīng)證明，昆蟲(chóng)的先天免疫系統(tǒng)能抵抗不同的微生物和殺蟲(chóng)劑[20-23]，但是對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性與昆蟲(chóng)TLRs之間關(guān)系的研究較少。

斜紋夜蛾(SpodopteralituraFabricius)，鱗翅目，夜蛾科，是一種以100多種農(nóng)作物葉片為食的多食性害蟲(chóng)，廣泛分布于亞洲、非洲、北美、大洋洲等島嶼，造成蔬菜、棉花、桃、柑橘、杏等許多重要經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)巨大損失[24-25]。盡管有各種傳統(tǒng)的和較新的殺蟲(chóng)劑被用于控制這種昆蟲(chóng)，但這種昆蟲(chóng)仍然廣泛分布在世界各地，并且已經(jīng)進(jìn)化出對(duì)許多殺蟲(chóng)劑的高抗藥性，包括有機(jī)氯、有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲(chóng)菊酯、阿維菌素、多殺菌素、吲哚甲威等[26-28]。斜紋夜蛾的TLRs及其潛在的功能機(jī)制，到目前為止還沒(méi)有得到全面的解決；利用公布的斜紋夜蛾全基因組，可對(duì)TLRs基因家族的成員分類(lèi)[29]、分子進(jìn)化及農(nóng)藥對(duì)TLRs基因表達(dá)的影響進(jìn)行系統(tǒng)分析。為此，本研究利用斜紋夜蛾基因組，分析出TLRs基因家族；應(yīng)用生物信息學(xué)工具，分析斜紋夜蛾TLRs家族基因成員在鱗翅目害蟲(chóng)TLRs基因家族中的進(jìn)化關(guān)系、組織表達(dá)特異性；分析TLRs基因?qū)r(nóng)藥抗藥性特征及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；旨在為了解斜紋夜蛾抗藥性提供參考。

1 材料和方法

1.1 斜紋夜蛾TLR基因家族成員的分析方法

首先分別從蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)(Pfam)下載富含亮氨酸重復(fù)序列和Toll樣受體(TLR)結(jié)構(gòu)域的HMM文件、從美國(guó)生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載斜紋夜蛾的基因蛋白序列，然后利用hmmsearch(3.2.1)程序分析包含LRR-TIR結(jié)構(gòu)域的候選基因(E≤10-5)，利用蛋白質(zhì)功能(Interpro)數(shù)據(jù)庫(kù)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(SMART)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選基因進(jìn)行驗(yàn)證，包含LRR-TIR域的為斜紋夜蛾TLR基因家族成員。用同樣的方法，分別分析鱗翅目昆蟲(chóng)(野桑蠶(Bombyxmandarina)、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)、桑蠶(Bombyxmori)、吊絲蟲(chóng)(Plutellaxylostella))的TLR基因家族成員。

1.2 斜紋夜蛾TLR蛋白序列特征和基因結(jié)構(gòu)測(cè)序的方法

利用預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)在線工具(ProtParam)，預(yù)測(cè)谷子所有TLR基因家族成員蛋白的理化特性，并利用亞細(xì)胞定位分析網(wǎng)站(http://cello.life.nctu.edu.tw)預(yù)測(cè)TLR基因家族成員蛋白的亞細(xì)胞定位情況。依據(jù)每個(gè)TLR基因編碼序列和相應(yīng)的基因組序列，在線基因結(jié)構(gòu)分析網(wǎng)站(http://gsds.gao-lab.org)分析基因結(jié)構(gòu)。

1.3 斜紋夜蛾TLR氨基酸序列多重比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、保守結(jié)構(gòu)域測(cè)序的方法

使用分子生物學(xué)軟件(DnaMan)對(duì)51個(gè)TLR氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。在貝葉斯(MrBayes)中，采用JTT+I+G+F模式實(shí)現(xiàn)的貝葉斯推理構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[30]；進(jìn)化樹(shù)通過(guò)在線工具(https://www.evolgenius.info/evolview)[31]進(jìn)行展示。TLR基因家族中的保守基序由在線工具(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)分析[32]。

1.4 斜紋夜蛾轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法

啟動(dòng)子數(shù)據(jù)分析將所有TLR上游約2 kb側(cè)翼序列作為啟動(dòng)子區(qū)域，然后利用在線生物信息學(xué)分析平臺(tái)中的工具(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)，針對(duì)選取的啟動(dòng)子區(qū)域，進(jìn)行昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(順式調(diào)控元件)預(yù)測(cè)。選擇模式為生物黑腹果蠅，其它參數(shù)取軟件默認(rèn)(E<10-5)，分析相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)型。

1.5 斜紋夜蛾TLR基因家族成員表達(dá)量測(cè)定方法

斜紋夜蛾蟲(chóng)源，在(26±1)℃、70%相對(duì)濕度、16∶8(L∶D)光照周期、不接觸殺蟲(chóng)劑的條件，人工飼養(yǎng)多代后，分別收集：卵，2齡、3齡、4齡、5齡、6齡幼蟲(chóng)的中腸，5齡幼蟲(chóng)的頭部。按總RNA抽提試劑(Trizol)提取RNA試劑盒提取RNA。應(yīng)用Tian et al.[33]公布的不同時(shí)間階段農(nóng)藥對(duì)斜紋夜蛾影響的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析這些基因在農(nóng)藥脅迫下的表達(dá)量，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)驗(yàn)證。具體引物見(jiàn)表1。

表1 斜紋夜蛾TLR基因?qū)崟r(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物

1.6 斜紋夜蛾基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法

應(yīng)用Tian et al.[33]公布的不同時(shí)間階段農(nóng)藥對(duì)斜紋夜蛾影響的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析在48 h所有差異基因的共表達(dá)相關(guān)性(r>0.9，P<0.01)，分別分析7個(gè)斜紋夜蛾TLR基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，然后使用網(wǎng)絡(luò)可視化和分析軟件(Cytoscape)構(gòu)建了可視網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)這些網(wǎng)絡(luò)基因進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜紋夜蛾TLR基因的特征分析

利用蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)中LRR結(jié)構(gòu)區(qū)域(PF00560)和TIR結(jié)構(gòu)域(PF01582)的HMM文件，本地檢索斜紋夜蛾TLR基因，所有候選基因在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和蛋白家族數(shù)據(jù)庫(kù)中確認(rèn)，共有8個(gè)含LRR-TIR結(jié)構(gòu)域且非冗余的蛋白，在斜紋夜蛾基因組中被發(fā)現(xiàn)。然后，利用這8個(gè)蛋白序列，在美國(guó)生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索它們相應(yīng)TLR基因，發(fā)現(xiàn)XP_022831841.1、XP_022831833.1實(shí)際上是LOC111360192基因的2個(gè)部分。因此，最終鑒定出7個(gè)SLTLR基因在斜紋夜蛾的基因組中(見(jiàn)表2)。這7個(gè)TLR的mRNA長(zhǎng)度為2 772～4 745 bp，開(kāi)放閱讀框的范圍從2 561(SLTLR3)～4 132 bp(SLTLR8)。斜紋夜蛾TLR蛋白范圍從853個(gè)氨基酸(SLTLR3)到1 294個(gè)氨基酸(SLTLR5)，亞細(xì)胞位置預(yù)測(cè)表明，所有斜紋夜蛾TLR基因位于質(zhì)膜上。利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)斜紋夜蛾TLR基因結(jié)構(gòu)域的示意圖(見(jiàn)圖1)，發(fā)現(xiàn)不同的斜紋夜蛾TLR基因之間，結(jié)構(gòu)域存在顯著的差異，范圍從4到28。

表2 斜紋夜蛾TLR基因特征

紅色表示信號(hào)肽；灰色表示非特異性域；綠色框顯示保守的LRR結(jié)構(gòu)域和TIR區(qū)域；數(shù)字代表構(gòu)成信號(hào)肽的氨基酸位置和保守的結(jié)構(gòu)域。

2.2 斜紋夜蛾TLR基因的系統(tǒng)發(fā)育

為了檢測(cè)SLTLR基因的進(jìn)化關(guān)系，首先采用分析斜紋夜蛾TLR基因的方法，分析其他5種鱗翅目昆蟲(chóng)(野桑蠶、亞洲玉米螟、棉鈴蟲(chóng)、桑蠶、吊絲蟲(chóng))的TLR基因蛋白，分別為17、12、10、10、8個(gè)基因蛋白；然后，利用系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建軟件(MEGA)10.0構(gòu)建這6種鱗翅目昆蟲(chóng)TLR基因進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果，所有的TLR基因劃分為5個(gè)類(lèi)群，其中第二類(lèi)群包含TLR基因最多(見(jiàn)圖2)。結(jié)果表明，不同類(lèi)群中，TLR基因中的成員在基因功能上有所不同。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果：發(fā)現(xiàn)1對(duì)直系同源蛋白XP_022831841.1、XP_022831833.1，該結(jié)果的這兩個(gè)蛋白主要是來(lái)自同一個(gè)基因；發(fā)現(xiàn)5對(duì)旁系同源基因，分別是：SLTR7和CBTLR5，SLTR7和CBTLR6，SLTR6和CBTLR3，SLTR5和CBTLR4，SLTR3和CBTLR7，這些旁系同源基因都是棉鈴蟲(chóng)CBTLR。由于直系同源基因通常展現(xiàn)不同的功能，而旁系同源保留相同的功能[34-35]，所以研究斜紋夜蛾TLR基因?qū)⒂兄趯?duì)棉鈴蟲(chóng)CBTLR基因的了解。

圖2 斜紋夜蛾TLR基因和其他鱗翅目昆蟲(chóng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 斜紋夜蛾TLR基因的順式作用元件

由于基因表達(dá)受啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子與位于上游區(qū)域的順式作用元件的結(jié)合調(diào)控，因此順式作用元件分析對(duì)于理解基因調(diào)控和功能很重要[34]。為了獲得斜紋夜蛾TLR基因家族的順式作用元件的信息，分析了每個(gè)TLR基因的啟動(dòng)子區(qū)域序列(基因上游2 000 bp序列)，共分析出6個(gè)基因的順式作用元件，共包含13種類(lèi)型的順式作用調(diào)控元件(見(jiàn)表3)。這些順式作用元件共有6種功能，其中順式作用元件brk和opa對(duì)斜紋夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響[36-37]，Su(H)與昆蟲(chóng)的免疫相關(guān)[38]。

表3 鑒定的斜紋夜蛾TLR基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件

2.4 斜紋夜蛾TLR基因不同組織表達(dá)和農(nóng)藥處理后的特異性分析

基因組織特異性表達(dá)模式對(duì)動(dòng)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要，并且可為該基因生物學(xué)功能的研究提供線索。為了初步檢測(cè)SLTLR基因家族成員的組織特異性表達(dá)，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析了SLTLR在2～6齡幼蟲(chóng)的腸道及頭部中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)7個(gè)SLTLR基因有不同的表達(dá)模式(見(jiàn)表4)。基因LOC111357546在頭部中表達(dá)量最大；基因LOC11135336在卵中表現(xiàn)最高；除了基因LOC111356336以外，所有的SLTLR基因在斜紋夜蛾的腸道中都表達(dá)，特別是基因LOC111354111在腸道中高度表達(dá)，該結(jié)果表明這些基因在腸道中對(duì)抗病原體發(fā)揮更普遍的作用。由于大部分SLTLR基因在中腸中表達(dá)，為了研究農(nóng)藥對(duì)SLTLR基因表達(dá)的影響，本研究分析了斜紋夜蛾在喂食農(nóng)藥后中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的SLTLR基因表達(dá)?；虮磉_(dá)的熱圖表明，具有相似表達(dá)水平的基因聚集在一起(見(jiàn)圖3)，除基因LOC111354111以外，其他的6個(gè)基因與對(duì)照相比，在48、72 h時(shí)間點(diǎn)上顯著上調(diào)。用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證這些基因在農(nóng)藥處理后的表達(dá)特征(見(jiàn)表5)，發(fā)現(xiàn)除了LOC111354111、LOC111356336與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不一致外，其他基因的趨勢(shì)完全一致，說(shuō)明農(nóng)藥處理影響了基因的表達(dá)特征。

表4 斜紋夜蛾TLR基因家族的組織特異性表達(dá)

表5 農(nóng)藥處理時(shí)間不同時(shí)斜紋夜蛾SLTLR基因相對(duì)表達(dá)量

CK為沒(méi)有農(nóng)藥處理(對(duì)照)；T為經(jīng)農(nóng)藥處理。

2.5 農(nóng)藥對(duì)斜紋夜蛾影響的TLR基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

共表達(dá)的基因，在不同樣本的轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)相似的增加或減少趨勢(shì)[39]；基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，可推斷共表達(dá)基因功能(或途徑)的相關(guān)性[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥脅迫48 h對(duì)5個(gè)SLTLR基因表達(dá)有顯著影響；利用前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析農(nóng)藥處理48 h后的差異基因，并構(gòu)建這些基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)閾值(r>0.9，P<0.01)篩選，只發(fā)現(xiàn)1個(gè)LOC111357546和其他30個(gè)基因之間存在共表達(dá)關(guān)系(見(jiàn)圖4)。對(duì)這些基因進(jìn)行基因本體論富集(見(jiàn)表6)分析，發(fā)現(xiàn)主要富集在5個(gè)生物學(xué)過(guò)程，分別是細(xì)胞表面受體信號(hào)途徑、細(xì)胞定位、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞過(guò)程調(diào)控、生物過(guò)程調(diào)控，該結(jié)果說(shuō)明SLTLR(LOC111357546)通過(guò)與共表達(dá)基因相互作用，參與這些生物學(xué)過(guò)程，對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性。

圖4 LOC111357546與其他30個(gè)基因之間的共表達(dá)關(guān)聯(lián)性

表6 LOC111357546基因共表達(dá)基因富集

3 討論

先天免疫是多數(shù)動(dòng)物的第一道防線，而TLR基因是動(dòng)物該免疫的關(guān)鍵組成部分，從線蟲(chóng)到靈長(zhǎng)類(lèi)的物種中都發(fā)現(xiàn)了這些基因[41]。已有研究者在許多動(dòng)物全基因組方面對(duì)TLR基因家族成員進(jìn)行了研究[6，16，40，42-43]，包括鱸魚(yú)(Lateolabraxmaculatus)、鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、果蠅(Drosophilid)、非洲野犬(Lycaonpictus)。而在世界上分布廣泛的常見(jiàn)鱗翅目昆蟲(chóng)，也擁有強(qiáng)大而有效的先天免疫系統(tǒng)，但在全基因組范圍內(nèi)系統(tǒng)地鑒定這些TLR基因還不系統(tǒng)。本研究鑒定了7個(gè)斜紋夜蛾TLR基因家族成員，并對(duì)其他5種鱗翅目昆蟲(chóng)的TLR基因進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)與斜紋夜蛾相似，鱗翅目昆蟲(chóng)TLR的數(shù)量為4～11。本研究對(duì)6種鱗翅目昆蟲(chóng)研究結(jié)果表明，隨著物種進(jìn)化程度越高，物種的TLR總數(shù)逐漸增加，例如，在線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)、海綿蟲(chóng)(Amphimedonqueenslandica)中僅鑒定出1個(gè)TLR基因，而和斑馬魚(yú)(Daniorerio)、小白鼠(Musmusculus)鑒定了10個(gè)TLR基因，說(shuō)明TLRs隨著物種的進(jìn)化逐漸增加，從而增強(qiáng)動(dòng)物的抗脅迫能力。

本研究進(jìn)行了生物信息學(xué)和分子分析，包括蛋白質(zhì)特征和功能域預(yù)測(cè)、對(duì)系統(tǒng)發(fā)育分析、斜紋夜蛾TLR基因與其他動(dòng)物TLR異同。對(duì)這些TLR的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有的TLR基因與哺育動(dòng)物的TLRs相似，都位于脂膜上[16]；所有的基因都有1個(gè)TIR，但是LRR結(jié)構(gòu)域在數(shù)量和位置上有明顯的差異，該發(fā)現(xiàn)與其他動(dòng)物的TLRs基因結(jié)構(gòu)相似，說(shuō)明所有TLR基因成員中的TIR結(jié)構(gòu)域高度保守[42-43]。本研究對(duì)系統(tǒng)發(fā)育分析表明，鱗翅目TLR基因總共分為6個(gè)類(lèi)群，每個(gè)斜紋夜蛾的TLR基因與其他物種的直系同源基因一起進(jìn)入各自的進(jìn)化枝(見(jiàn)圖2)，說(shuō)明鱗翅目昆蟲(chóng)的TLR基因高度保守。對(duì)昆蟲(chóng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)研究表明，斜紋夜蛾的TLR基因與棉鈴蟲(chóng)的TLR基因旁系同源，說(shuō)明研究斜紋夜蛾TLR基因有助于對(duì)棉鈴蟲(chóng)CBTLR基因的了解。

為了評(píng)估斜紋夜蛾的TLR基因生物學(xué)作用，檢測(cè)斜紋夜蛾健康組織中TLR基因的表達(dá)模式，在檢測(cè)結(jié)果中只有TLR基因(LOC111356336)在卵和頭部組織中表達(dá)，說(shuō)明斜紋夜蛾的TLR基因有獨(dú)特的組織特異性表達(dá)模式；而其他TLR基因在所有不同齡期幼蟲(chóng)腸道組織中廣泛表達(dá)，說(shuō)明TLR在宿主免疫應(yīng)答活動(dòng)中起關(guān)鍵作用。因此，本研究對(duì)斜紋夜蛾實(shí)施農(nóng)藥脅迫處理，用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析腸道中TLR基因的表達(dá)模式。雖然各個(gè)成員呈現(xiàn)不同的表達(dá)特征，但是農(nóng)藥脅迫處理對(duì)其中5個(gè)SLTLR基因表達(dá)有顯著影響，特別是農(nóng)藥處理在48 h時(shí)基因表達(dá)達(dá)到最高，SLTLR(LOC111357546)對(duì)農(nóng)藥的處理反應(yīng)較強(qiáng)，通過(guò)共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)許多潛在的基因與之相關(guān)聯(lián)，這些潛在的基因已有研究報(bào)道[44-46]。本研究結(jié)果表明，農(nóng)藥對(duì)5個(gè)TLRs基因表達(dá)有顯著影響，說(shuō)明這些基因與斜紋夜蛾的抗藥性有關(guān)；其中的1個(gè)基因LOC111357546通過(guò)與共表達(dá)基因相互作用，參與這些生物學(xué)過(guò)程，對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性。