章雷 王改萍 丁延朋 馬悟真

(南京林業(yè)大學(xué),南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京，210000)

銀杏(GinkgobilobaL.)作為我國特有的孑遺樹種，其葉果不僅具有藥用價(jià)值和食用價(jià)值，而且獨(dú)特的葉形具有很高觀賞價(jià)值[1]。雜交金葉銀杏作為芽變品系，已于2014年4月被湖北省林木品種審定委員會命名為“安陸金葉銀杏”[2]。近年來，關(guān)于金葉銀杏開展了各項(xiàng)研究，如其光合特性[3]、葉色變化[4]、扦插繁殖[5]、嫁接繁殖[6]等。由于金葉銀杏沒有雄株，目前大都是以無性繁殖的苗木作為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)，無性繁殖的苗木存在葉色性狀不穩(wěn)定，黃綠隔年交替，樹形彎曲，不優(yōu)美等問題。為了培育樹干通直，株型優(yōu)美，葉色性狀穩(wěn)定的金葉銀杏實(shí)生苗，本試驗(yàn)以金葉銀杏的雜交選育為突破點(diǎn)，對金葉銀杏雜交育種的可行性進(jìn)行探討。

1 試驗(yàn)地概況

授粉試驗(yàn)地位于湖北省安陸市王義鎮(zhèn)(113°10′～113°57′E，31°4′～31°19′N)，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，年平均氣溫15.8 ℃，年平均降水量1 172 mm，年平均無霜期246 d，年平均日照時(shí)長2 172.7 h。該地為淺丘，以黃棕壤土為主。播種試驗(yàn)地位于江蘇省泰興市姚王鎮(zhèn)(119°54′～120°21′E，31°58′～32°23′N)，同屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫14.9 ℃，降水1 027 mm，年平均無霜期220 d，年日照時(shí)長2 125 h。該地屬于長江三角洲沖積平原，土壤質(zhì)地為沙壤土。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

湖北安陸10年生嫁接金葉銀杏；南京林業(yè)大學(xué)二村池塘邊健康優(yōu)質(zhì)雄株(記作“南林1號”)；南京林業(yè)大學(xué)樹木園健康優(yōu)質(zhì)雄株(記作“南林2號”)。

雜交組合：金葉銀杏(♀)×南林1號(♂)為雜交1號；金葉銀杏(♀)×南林2號(♂)為雜交2號；試驗(yàn)以泰興當(dāng)?shù)夭煞N作為參考對照，記作泰興。

2015年4月初，采集南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)兩株雄樹上成熟的雄蕊，室溫晾曬后收集散落的花粉，低溫冷藏法保存[7]。同時(shí)在花粉散落前，對需要開展試驗(yàn)的雌花所在枝條進(jìn)行套袋，并統(tǒng)計(jì)雌花數(shù)量。當(dāng)年4月上旬，于湖北安陸進(jìn)行人工授粉，授粉方式采用混水噴霧法[8]。當(dāng)年6月，待授粉枝條坐果后對其進(jìn)行座果率的統(tǒng)計(jì)(座果率=(果實(shí)數(shù)/雌花數(shù))×100%)。

當(dāng)年9月，采集成熟種子，浸泡，脫去外種皮。隨機(jī)選取100粒種子，利用電子天平稱量種子質(zhì)量(四分法)，3次重復(fù)；利用游標(biāo)卡尺測量種子的長、寬、厚度；種子含水率采用烘干法，130 ℃下烘至恒質(zhì)量，3次重復(fù)。種子含水率=[(種子濕質(zhì)量-種子干質(zhì)量)/種子濕質(zhì)量]×100%。剩下的種子于冷藏室內(nèi)進(jìn)行沙藏，翌年用于萌發(fā)試驗(yàn)及播種試驗(yàn)。

2.2 播種試驗(yàn)

層積催芽期間，每隔1個月取10粒種子，共計(jì)6次，對其胚的發(fā)育進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。種子萌發(fā)試驗(yàn)于翌年2～3月，在實(shí)驗(yàn)室GZP-300C智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，箱內(nèi)溫度為25 ℃，相對濕度約為80%～90%，光量子通量為40 μmol·m-2·s-1，光照周期為16 h光照、8 h黑暗。在沙藏的種子中隨機(jī)各取60粒，分為3組，清水吸脹48 h后置于鋪有河沙的塑料盒中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2～3 d灑1次水。每天觀察統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽情況，直至連續(xù)5 d沒有種子發(fā)芽為止。發(fā)芽率=(發(fā)芽種子數(shù)/播種種子數(shù))×100%。

播種試驗(yàn)于翌年3月22日，在泰興試驗(yàn)地進(jìn)行。播種方式選擇條播，株行距為10 cm×15 cm。待苗木長出進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。根據(jù)苗木葉色分化情況，將葉片分為雜交1號黃葉、雜交1號綠葉、雜交2號黃葉、雜交2號綠葉。

2.3 葉色參數(shù)及色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

葉色參數(shù)測定：葉色參數(shù)采用X-Rite色差儀(TsD010，愛麗舍，美國)進(jìn)行測定，D65光源，測色光斑直徑為8 mm，本試驗(yàn)選擇在銀杏葉色變化關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行了4次測定。測定時(shí)，隨機(jī)選取3株具有代表性的植株，每株隨機(jī)選取葉片3片，分別測定葉片的光澤亮度、紅/綠程度和黃/藍(lán)程度的參數(shù)值。其中：葉片光澤亮度參數(shù)的范圍在0(黑)～100(白)；葉片的紅/綠程度參數(shù)值越小綠色越深，反之紅色越深；葉片的黃/藍(lán)程度參數(shù)值越大黃色越深，反之藍(lán)色越深。

色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定：葉色參數(shù)測定完后，當(dāng)即采下所選植株葉片用于色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定。將葉片剪碎成寬約1 mm的長條，稱取0.1 g，加入提取液(V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1)浸提24 h，葉片完全變白后，用分光光度計(jì)(UVmini-1240型，島津，日本)測定其在440、645、663 nm時(shí)的吸光值。按照下列公式換算成葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素以及類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

式中：A663、A645、A440分別表示提取液在663、645、440 nm時(shí)的吸光值；V表示提取液的體積；W表示葉片的鮮質(zhì)量。

2.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄統(tǒng)計(jì)及相關(guān)圖表的制作；利用SPSS 24.0中的Duncan法進(jìn)行多重比較，利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同品系種子性狀

由表1可知，采集授粉枝條所有果實(shí)，普通銀杏與金葉銀杏的異地授粉座果率很高，雜交1號達(dá)到90.43%。雖然雜交2號有一根授粉枝條壞死，其座果率也能達(dá)到67.11%。兩雜交金葉銀杏種子外形似梅核，廣橢圓形，有明顯棱，無翼。經(jīng)過對比驗(yàn)證，確定其屬于梅核類[9]。

表1 不同品系種子表型性狀

雜交1號和雜交2號金葉銀杏種子含水率顯著低于泰興(P<0.05)，雜交1號和雜交2號金葉銀杏種子含水率差異不顯著。其中雜交1號含水率最低，泰興含水量最高；3個品系種子質(zhì)量存在極顯著差異(P<0.01)。泰興種子的質(zhì)量比雜交1號高89.5%；泰興種子的長、寬、厚分別為27.65、16.46、14.31 mm，均為最大且極顯著高于其他品系(P<0.01)。雜交1號種子的長、寬、厚分別為20.80、13.83、11.88 mm，均小于其他品系，且達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

3.2 不同品系種子活力

銀杏種子作為典型的生理后熟種子，其胚在沙藏時(shí)存在一個繼續(xù)發(fā)育的過程。由表2可知，在9月份，所有種子的胚還尚未發(fā)育，均呈球狀(或不明顯)，未分化出明顯的胚根、胚芽和胚軸；9～10月份是種子胚發(fā)育的快速時(shí)期，胚的長度迅速增長。10月份觀察時(shí)可以明顯看出胚的分化，整個胚呈長柱狀；11月份，雜交金葉銀杏種胚增長緩慢，而泰興種子胚長仍有較大幅度的增長；12月份，所有品系種子胚長基本不再變化；翌年2月份所有種子已達(dá)到完全成熟的狀態(tài)，胚長在4.8～5.6 mm，種子也具備了萌發(fā)的能力。在整個后熟的過程中，3個品系胚的發(fā)育過程基本同步。

表2 不同品系種胚的長度變化

3.3 不同品系種子萌發(fā)和播種試驗(yàn)

由表3可知，3個品系發(fā)芽率之間不存在顯著性差異，且都能達(dá)到80%以上。其中雜交1號發(fā)芽率高于雜交2號。雜交品系種子開始萌發(fā)的時(shí)間都為16 d，比泰興稍晚2 d。

表3 不同品系種子發(fā)芽和播種試驗(yàn)

3個品系種子的出苗率差異不顯著，在55%～60%。其中，出苗率最高的為當(dāng)?shù)仄贩N泰興，雜交1號出苗率高于雜交2號。兩雜交金葉銀杏后代播種黃化率都達(dá)到50%以上，雜交1號黃化率高于雜交2號。

通過物候期觀察，雜交金葉銀杏播種后34 d開始萌發(fā)；過4 d后(4月29日)，幼苗可以長到3 cm左右，且可以看到葉片開始分化展開；5月10日，葉片完全展開，幼苗可以通過光合作用進(jìn)行有機(jī)物質(zhì)的合成；12月初，葉片開始逐漸脫落，其落葉時(shí)間與對照品系基本一致。

3.4 雜交金葉銀杏葉色變化

由表4可知，從6—7月份，所有品系葉片光澤亮度參數(shù)(L*)值都呈下降趨勢；7—8月份，雜交2號黃葉的葉片光澤亮度參數(shù)值有一個上升的過程，而其他4個品系葉片光澤亮度參數(shù)值有一個極其微弱的變化趨勢；整個過程中，黃葉品系的葉片光澤亮度參數(shù)值都要顯著高于綠葉品系(P<0.05)，泰興的葉片光澤亮度參數(shù)值顯著低于其他4個品系(P<0.05)；黃葉品系6月初葉片全黃的葉片光澤亮度參數(shù)值高于8月份葉片全綠，說明雜交金葉銀杏葉片黃葉亮度要高于綠葉。

表4 不同品系葉片光澤亮度參數(shù)值的動態(tài)變化

從表5中可以看出，所有品系葉片紅/綠程度參數(shù)(a*)值都隨著時(shí)間變化逐漸降低，即葉片綠色程度在不斷加深；整個過程中，葉片黃色品系的紅/綠程度參數(shù)值都要顯著高于(P<0.05)其他綠色品系；黃色兩個品系的葉片紅/綠程度參數(shù)值變化主要發(fā)生在6—7月，且在6月中旬至7月初有一個顯著的降低過程，說明這段時(shí)間是葉色轉(zhuǎn)綠的關(guān)鍵時(shí)期。

表5 不同品系紅/綠的程度參數(shù)值的動態(tài)變化

由表6可知，葉片黃/藍(lán)程度參數(shù)(b*)值的變化趨勢和葉片紅/綠程度參數(shù)值相同，一直呈下降趨勢，即葉片黃色程度越來越低；整個過程，黃葉品系的葉片黃/藍(lán)程度參數(shù)值都顯著高于(P<0.05)綠葉品系，黃葉品系的葉片黃/藍(lán)程度參數(shù)值主要下降時(shí)期也與葉片紅/綠程度參數(shù)值同步；在6—7月份，綠葉品系的葉片黃/藍(lán)程度參數(shù)值隨時(shí)間的變化比較均勻，且無黃葉品系變化顯著。

表6 不同品系葉片黃/藍(lán)程度參數(shù)值動態(tài)變化

3.5 雜交金葉銀杏的葉色素變化

由表7～10可知，無論葉綠素還是類胡蘿卜素，黃葉品系與綠葉品系動態(tài)變化都存在明顯的差異性。黃葉品系葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一直處于上升趨勢，8月份葉片全綠時(shí)，相對于6月份全黃階段，黃1和黃2品系，葉綠素a的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高了4.1和3.3倍，葉綠素b的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高了2.9和3.6倍，總?cè)~綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高了3.7、3.1倍；其他3個綠葉品系葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢趨同，在6—7月處于上升趨勢，7—8月逐步下降，葉綠素a主要積累時(shí)間段為6月中上旬，葉綠素b主要積累時(shí)間段為6月下旬。所有品系類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都存在先下降再上升的趨勢，黃葉品系及泰興轉(zhuǎn)折點(diǎn)發(fā)生在6月中旬，綠葉品系發(fā)生在7月初。黃葉品系葉片全綠階段比全黃階段類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都提高了36.2%。

表8 銀杏不同品系葉片葉綠素b的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表9 銀杏不同品系葉片總?cè)~綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表10 銀杏不同品系葉片類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3.6 黃葉品系變色期葉色參數(shù)與葉色素的相關(guān)性

由表11可知，雜交1號黃葉的葉色參數(shù)值都與葉綠素呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，即葉綠素類質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，葉片亮度越低，綠色和藍(lán)色程度越高。3個葉色參數(shù)值與類胡蘿卜素顯著負(fù)相關(guān)，葉片紅/綠的程度參數(shù)值達(dá)到極顯著水平，即類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高也在一定程度上使葉片變暗變綠；雜交2號黃葉品系相關(guān)性分析結(jié)果與雜交1號黃葉類似，但葉片光澤亮度參數(shù)值與葉綠素及類胡蘿卜素含量都不存在相關(guān)性，且黃/藍(lán)的程度參數(shù)值與葉綠素a的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系不明顯；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，葉色參數(shù)都與總?cè)~綠素/類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之比存在極顯著相關(guān)性，總?cè)~綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，葉片亮度越低，綠色和藍(lán)色程度越高，黃色程度越低，葉片整體呈現(xiàn)出綠色。相反，類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，葉片整體呈現(xiàn)黃色。

表11 葉色參數(shù)與葉色素的相關(guān)性

4 結(jié)論與討論

金葉銀杏與普通銀杏的雜交效果理想，播種出苗率較高，后代黃化苗的數(shù)量也能達(dá)到50%以上。銀杏的雜交完全可育，金葉銀杏與普通品種之間的授粉成功率很高，授粉成功率在90%以上。通過對其種核表型觀察發(fā)現(xiàn)，兩種雜交品系屬于梅核類[10-11]，和其他類型種核及普通梅核類相比，其單核種子質(zhì)量偏低，兩種雜交品系種子的質(zhì)量分別為1.55、1.96 g。章承林等[2]對安陸金葉銀杏的研究結(jié)果表明，種子單核質(zhì)量達(dá)到2.5～3.13 g才被判定為種子飽滿且具有生命力。顯然，本雜交試驗(yàn)得到的兩品系種子過小，但通過后期觀察其胚的發(fā)育和發(fā)芽、播種試驗(yàn)證明，質(zhì)量輕并不影響其種子活力。

銀杏種子是屬于高含水量的淀粉型種子，存在典型的生理后熟現(xiàn)象[12]，在其休眠過程中，胚的發(fā)育直接決定后期種子能否正常萌發(fā)[13]。由于種子內(nèi)存在各種物質(zhì)代謝(如糖、蛋白質(zhì)、酶和激素等[14-17])，種子休眠的過程實(shí)際上是胚分化和種子真正成熟的過程。方詩雯[18]根據(jù)種胚長度將銀杏種子后熟過程劃分為5個階段，發(fā)現(xiàn)在不同階段其種子內(nèi)含物及其相關(guān)基因表達(dá)量一直處于不斷變化的過程。因此，在采種之后需要采用一定的貯藏措施來完成種子的生理后熟過程。本試驗(yàn)采取層積的方式進(jìn)行貯藏，在貯藏過程中對胚的變化進(jìn)行觀察，雜交金葉銀杏種子胚的發(fā)育主要集中在9—10月份，12月后胚長不再變化，基本判定種子完成后熟過程。Feng et al.[19]對普通銀杏種子研究發(fā)現(xiàn)，9月中旬才可見種胚，隨后胚迅速增長，分化大約經(jīng)歷1個月，11月后其胚增長緩慢。其動態(tài)過程與本試驗(yàn)結(jié)果完全一致。何青松[20]在研究銀杏胚發(fā)育過程時(shí)，其形態(tài)上的動態(tài)變化也與本試驗(yàn)結(jié)果一致，但不同的是種胚到11月份才開始迅速增長，稍晚于本試驗(yàn)的銀杏種子。經(jīng)過5個月的低溫層積，種胚完成分化，可以清晰地看到胚芽、胚軸、胚根，胚長也增長到4.8～5.6 mm。有關(guān)研究結(jié)果種子的胚長都達(dá)到1 cm左右[21-23]，本試驗(yàn)的兩種雜交金葉銀杏種子的胚長較短。造成這種現(xiàn)象的原因，是品種間存在差異性，雜交金葉銀杏種子偏小，以及貯藏方式不同。高巍等[24]的研究表明，低溫層積處理，胚的長度最短，但發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)都是最高，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。

彩葉植物葉片的呈色原理與花色相同，受本身遺傳基因和環(huán)境因素的共同影響，一般通過改變色素的種類、含量及分布區(qū)域來控制葉色變化[25-26]。葉綠素是植物光合作用吸收光能的主要色素，使葉片呈藍(lán)綠色；類胡蘿卜素呈黃色，性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，且對葉綠素有一定的保護(hù)作用[27]。兩類色素對植物的呈色至關(guān)重要，葉綠素主要影響綠葉植物葉色變化，類胡蘿卜素主要影響黃葉植物葉色變化[28]。通過葉色觀察及相關(guān)色素測定后發(fā)現(xiàn)，在黃葉品系葉片由黃轉(zhuǎn)綠的過程中，其葉綠素和類胡蘿卜素含量都在不斷上升。但葉片呈現(xiàn)黃色主要與葉片內(nèi)總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的比例存在高度極顯著的相關(guān)性，在葉片由黃轉(zhuǎn)綠的變色關(guān)鍵期，葉片內(nèi)總?cè)~綠素比例提高，而類胡蘿卜素占比相對下降，最終導(dǎo)致雜交金葉銀杏完成葉色的轉(zhuǎn)變。該結(jié)論與王改萍[4]、郁萬文[29]等的研究結(jié)果一致。Li et al.[30]從分子的角度研究表明，金葉銀杏與普通綠葉銀杏相比，金葉銀杏葉片類胡蘿卜素基因的相對上調(diào)和葉綠素基因的相對下調(diào)是導(dǎo)致其呈現(xiàn)黃色的原因。

因此，金葉銀杏與普通銀杏的雜交效果理想，播種出苗率較高。但葉色特征的穩(wěn)定性，以及干形的通直情況，還需后期進(jìn)一步逐年觀察統(tǒng)計(jì)。本試驗(yàn)完全證明了金葉銀杏雜交的可行性，這為后期的選育工作打下了良好的基礎(chǔ)。后期可通過改變父本，擴(kuò)大父本種類數(shù)量進(jìn)一步全面開展相關(guān)試驗(yàn)。