付彥榮 劉鳳欒 李碩 田代科 董麗

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083)(上海辰山植物園)(北京林業(yè)大學(xué))

蓮隸屬蓮科(Nymphaeaceae)蓮屬(NelumboAdans.)，是重要的水生植物之一，具有觀賞、文化、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)等多種價(jià)值，具有極強(qiáng)的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。蓮屬僅有亞洲蓮(N.nuciferaGaertn.)、美洲蓮(N.luteaWilld.)2個(gè)種。其中，亞洲蓮的花為粉紅或白色，主要分布于亞洲和澳大利亞北部；而美洲蓮的花為淡黃色，主要分布于北美洲、中美洲[1-2]。蓮屬擁有豐富的種質(zhì)資源，除了一批古老品種和人工培育而成的數(shù)百個(gè)栽培品種[2]，還包括通過亞美雜交蓮品種。此外，還有一些古代蓮、野生蓮，廣泛分布于中國、日本、越南、印度、澳大利亞、美國等[3]，是蓮遺傳信息的重要載體。

野生種質(zhì)是物種遺傳多樣性的重要源泉和新品種培育的重要基礎(chǔ)。然而，因自然災(zāi)害、人為干擾破壞等原因，中國的野生蓮資源和居群正不斷減少，部分面臨消失的風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。掌握野生蓮的生存現(xiàn)狀，深入探究其遺傳多樣性和親緣關(guān)系，是進(jìn)行科學(xué)保護(hù)和合理利用的前提。針對(duì)黑龍江的野生蓮、長(zhǎng)江流域的野生蓮、泰國野生蓮、美洲蓮野生資源的遺傳多樣性已開展了相關(guān)研究[6-12]，但白洋淀和微山湖作為中國北方地區(qū)的2個(gè)重要的野生蓮居群，盡管其少數(shù)個(gè)體常被作為研究樣本開展多樣性研究[13-15]，但其居群的遺傳多樣性以及演化地位尚缺乏系統(tǒng)而深入的了解。

蓮基因組測(cè)序已經(jīng)完成[16]，但利用全基因組重測(cè)序技術(shù)開展蓮的群體遺傳學(xué)研究較少。簡(jiǎn)化基因組是根據(jù)二代測(cè)序發(fā)展的，它通過特定手段獲得部分基因組的序列信息。其中，應(yīng)用較為廣泛的有限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA測(cè)序技術(shù)(RAD-seq)、利用酶切技術(shù)降低基因組的復(fù)雜度、對(duì)酶切產(chǎn)生的限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA標(biāo)記(RAD-tag)進(jìn)行高通量測(cè)序，能夠開發(fā)大量的單核苷酸多態(tài)性(SNP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記，從而具有成本低、準(zhǔn)確率高、不受參考基因組序列限制等優(yōu)點(diǎn)[17]。限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于煙草[18]、靈寶杜鵑[19]、鵝掌楸[20]、苦草[21]等多種觀賞植物的遺傳多樣性研究，并取得了良好效果。本研究采用限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)白洋淀和微山湖居群野生蓮進(jìn)行測(cè)序，通過遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，明確其遺傳背景，為野生蓮資源保護(hù)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集與保存

采集蓮樣本共127份(見表1)，包含白洋淀野生蓮居群樣本60份、微山湖野生蓮居群樣本45份。具體采樣方法：首先，從居群不同方位選取相互距離大于500 m的采樣點(diǎn)，白洋淀居群選取12個(gè)、微山湖居群選取9個(gè)；然后，在每個(gè)采樣點(diǎn)內(nèi)按間隔距離5 m以上采集15個(gè)樣本葉片，從中隨機(jī)選取5片進(jìn)行測(cè)序。對(duì)照樣本共22份，其中：黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙、湖南、四川野生蓮樣本6份，古代蓮樣本4份，蓮栽培品種樣本5份，泰國、印度、越南、澳大利亞的野生蓮樣本5份，美洲蓮、亞美雜交蓮樣本各1份。生長(zhǎng)季采集新鮮葉片，使用硅膠干燥后，室溫保存。

表1 供試蓮樣本信息

續(xù)(表1)

1.2 蓮樣本的DNA提取與測(cè)序

采用十六烷基三甲基溴化銨法提取蓮樣本葉片的基因組DNA，每個(gè)樣本取500 ng的DNA用于酶切、后序分析測(cè)定。使用HindⅢ+BfaⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，切膠回收220～450 bp的片段，將酶切后的DNA片段調(diào)整濃度后上機(jī)測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為因美納2 500高通量測(cè)序儀(Illumina HiSeq 2500；雙端測(cè)序，2×150 bp)。DNA的提取、酶切、測(cè)序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.3 蓮樣本的序列比對(duì)

采用序列比對(duì)軟件(BWA Version：0.7.12-r1039)[22]aln程序，分別將經(jīng)過過濾后的讀出序列數(shù)據(jù)映射至參考基因組序列中，比對(duì)的參數(shù)均按照BWA最大精確比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)，產(chǎn)生sam文件。利用皮卡德(Picard 1.107)軟件將比對(duì)得到的sam文件排序。采用皮卡德軟件包中的“標(biāo)記重復(fù)”命令去除重復(fù)序列。如果多個(gè)雙端測(cè)序讀長(zhǎng)比對(duì)后具有相同的染色體坐標(biāo)，則僅保留分值最高的雙端測(cè)序讀長(zhǎng)。

1.4 蓮樣本單核苷酸多態(tài)性和檢測(cè)

采用生物信息變異檢測(cè)工具(GATK v3.8)軟件包[23]進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)。對(duì)已知的插入和缺失信息進(jìn)行局部重新比對(duì)，檢測(cè)插入和缺失附近序列比對(duì)結(jié)果可靠性。采用一體式基因型檢測(cè)程序獲得樣本所有突變位點(diǎn)；利用選擇變異檢測(cè)程序獲取單核苷酸多態(tài)性突變信息。

1.5 蓮樣本遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析方法

采用序列多態(tài)性識(shí)別工具(Stacks)程序包中的群體命令進(jìn)行群體遺傳多樣性分析，計(jì)算群體分化指數(shù)。采用分子進(jìn)化遺傳分析軟件(MEGA 7.0)中的鄰接法(NJ)算法[24]，分析蓮樣本的遺傳關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用遺傳結(jié)構(gòu)分析工具軟件(Structure)利用單核苷酸多態(tài)性信息分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)，設(shè)置K=2～10(即假設(shè)存在2～10個(gè)祖先群體)，模型選擇混合模型，其余參數(shù)采用軟件的默認(rèn)設(shè)置。從K=2到K=10，分別計(jì)算ΔK值，將最大者視為最佳分群數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮樣本的測(cè)序和單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

116份樣本獲得了有效測(cè)序結(jié)果，包括白洋淀野生蓮樣本48份、微山湖野生蓮樣本36份、對(duì)照樣本22份。從116份樣本中，共得到961 398 496條讀出序列、總堿基數(shù)據(jù)量為136 968 251 581 bp；經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾后，共得到高質(zhì)量序列919 915 896條、高質(zhì)量堿基數(shù)據(jù)128 055 038 010 bp。經(jīng)與參考基因組比對(duì)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性，共得到535 269個(gè)單核苷酸多態(tài)性。

微山湖野生蓮居群的讀出序列數(shù)、總堿基數(shù)據(jù)量、模糊堿基所占百分比(N)、鳥嘌呤和胞嘧啶(GC)堿基占比、堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99%以上的堿基占比、堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基占比，在3個(gè)樣本組中均為最高，其次為對(duì)照組，白洋淀野生蓮居群的數(shù)值最低。

2.2 蓮樣本遺傳分化分析

白洋淀居群和微山湖居群蓮樣本整體的遺傳分化指數(shù)為0.034 501 3；白洋淀居群和微山湖居群兩樣本組與對(duì)照樣本組的遺傳分化指數(shù)，分別為0.096 258 7、0.103 927 0，均高于兩居群間的遺傳分化指數(shù)值。表明2個(gè)居群間整體上的遺傳分化很小，而它們各自與對(duì)照組間的遺傳分化較大。

2.3 蓮樣本系統(tǒng)發(fā)育樹分析

116份蓮樣本的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)包含10個(gè)分支，分別為：美洲蓮(No.64)和亞美雜交蓮‘Perry’s Giant Sunburst’(No.65)為1個(gè)分支；‘建選17’(No.66)和越南蓮(No.82)為1個(gè)分支；3個(gè)蓮栽培品種‘單灑錦’(No.74)、‘千瓣’(No.75)、‘中山紅臺(tái)’(No.76)各單獨(dú)為1個(gè)分支；白洋淀樣本(No.59)、白洋淀樣本(No.60)各單獨(dú)為1個(gè)分支；白洋淀樣本(No.56～58)和‘鄂蓮1號(hào)’(No.67)為1個(gè)分支；微山湖樣本(No.113～117)為1個(gè)分支；剩余98個(gè)樣本組成1個(gè)‘傘形’分支(見圖1b)。

白洋淀樣本(No.56～60)與對(duì)照藕蓮品種‘鄂蓮1號(hào)’(No.67)，表明此采樣點(diǎn)是人為引種藕蓮品種的栽培區(qū)或者附近存在藕蓮品種栽培，受到外界遺傳干擾。微山湖樣本(No.113～117)分支，出現(xiàn)在大部分微山湖樣本和蓮栽培品種間(見圖1)，說明此采樣點(diǎn)受到了外界干擾或者內(nèi)部發(fā)生了基因分化。在98個(gè)樣本組成的‘傘形’分支中，包含了多數(shù)白洋淀樣本和微山湖樣本。黑龍江(No.69)、吉林(No.70)、遼寧(No.71)、內(nèi)蒙古(No.68)的野生蓮，普蘭店古(No.61)、開封古(No.63)、濟(jì)寧古(No.62)3個(gè)古代蓮，日本大賀蓮(No.77)，8個(gè)高緯度對(duì)照樣本散布于白洋淀和微山湖居群樣本之中；而四川(No.72)、湖南(No.73)野生蓮樣本，泰國蓮(No.78～79)、印度蓮(No.80)、澳大利亞蓮(No.81)蓮樣本，6個(gè)低緯度對(duì)照樣本單獨(dú)組成1個(gè)小分支(見圖1)。白洋淀和微山湖居群的多數(shù)樣本與所有14個(gè)野生蓮和古代蓮樣本(除了美洲蓮(No.64)、越南蓮(No.82)之外)組成1個(gè)‘傘形’分支，表明2個(gè)居群多數(shù)樣本的遺傳背景較為一致，且比較原始。

表2 蓮樣本測(cè)序結(jié)果

2.4 蓮樣本群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

依據(jù)有效單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分析蓮樣本的群體結(jié)構(gòu)。當(dāng)K=6時(shí)，ΔK達(dá)最大值，達(dá)到拐點(diǎn)，即所有蓮樣本有6種不同遺傳來源，不同樣本中各來源比例不同(見圖2)。遺傳分化主要發(fā)生在對(duì)照樣本之間。白洋淀和微山湖2個(gè)野生蓮居群各自有1個(gè)樣點(diǎn)(No.56～60、No.113～117)呈現(xiàn)不同外，其他樣本同為一種遺傳結(jié)構(gòu)，遺傳來源高度一致。且此遺傳結(jié)構(gòu)與4個(gè)古代蓮(No.61～63、No.77)和6個(gè)中國其他地區(qū)野生蓮(No.68～73)一致，說明白洋淀和微山湖主體居群的遺傳背景較為原始。白洋淀(No.56～60)和微山湖(No.113～117)的2個(gè)樣點(diǎn)例外，其遺傳結(jié)構(gòu)與藕蓮品種(No.67)相似，表明受到人工引種藕蓮栽培的干擾。從花朵性狀看，2個(gè)樣點(diǎn)均為白花，與同居群大多數(shù)樣本的花色存在差異。此外，白洋淀樣本(No.37、No.40)和微山湖樣本(No.88、No.90～92)，都含有藕蓮品種(No.67)和栽培品種(No.74～76)的低度基因滲入?？傮w而言，蓮樣本的遺傳結(jié)構(gòu)與其系統(tǒng)發(fā)育樹分類十分吻合，兩者相互進(jìn)行了驗(yàn)證。

3 討論與結(jié)論

本研究利用限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA測(cè)序技術(shù)，在蓮屬全基因組水平上開發(fā)出大規(guī)模單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，檢測(cè)得到535 269個(gè)有效單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記。所有樣本的Q20和Q30比例分別為98.42%、95.70%，表明測(cè)序結(jié)果質(zhì)量較高。利用這些有效單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，分析了白洋淀和微山湖2個(gè)野生蓮居群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，初步掌握了2個(gè)居群的遺傳背景和內(nèi)部分化狀況，為制定保護(hù)策略等提供了參考。

3.1 白洋淀和微山湖野生蓮居群的遺傳分化

遺傳分化指數(shù)(Fst)反映群體結(jié)構(gòu)的變化，突變、遺傳漂變、自然選擇等作用，都會(huì)對(duì)其值產(chǎn)生影響。當(dāng)Fst>0.25時(shí)，表明群體間的遺傳分化很大；0.15

a和b為系統(tǒng)發(fā)育樹的兩種表現(xiàn)形式；湖藍(lán)色分支部分，為98個(gè)樣本組成的‘傘形’分支。

①每種顏色代表1個(gè)遺傳來源。②白洋淀和微山湖野生蓮居群多數(shù)樣本遺傳來源一致，樣點(diǎn)(No.56～60、No.113～117)遺傳結(jié)構(gòu)與藕蓮品種(No.67)類似，樣本(No.37、No.40、No.88、No.90～92)等也有低度基因滲入。③白洋淀和微山湖野生蓮居群多數(shù)樣本的遺傳結(jié)構(gòu)，與古代蓮樣本(No.61～63、No.77)、中國其他地區(qū)野生蓮樣本(No.68～73)一致。

3.2 白洋淀和微山湖野生蓮居群的系統(tǒng)發(fā)育

從系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)可知，白洋淀和微山湖野生蓮居群的多數(shù)樣本共同聚為1個(gè)傘狀分支，在分支內(nèi)彼此并列存在，未呈現(xiàn)明顯的遺傳差別和先后進(jìn)化關(guān)系。在此傘狀分支中，來自黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古等地的野生蓮對(duì)照樣本，以及4個(gè)古代蓮對(duì)照樣本，均散布其中。這表明，中國北方野生蓮之間的親緣關(guān)系較為接近[14]，也印證了野生蓮由古代蓮進(jìn)化而來的推測(cè)[2]。尤其是微山湖居群的樣點(diǎn)(No.118～122)，分別與普蘭店古(No.61)、開封古(No.63)2個(gè)古代蓮聚為2個(gè)小分支，表明此樣點(diǎn)的樣本比較原始；與之相似，白洋淀居群內(nèi)的樣本(No.5)與濟(jì)寧古(No.62)也形成1個(gè)小分支。這些樣點(diǎn)資源應(yīng)予重點(diǎn)關(guān)注和保護(hù)。來自湖南和四川的2個(gè)南方野生蓮對(duì)照，盡管也位于傘狀分支中，卻與泰國蓮(No.78～79)、印度蓮(No.80)、澳大利亞蓮(No.81)等樣本聚為1個(gè)小分支，表明它們之間的遺傳關(guān)系更為接近，而與中國北方野生蓮產(chǎn)生一定分化。

在游離于白洋淀居群和微山湖居群主體之外的樣本中，白洋淀居群的樣本(No.56～60)與藕蓮品種‘鄂蓮1號(hào)’(No.67)聚在一起，并與栽培品種‘中山紅臺(tái)’(No.76)、‘千瓣’(No.75)、‘單灑錦’(No.74)相鄰，結(jié)合花的形態(tài)特征，認(rèn)為此樣點(diǎn)是人工種植的藕蓮品種。與此相似，微山湖居群的樣點(diǎn)(No.113～117)單獨(dú)聚為一支，且與黑龍江野生蓮(No.69)、白洋淀居群樣點(diǎn)(No.56～60)與‘鄂蓮1號(hào)’(No.67)組成的分支接近，由此判斷它們的來源同樣與人工種植的藕蓮品種有關(guān)。

3.3 白洋淀和微山湖野生蓮居群的群體遺傳結(jié)構(gòu)

白洋淀野生蓮樣本與微山湖野生蓮樣本的遺傳背景總體一致(見圖2)，并與古代蓮樣本，以及黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、湖南、四川6個(gè)野生蓮樣本相同，該結(jié)果與由系統(tǒng)發(fā)育樹揭示的結(jié)果相統(tǒng)一。這進(jìn)一步確定了白洋淀和微山湖野生蓮居群的遺傳背景總體上較為一致，且較為原始。

白洋淀和微山湖2個(gè)野生蓮居群，均有外來遺傳基因混入的現(xiàn)象。白洋淀野生蓮居群的樣本(No.56～60)和微山湖野生蓮居群樣本(No.113～117)均有明顯的基因滲入，其遺傳背景與藕蓮品種‘鄂蓮1號(hào)’非常相似?，F(xiàn)場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這些樣本的花色均為白花，與各居群內(nèi)大多數(shù)樣本的紅花不同，由此判斷它們是人工引種的藕蓮品種，至少含有栽培品種的遺傳成分?？梢?，加強(qiáng)野生蓮生境和周邊環(huán)境保護(hù)，限制人為干擾，對(duì)保護(hù)野生蓮種質(zhì)特有遺傳信息非常必要。

致謝：感謝北京植物園張會(huì)金先生和吳倩女士、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院李孝尊先生、遼寧職業(yè)學(xué)院王日新先生、杭州市水生植物學(xué)會(huì)陳煜初先生等協(xié)助采集部分試驗(yàn)材料。